本發(fā)明屬于生物工程
技術領域：
，涉及一種用于微生物燃料電池的高產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的基因工程菌的構建及其應用。
背景技術：
：隨著能源短缺和環(huán)境惡化等問題的加劇，廢棄生物質能的開發(fā)和利用受到普遍重視。微生物燃料電池(Microbialfuelcells,MFCs)是利用微生物為陽極催化劑將儲存在有機物(包括廢水中的有機污染物)中的化學能直接轉化為電能的新型裝置，具有能量轉化率高、燃料來源多樣、反應條件溫和、經濟和無污染等優(yōu)點。2004年，美國賓夕法尼亞州立大學的Logan教授研究小組報道了MFCs在產電和污水處理方面的同步應用情況。之后，MFCs以其具有聯(lián)產電能與處理廢水的雙重功效，成為清潔能源生產和廢水資源化處理等領域的研究熱點。但較低的電功率輸出是限制微生物燃料電池實際應用進程的主要瓶頸。MFCs中，微生物能夠氧化各種有機物產生電子并將其傳遞至胞外，再直接或間接地傳遞到電極上產生電流。因此，微生物是影響微生物燃料電池產電性能的核心因素。微生物燃料電池在廢水資源化處理的實際應用中常常會遇到各種不利于微生物生長的環(huán)境條件，例如饑餓條件、酸堿條件、高鹽條件等。因此，獲得高產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的微生物對于提高MFCs的功率密度輸出，推進MFCs在廢水資源化處理方面的實際應用進程具有重要的指導意義。產電微生物常規(guī)的篩選方式有兩種：一是從環(huán)境中分離得到的純培養(yǎng)菌株在電化學系統(tǒng)中驗證其是否具有電化學活性；另一種是直接在電化學系統(tǒng)中富集，然后進行分離和驗證。這種方式在發(fā)現(xiàn)高產電活性微生物時具有隨機性、概率小、工作量大、耗時長等缺點。與常規(guī)篩選方式相比，利用現(xiàn)代分子生物學技術改造菌種具有定向、快速、效果顯著等優(yōu)點，是獲得高效產電微生物的更有效的途徑。其中，提高微生物胞外的電子釋放量(增加胞內電子的產生和減少胞內電子的利用)和強化微生物與電極之間的電子傳遞效率是菌種改造的主要方向。P.aeruginosaPAO1是典型的產電微生物模式菌株，碳源被其吸收后，經過糖酵解途徑轉化生成丙酮酸參與代謝過程，P.aeruginosa中，丙酮酸在乳酸脫氫酶(ldhA)作用下生成D-乳酸(FromKEGG)，該過程消耗NADH，間接導致微生物胞外電子釋放量的減少。因此，該基因的敲除在提高微生物胞外電子釋放量方面表現(xiàn)出潛在的應用價值。大量的文獻已經證明，微生物的產電性能和環(huán)境耐受性能是受到多個基因共同控制、互相影響的復雜表型。IrrE是來源于D.radioduransR1的一個全局調控因子，在菌株DNA損傷修復和輻射抗性中發(fā)揮著重要作用，并對耐輻射異常球菌的整個代謝網絡產生影響。但目前利用該轉錄因子提高微生物產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的改造思路尚未見報道。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種構建同時具備高產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的工程菌的方法和菌株，為微生物燃料電池中銅綠假單胞菌的分子改造研究提供新思路和新方法。本發(fā)明采用的技術方案是：一種高產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的基因工程菌，敲除銅綠假單胞菌PAO1基因組的乳酸脫氫酶基因ldhA，然后導入來源于極端微生物耐輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)的全局調控因子IrrE。