本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)L-異亮氨酸的基因工程菌，其構(gòu)建方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
L-異亮氨酸，又稱(chēng)L-異白氨酸，化學(xué)名為L(zhǎng)-α-氨基-β-甲基戊酸，屬于天冬氨酸族非極性、輸水性氨基酸的一種。L-異亮氨酸作為人體必需的8種氨基酸之一，是合成人體激素、酶類(lèi)的原料，具有促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和抑制分解的效果，成年人每天需要從外界攝取20mg/kg(體重)的L-異亮氨酸。因此，L-異亮氨酸在食品、醫(yī)藥、飼料和運(yùn)動(dòng)保健領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用及商業(yè)價(jià)值。
由于L-異亮氨酸具有2個(gè)不對(duì)稱(chēng)碳原子，所以用化學(xué)合成方法生產(chǎn)比較困難，成本很高。生物轉(zhuǎn)化法制造L-異亮氨酸是將α氨基丁酸和α-氧代丁酸等作為前體原料進(jìn)行生物合成，但由于原料昂貴，同樣存在生產(chǎn)成本過(guò)高的問(wèn)題。因此，通過(guò)微生物發(fā)酵來(lái)生產(chǎn)L-異亮氨酸是一種必然的發(fā)展趨勢(shì)。
CN 105176907 A公布了一株通過(guò)重組大腸桿菌構(gòu)建的L-異亮氨酸基因工程菌，通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸，最終產(chǎn)量為16.05±0.16g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)40.78％。
CN 104480057 A構(gòu)建了alr基因缺陷的谷氨酸棒桿菌宿主菌，再將fusA、frr、ilvBN、ilvA、ppnk等基因連接到過(guò)表達(dá)載體，然后電轉(zhuǎn)入alr缺陷的宿主菌中，獲得一株谷氨酸棒桿菌基因工程菌，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸，產(chǎn)量達(dá)到28.6g/L。
CN 105886431 A公布了一株誘變篩選得到的谷氨酸棒桿菌菌株，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸，產(chǎn)量為28g/L。
CN 104212756 A公布了一株過(guò)表達(dá)fusA基因的谷氨酸棒桿菌基因工程菌，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-異亮氨酸為8.7g/L。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一株高產(chǎn)L-異亮氨酸的基因工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)篩選得到的谷氨酸棒桿菌突變菌株Corynebacterium glutamicum H5的代謝特點(diǎn)，利用基因工程技術(shù)來(lái)改造其基因組，通過(guò)敲除或者插入相關(guān)基因，減弱代謝支路的雜酸如丙氨酸、纈氨酸等的合成；增加L-異亮氨酸的前體如天冬氨酸及蘇氨酸的合成，促進(jìn)碳通量更多流向L-異亮氨酸合成途徑，使其在發(fā)酵過(guò)程中能大幅提高產(chǎn)L-異亮氨酸的能力，從而降低生產(chǎn)成本，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
一株高產(chǎn)L-異亮氨酸的基因工程菌，命名為C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC，其分類(lèi)為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，該基因工程菌是將谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)H5菌株敲除了編碼精氨基琥珀酸合成酶的argG基因及編碼氨基轉(zhuǎn)移酶的alaT基因，且在alaT基因被敲除的位點(diǎn)插入了編碼乙酰羥酸還原異構(gòu)酶的ilvC基因的操縱子。
其構(gòu)建方法包括以下步驟：
(1)出發(fā)菌株是本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的突變菌株，命名為Corynebacterium glutamicum H5，其分類(lèi)為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)，屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。
(2)利用EcoRI/SalI雙酶切載體pk18mobsacB，回收5.6kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增argG基因上游1.22kb的核苷酸片段argG-L、及下游1.31kb的核苷酸片段argG-R，通過(guò)GIBSON連接上述3個(gè)片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒argG-pk18mobsacB，該質(zhì)粒即argG基因的敲除載體。其中，擴(kuò)增argG-L、argG-R上下游片段所用的引物為：
argG-L-FP:5‘-CTATGACATGATTACGAATTCGTGCCACTGGTGAACTCCTTG-3’
argG-L-RP:5‘-TGAAAAGGTGGCTTATGCATGTGTTGAAAGGGTTGGTATT-3’
argG-R-FP:5‘-AACCCTTTCAACACATGCATAAGCCACCTTTTCAAGCATC-3’
argG-R-RP:5‘-AGGTCGACTCTAGAGGATCCTTCTTCATCAGTGAGATCGA-3’
(3)將步驟(2)中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟(1)中所述出發(fā)菌株Corynebacterium glutamicum H5，通過(guò)同源重組獲得argG基因缺陷的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargG。
(4)繼續(xù)利用EcoRI/SalI雙酶切載體pk18mobsacB，回收5.6kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因組為模板，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增alaT基因上游1.42kb的核苷酸片段alaT-L、及下游1.51kb的核苷酸片段alaT-R，通過(guò)GIBSON連接上述3個(gè)片段，構(gòu)建包含alaT基因上下游片段的重組質(zhì)粒alaT-pk18mobsacB，該質(zhì)粒即alaT基因的敲除載體。其中，擴(kuò)增alaT上下游片段的引物為：