而且，構建方法如下：⑴以野生型銅綠假單胞菌PAO1基因組為模板，擴增ldhA在內的1485bpDNA片段，引物增加XmaI、SphI酶切位點；以質粒pBBR1MCS-5為模板擴增慶大抗性基因Gmr，引物增加PstI酶切位點；⑵純化回收ldhA片段，過夜連接T-VectorpMDTM19(simple)，構建質粒pMD19T-ldhA；⑶PstI單酶切pMD19T-ldhA，回收大片段，與Gmr過夜連接，構建質粒pMD19T-ldhA::Gmr；⑷XmaI、SphI雙酶切pMD19T-ldhA::Gmr回收小片段，XmaI、SphI雙酶切pEX100T，回收大片段，過夜連接，構建銅綠假單胞菌敲除質粒pEX100T-ldhA::Gmr；⑸通過接合的方式將敲除質粒pEX100T-ldhA::Gmr轉入銅綠假單胞菌PAO1，根據(jù)敲除菌株帶有慶大霉素抗性而不帶有氨芐抗性，并且不具有蔗糖敏感性篩選出陽性轉化子，進行基因組的PCR驗證，驗證結果符合預期的轉化子即為ldhA敲除菌株ldhA-；⑹以耐輻射異常球菌DeinococcusradioduransR1基因組DNA為模板，擴增出irrE基因，切膠回收irrE基因，酶切純化后與同樣經酶切純化的表達質粒pHERD20T連接，獲得重組表達質粒pHERD20T-irrE；⑺將構建的重組表達質粒pHERD20T-irrE經電轉化導入宿主菌ldhA-感受態(tài)細胞，經200～400μg/mL羧芐青霉素篩選得到陽性轉化子，重提質粒進行PCR、雙酶切和測序分析，，驗證結果符合預期的轉化子即為高產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的基因工程菌。而且，所述基因工程菌株耐受饑餓的時間0～6天；所述基因工程菌株耐受pH的范圍為3.0～11.0；所述基因工程菌株耐受NaCl濃度范圍為2％～6％。而且，菌體制備時的接種量為2％～10％(V/V)；誘導溫度30℃～37℃；誘導時菌體的OD600＝0.8～1.0；誘導劑L-阿拉伯糖濃度0.5％～3.0％；接種MFCs的接種液濃度OD600＝1.0～3.0；用于菌體處理的化學劑有聚乙二醇、氨基三乙酸、青霉素G、CaCl2。高產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的基因工程菌在微生物燃料電池中的應用。而且，應用步驟如下：⑴菌種活化：將基因工程菌ldhA--irrE接種到LB斜面上，于培養(yǎng)箱內過夜靜置培養(yǎng)，從斜面劃取一環(huán)菌體接種于裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加200～400μg/mL羧芐青霉素；⑵誘導培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)液以2％～10％(V/V)的接種量接種到裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃～37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8～1.0時，向含質粒的菌株培養(yǎng)基中添加0.5％～3.0％的L-阿拉伯糖作為誘導劑，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體的對數(shù)期后期，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加200～400μg/mL羧芐青霉素；⑶產電活性檢測：誘導培養(yǎng)液經5000r/min離心5min后收集菌體，菌體經化學劑在37℃、200r/min條件下振蕩處理后，用陽極液重懸制備成OD600≈1.0～3.0的接種液，接入單室空氣陰極MFCs的陽極室，觀察輸出電壓的變化情況，并待系統(tǒng)達到穩(wěn)定后測定功率密度和計算系統(tǒng)內阻；其中，所用陽極液配比L-1為100mMPBS緩沖溶液980mL，緩沖溶液成分為：NH4Cl0.310g、KCl0.130g、Na2HPO4·12H2O4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸餾水1000mL，、維生素溶液10mL、礦物質溶液10mL、檸檬酸鐵1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2，實驗中，含質粒的菌株陽極液中添加200～400μg/mL羧芐青霉素和0.5％～3％的L-阿拉伯糖。而且，步驟(3)中使用的化學劑為聚乙二醇、其中，處理條件為：0～12％聚乙二醇處理0～2h。而且，步驟(3)中使用的化學劑為氨基三乙酸、其中，處理條件為：0～50mM氨基三乙酸處理0～75min。而且，步驟(3)中使用的化學劑為青霉素G和CaCl2，處理條件為：0～100μg/mL青霉素G處理0～90min；0～150mMCaCl2處理0～60min。本發(fā)明具有的有益效果：本發(fā)明采用分子生物學手段敲除銅綠假單胞菌PAO1基因組的乳酸脫氫酶基因ldhA，然后導入來源于極端微生物耐輻射異常球菌(Deinococcusradiodurans)的全局調控因子IrrE。獲得的工程菌株一方面具有明顯提高的產電活性。經過化學劑處理后的菌體接種接種微生物燃料電池后，產生的電壓和功率密度分別比野生型菌株提高了46.76％和53.33％，系統(tǒng)達到穩(wěn)定的時間縮短了28.57％，系統(tǒng)內阻降低了12.66％。另一方面，工程菌株對饑餓條件、高酸堿條件和高鹽條件等環(huán)境脅迫條件的耐受性明顯增強。這種同時具有高產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的基因工程菌的獲得為微生物燃料電池在廢水資源化處理方面的應用提供了重要的實驗材料，其改造思路為高效產電微生物的獲得提供了一種新思想和新方法。附圖說明圖1為銅綠假單胞菌ldhA基因敲除菌株ldhA-基因組PCR驗證圖；其中，M:DL5000DNAMarker；1,3:PAO1基因組中l(wèi)dhA,Gmr基因的PCR驗證；2,4:PAO1基因組中l(wèi)dhA,Gmr基因的PCR驗證.圖2為重組表達質粒pHERD20T-irrE構建流程圖；圖3為重組表達質粒pHERD20T-irrE菌液PCR及雙酶切驗證圖；其中，M:DL10000DNAMarker；1:pHERD20T雙酶切；2:菌液PCR；3:重組質粒雙酶切圖4為基因工程菌株ldhA--irrE中的IrrE蛋白表達圖；其中，M:蛋白Marker；1:野生型菌株全菌蛋白；2:ldhA--irrE菌株全菌蛋白；3:野生型菌株純化后的蛋白；4:ldhA--irrE菌株純化后的蛋白圖5為銅綠假單胞菌在持續(xù)饑餓條件下的存活情況；其中，●：野生型菌株；○：ldhA--irrE菌株；圖6為銅綠假單胞菌對不同環(huán)境脅迫條件的耐受性；其中，野生型菌株ldhA--irrE菌株圖6-1:pH＝3.0；圖6-2:pH＝11.0；圖6-3:2％NaCl；圖6-4:6％NaCl；具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的生物材料的來源說明：1.質粒來源：pHERD20T：購自寶生物工程(大連)有限公司(CHN)，pBBR1MCS-5,pEX100T：本實驗室保存2.耐輻射異常球菌基因組模板來源：自行通過北京莊盟國際生物基因科技有限公司購買的基因組提取試劑盒提取。3.各種限制性內切酶、連接酶：購自寶生物工程(大連)有限公司(CHN)實施例1本實施例說明構建銅綠假單胞菌ldhA基因敲除菌株ldhA-。具體過程包括：1、設計帶有酶切位點的上下游引物ldhA-F：5’TCCCCCCGGGCGGCATGGACGACTACCTGA3’ldhA-R：5’ACATGCATGCTCAGGCCCGGACCCGAT3’GmR-F：5’AACTGCAGATGAACCTGAATCGCCAGCG3’GmR-R：5’AACTGCAGTAGGTGGCGGTACTTGGGTCG3’以野生型銅綠假單胞菌PAO1基因組為模板，擴增ldhA在內的1485bpDNA片段(以下簡稱ldhA)；以質粒pBBR1MCS-5為模板擴增慶大抗性基因Gmr(850bp)，反應體系見表1。表1PCR反應體系PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃30s、64℃30s、72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。3、膠回收ldhA片段，16℃與T-VectorpMDTM19(Simple)過夜連接，熱激法將連接產物導入E.coliJM109，提取質粒pMD19T–ldhA，進行PCR驗證及XmaI、SphI雙酶切驗證，選擇驗證結果符合預期的陽性轉化子測序，測序結果符合預期的即為pMD19T–ldhA。4、PstI單酶切pMD19T-ldhA，回收大片段，16℃與Gmr過夜連接，熱激法將連接產物導入E.coliJM109，提取質粒pMD19T-ldhA::Gmr，進行PCR驗證及XmaI、SphI雙酶切驗證，選擇驗證結果符合預期的陽性轉化子測序，測序結果符合預期的即為pMD19T-ldhA::Gmr。5、XmaI、SphI雙酶切pMD19T-ldhA::Gmr回收小片段，XmaI、SphI雙酶切pEX100T，回收大片段，16℃過夜連接，熱激法將連接產物導入E.coliS17-1，提取質粒pEX100T-ldhA::Gmr，進行PCR驗證及XmaI、SphI雙酶切驗證，結果符合預期的即為銅綠假單胞菌敲除質粒pEX100T-ldhA::Gmr。6、通過接合的方式將敲除質粒pEX100T-ldhA::Gmr轉入銅綠假單胞菌PAO1，根據(jù)敲除菌株帶有慶大霉素抗性而不帶有氨芐抗性，并且不具有蔗糖敏感性篩選出陽性轉化子，進行基因組PCR驗證，驗證結果符合預期的轉化子(如圖1所示)，即為ldhA敲除菌株(簡稱ldhA-)。實施例2本實施例說明構建重組表達質粒pHERD20T-irrE。具體過程包括：1、設計合成帶有酶切位點的上下游引物(下游引物帶有his標簽)上游引物irrE-F：5’-CCGGAATTCGTGCCCAGTGCCAACGTCAG-3’下游引物irrE-R：5’-CCCAAGCTTGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTGTGCAGCGTCCTGC-3’2、以耐輻射異常球菌DeinococcusradioduransR1基因組為模板，PCR擴增目的片段，反應體系見表2。表2PCR反應體系PCR擴增條件為：94℃預變性5min；94℃30s、58℃30s、72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。PCR產物經1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收大小為982bp的片段，通過HindIII和EcoRI進行雙酶切，純化，將回收目的片段與同樣通過HindIII和EcoRI雙酶切后純化回收的載體pHERD20T連接(如圖2所示)，然后通過熱激法將重組表達質粒pHERD20T-irrE導入大腸桿菌中，涂布于含有300μg/mL羧芐青霉素的LB平板上，37℃過夜靜置培養(yǎng)，挑取轉化子進行PCR驗證及雙酶切驗證，選擇驗證結果符合預期的陽性轉化子測序，測序結果符合預期的即為重組表達質粒pHERD20T-irrE。實施例3本實施例說明構建基因工程菌株ldhA--irrE，具體過程包括：重提測序正確的pHERD20T-irrE，通過電擊轉化法導入銅綠假單胞菌ldhA敲除菌株感受態(tài)細胞中，之后涂布于含有300μg/mL羧芐青霉素的LB平板上37℃過夜靜置培養(yǎng)，挑取陽性轉化子進行基因水平驗證(PCR和雙酶切)，選取基因水平驗證正確的轉化子收集菌體，經超聲破碎、His-tag蛋白純化后得到蛋白樣品，加入蛋白上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳，進行蛋白水平驗證(如圖4所示)，驗證符合預期的即為銅綠假單胞菌基因工程菌株ldhA--irrE。實施例4本實施例說明構建成功的基因工程菌ldhA--irrE與野生型菌株產電能力比較。具體過程包括：1、菌種活化：將基因工程菌ldhA--irrE接種到LB斜面上，于培養(yǎng)箱內過夜靜置培養(yǎng)，從斜面劃取一環(huán)菌體接種于裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加300μg/mL羧芐青霉素。2、誘導培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)液以4％的接種量接種到裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8時，向含質粒的菌株培養(yǎng)基中添加1.0％L-阿拉伯糖作為誘導劑，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體生長對數(shù)期的后期。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加300μg/mL羧芐青霉素。3、產電：上述培養(yǎng)液經5000r/min離心5min收集的菌體，菌體經100mMCaCl2溶液，在37℃、200r/min條件下振蕩處理30min。懸浮液經5000r/min離心5min重新收集菌體，用陽極液重懸后制備成OD600≈1.0的接種液，接入單室空氣陰極MFCs的陽極室，觀察輸出電壓的變化情況并待系統(tǒng)達到穩(wěn)定后測定功率密度和計算系統(tǒng)內阻。其中，所用陽極液配比(L-1)為100mMPBS緩沖溶液(NH4Cl0.310g、KCl0.130g、Na2HPO4·12H2O4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸餾水1000mL)980mL、維生素溶液10mL(0.22μm的濾膜過濾滅菌后加入)、礦物質溶液10mL、檸檬酸鐵1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。實驗中，含質粒的菌株陽極液中添加終濃度為300μg/mL的羧芐青霉素和1％L-阿拉伯糖作為誘導劑。由表3可知，基因工程菌接種的MFCs產生的電壓和功率密度分別比野生型菌株提高了70％和78.57％，系統(tǒng)達到穩(wěn)定的時間縮短了20％，系統(tǒng)內阻降低了16.96％。表3野生型菌株基因工程菌株MFCs產電性能對比菌株電壓(mV)功率密度(mW/m2)穩(wěn)定時間(h)內阻(Ω)P.aeruginosaPAO1200.0050.40250602.34ldhA--irrE340.0090.00200500.20注：此產電結果所用電阻為1000Ω。實驗證明，通過本發(fā)明的基因工程菌的構建方法，構建得到的銅綠假單胞菌基因工程菌株ldhA--irrE較野生型菌株產電性能大幅提高。實施例5本實施例說明構建成功的基因工程菌ldhA--irrE與野生型菌株產電能力比較。具體過程包括：1、菌種活化：將基因工程菌ldhA--irrE接種到LB斜面上，于培養(yǎng)箱內過夜靜置培養(yǎng)，從斜面劃取一環(huán)菌體接種于裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加300μg/mL羧芐青霉素。2、誘導培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)液以8％的接種量接種到裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，34℃振蕩培養(yǎng)至OD600為1.0時，向含質粒的菌株培養(yǎng)基中添加2.5％L-阿拉伯糖作為誘導劑，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體生長對數(shù)期的中期。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加300μg/mL羧芐青霉素。3、產電：上述培養(yǎng)液經5000r/min離心5min收集的菌體，菌體經70μg/mL的青霉素G，在37℃、200r/min條件下振蕩處理1h。懸浮液經5000r/min離心5min收集菌體，用陽極液重懸后制備成OD600≈2.5的接種液，接入單室空氣陰極MFCs的陽極室，觀察輸出電壓的變化情況并待系統(tǒng)達到穩(wěn)定后測定功率密度和計算系統(tǒng)內阻。其中，所用陽極液配比(L-1)為100mMPBS緩沖溶液(NH4Cl0.310g、KCl0.130g、Na2HPO4·12H2O4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸餾水1000mL)980mL、維生素溶液10mL(0.22μm的濾膜過濾滅菌后加入)、礦物質溶液10mL、檸檬酸鐵1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。實驗中，含質粒的菌株陽極液中添加300μg/mL羧芐青霉素和1％L-阿拉伯糖。由表4可知，基因工程菌接種的MFCs產生的電壓和功率密度分別比野生型菌株提高了62.27％和51.73％，系統(tǒng)達到穩(wěn)定的時間縮短了20％，系統(tǒng)內阻降低了15.32％。表4野生型菌株基因工程菌株MFCs產電性能對比菌株電壓(mV)功率密度(mW/m2)穩(wěn)定時間(h)內阻(Ω)P.aeruginosaPAO122066.5225562.14ldhA--irrE357100.9180476.00注：此產電結果所用電阻為1000Ω。實驗證明，通過本發(fā)明的基因工程菌的構建方法，構建得到的銅綠假單胞菌基因工程菌株ldhA--irrE較野生型菌株產電性能大幅提高。實施例6本實施例說明構建成功的基因工程菌ldhA--irrE與野生型菌株產電能力比較。具體過程包括：1、菌種活化：將基因工程菌ldhA--irrE接種到LB斜面上，于培養(yǎng)箱內過夜靜置培養(yǎng)，從斜面劃取一環(huán)菌體接種于裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加300μg/mL羧芐青霉素。2、誘導培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)液以6％的接種量接種到裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.9時，向含質粒的菌株培養(yǎng)基中添加3.0％L-阿拉伯糖作為誘導劑，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體生長對數(shù)期的后期。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加300μg/mL羧芐青霉素。3、產電：上述培養(yǎng)液經5000r/min離心5min收集菌體，菌體經30mM氨基三乙酸，在37℃、200r/min條件下振蕩處理30min。懸浮液經5000r/min離心5min重新收集菌體，用陽極液重懸后制備成OD600≈2.0的接種液，接入單室空氣陰極MFCs的陽極室，觀察輸出電壓的變化情況并待系統(tǒng)達到穩(wěn)定后測定功率密度和計算系統(tǒng)內阻。其中，所用陽極液配比(L-1)為100mMPBS緩沖溶液(NH4Cl0.310g、KCl0.130g、Na2HPO4·12H2O4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸餾水1000mL)980mL、維生素溶液10mL(0.22μm的濾膜過濾滅菌后加入)、礦物質溶液10mL、檸檬酸鐵1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。實驗中，含質粒的菌株陽極液中添加300μg/mL羧芐青霉素和1％L-阿拉伯糖。由表5可知，基因工程菌接種的MFCs產生的電壓和功率密度分別比野生型菌株提高了42.19％和49.91％，系統(tǒng)達到穩(wěn)定的時間縮短了21％，系統(tǒng)內阻降低了16.85％。表5野生型菌株基因工程菌株MFCs產電性能對比菌株電壓(mV)功率密度(mW/m2)穩(wěn)定時間(h)內阻(Ω)P.aeruginosaPAO1320108.6200520.31ldhA--irrE455162.8158432.66注：此產電結果所用電阻為1000Ω。實驗證明，通過本發(fā)明的基因工程菌的構建方法，構建得到的銅綠假單胞菌基因工程菌株ldhA--irrE較野生型菌株產電性能大幅提高。實施例7本實施例說明構建成功的基因工程菌ldhA--irrE與野生型菌株產電能力比較。具體過程包括：1、菌種活化：將基因工程菌ldhA--irrE接種到LB斜面上，于培養(yǎng)箱內過夜靜置培養(yǎng)，從斜面劃取一環(huán)菌體接種于裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加300μg/mL羧芐青霉素。2、誘導培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)液以10％的接種量接種到裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為1.0時，向含質粒的菌株培養(yǎng)基中添加1％L-阿拉伯糖作為誘導劑，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體生長對數(shù)期的后期。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加300μg/mL羧芐青霉素。3、產電：上述培養(yǎng)液經5000r/min離心5min收集菌體，菌體經8％聚乙二醇，在37℃、200r/min條件下振蕩處理50min，懸浮液經5000r/min離心5min重新收集菌體，用陽極液重懸后制備成OD600≈3.0的接種液，接入單室空氣陰極MFCs的陽極室，觀察輸出電壓的變化情況并待系統(tǒng)達到穩(wěn)定后測定功率密度和計算系統(tǒng)內阻。其中，所用陽極液配比(L-1)為100mMPBS緩沖溶液(NH4Cl0.310g、KCl0.130g、Na2HPO4·12H2O4.576g、NaH2PO4·2H2O2.452g，蒸餾水1000mL)980mL、維生素溶液10mL(0.22μm的濾膜過濾滅菌后加入)、礦物質溶液10mL、檸檬酸鐵1g、葡萄糖1g，pH＝7.0～7.2。實驗中，含質粒的菌株陽極液中添加300μg/mL羧芐青霉素和1％L-阿拉伯糖。由表6可知，基因工程菌接種的MFCs產生的電壓和功率密度分別比野生型菌株提高了46.76％和53.33％，系統(tǒng)達到穩(wěn)定的時間縮短了28.57％，系統(tǒng)內阻降低了12.66％。表6野生型菌株基因工程菌株MFCs產電性能對比菌株電壓(mV)功率密度(mW/m2)穩(wěn)定時間(h)內阻(Ω)P.aeruginosaPAO1370135182481.27ldhA--irrE543207130420.32注：此產電結果所用電阻為1000Ω。實驗證明，通過本發(fā)明的基因工程菌的構建方法，構建得到的銅綠假單胞菌基因工程菌株ldhA--irrE較野生型菌株產電性能大幅提高。實施例8本實施例說明構建成功的基因工程菌ldhA--irrE與野生型菌株環(huán)境脅迫耐受能力分析，具體過程包括：1.菌種活化：將基因工程菌ldhA--irrE接種到LB斜面上，于培養(yǎng)箱內過夜靜置培養(yǎng)，從斜面劃取一環(huán)菌體接種于裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的試管中，37℃過夜振蕩培養(yǎng)。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加終濃度為300μg/mL的300μg/mL羧芐青霉素。2.誘導培養(yǎng)：將1所述培養(yǎng)液以2％的接種量接種到裝有50mLLB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.8時，向含質粒的菌株培養(yǎng)基中添加1％L-阿拉伯糖作為誘導劑，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至菌體生長對數(shù)期的后期(饑餓條件耐受能力檢測實驗培養(yǎng)至穩(wěn)定期)。實驗中，含質粒的菌株培養(yǎng)基中需要添加終濃度為300μg/mL的羧芐青霉素。3.耐饑餓能力檢測：取誘導培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期的培養(yǎng)液1mL，梯度稀釋至適當濃度涂布LB平板，活菌計數(shù)(此時定義為耐饑餓第0天)，37℃200r/min繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，每隔一定時間取樣測定菌體存活率。4.耐酸堿能力檢測：誘導培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的培養(yǎng)液經5000r/min離心5min，收集的菌體用PBS(KH2PO413.6g、NaOH2.8g、蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2)充分洗滌3次，并重懸于等體積的pH值分別為3.0和11.0的以葡萄糖為唯一碳源的基本無機鹽培養(yǎng)基中，每隔一定時間取樣測定存活率。5.耐鹽能力檢測：誘導培養(yǎng)至對數(shù)生長期后期的培養(yǎng)液經5000r/min離心5min，收集的菌體用PBS(KH2PO413.6g、NaOH2.8g、蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2)充分洗滌3次，并重懸于等體積分別含有2％和6％的NaCl的以葡萄糖為唯一碳源的基本無機鹽培養(yǎng)基中，每隔一定時間取樣測定菌體存活率。實驗結果如圖5、圖6所示，基因工程菌株在饑餓條件、高酸堿條件、高鹽條件下的存活率較野生型菌株均提高1倍。證明通過本發(fā)明的基因工程菌的構建方法，構建得到的銅綠假單胞菌基因工程菌株ldhA--irrE較野生型菌株環(huán)境脅迫耐受能力大幅提高。SEQUENCELISTING<110>天津科技大學<120>高產電活性和環(huán)境脅迫耐受性的基因工程菌<130>2016-12-02<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>30<212>DNA<213>ldhA-F<400>1tccccccgggcggcatggacgactacctga30<210>2<211>27<212>DNA<213>ldhA-R<400>2acatgcatgctcaggcccggacccgat27<210>3<211>28<212>DNA<213>GmR-F<400>3aactgcagatgaacctgaatcgccagcg28<210>4<211>29<212>DNA<213>GmR-R<400>4aactgcagtaggtggcggtacttgggtcg29<210>5<211>29<212>DNA<213>上游引物irrE-F<400>5ccggaattcgtgcccagtgccaacgtcag29<210>6<211>43<212>DNA<213>下游引物irrE-R<400>6cccaagcttgtggtggtggtggtggtgctgtgcagcgtcctgc43當前第1頁1 2 3