alaT-L-FP:5‘-ATGACATGATTACGAATTCGCCACTTTGGACTAATCAATAT-3’
alaT-L-RP:5‘-ATGCGGCCGCTTTTATGCATTGGAAGGTTGGCGATCATG-3’
alaT-R-FP:5‘-CAATGCATAAAAGCGGCCGCATCTCCTTTGCATCACATAC-3’
alaT-R-RP:5‘-TTGCATGCCTGCAGGTCGACCGGTGTTTCCACCATGCGG-3’
(5)將將步驟(4)中的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化步驟(3)中所述的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargG，通過(guò)同源重組獲得alaT基因缺陷的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT。
(6)利用NsiI/NotI雙酶切載體alaT-pk18mobsacB，回收8.7kb核苷酸片段；以Corynebacterium glutamicum H5基因組為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增ilvC基因片段；以大腸桿菌表達(dá)載體PVB220為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PlacUV5啟動(dòng)子片段；以大腸-谷氨酸棒桿菌穿梭載體PXMJ19為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增終止子rrnB片段；通過(guò)GIBSON連接上述4個(gè)片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒ilvC-alaT-pk18mobsacB，該質(zhì)粒即為ilvC操縱子的插入載體。其中，ilvC操縱子包括PlacUV5啟動(dòng)子、ilvC基因及rrnB終止子3個(gè)片段。擴(kuò)增3個(gè)片段所用的引物為：
placUV5 FP:5‘-TCGCCAACCTTCCAATGCATGTAGAGGATCGAGATCTCCA-3’
placUV5 RP:5‘-TAAAGCAGTTCAATAGCCATATGGCTGCTGCCCATGGAAT-3’
ilvC FP:5‘-ATTCCATGGGCAGCAGCCATATGGCTATTGAACTGCTTTA-3’
ilvC RP:5‘-tctcatccgccaaaacagccTTAAGCGGTTTCTGCGCGAG-3’
rrnB FP:5‘-CTCGCGCAGAAACCGCTTAAggctgttttggcggatgaga-3’
rrnB RP:5‘-TGCAAAGGAGATGCGGCCGCagagtttgtagaaacgcaaa-3’
(7)將步驟(6)中的插入載體轉(zhuǎn)化步驟(5)中所述的工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT，通過(guò)同源重組獲得在alaT基因被敲除的位點(diǎn)插入了ilvC操縱子的基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC。
所述的基因工程菌的應(yīng)用，在于通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-異亮氨酸，其方法為：將基因工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC活化后轉(zhuǎn)接種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，種液再轉(zhuǎn)接至5L發(fā)酵罐直接發(fā)酵，最終L-異亮氨酸產(chǎn)量為48g/L。
所述活化培養(yǎng)基配方為：玉米漿5％、胰蛋白胨1％、氯化鈉0.5％、硫酸銨0.4％、葡萄糖0.3％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、丙氨酸0.004％、瓊脂粉2％，余量為去離子水，PH為7，均為重量百分比。
所述種子培養(yǎng)基配方為：葡萄糖3％、硫酸銨2.5％、玉米漿3.5％、酵母膏0.3％、絲肽粉0.3％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、維生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸鐵0.00001％、碳酸鈣4％、丙氨酸0.004％、余量為去離子水，PH為7，均為重量百分比。
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖16％、硫酸銨0.8％、玉米漿3.5％、酵母膏0.3％、絲肽粉0.3％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、維生素B10.00003％、生物素0.00002％、硫酸鐵0.00001％、丙氨酸0.004％，余量為去離子水，PH為7，均為重量百分比。
本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明根據(jù)谷氨酸棒桿菌突變菌株Corynebacterium glutamicum H5的代謝特點(diǎn)，利用基因工程技術(shù)來(lái)改造H5的基因組，通過(guò)敲除或者插入相關(guān)基因，減弱代謝支路的雜酸如丙氨酸、纈氨酸等的合成、增加L-異亮氨酸的前體如天冬氨酸及蘇氨酸的合成，促進(jìn)碳通量更多流向L-異亮氨酸合成途徑，使其在發(fā)酵過(guò)程中能大幅提高產(chǎn)L-異亮氨酸的能力，L-異亮氨酸的產(chǎn)酸率相對(duì)出發(fā)菌株提高了2.18倍，在5L發(fā)酵罐中，L-異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)48g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)18％以上，大幅降低了生產(chǎn)成本，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。
實(shí)施例1突變菌株H5的獲得
1.1材料與試劑
谷氨酸棒桿菌ATCC13032，為廣泛應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)菌株，購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司；
硫酸二乙酯(EDS)，購(gòu)自武漢申試化工；蛋白胨、酵母、玉米漿等購(gòu)自Biosharp公司；丙氨酸、磺胺胍、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸鹽酸鹽、α-氨基丁酸、DL-α-氨基-β-羥基戊酸等均購(gòu)自sigma公司；其余化學(xué)藥品試劑均為國(guó)藥分析純。
1.2制備出發(fā)型菌株
以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發(fā)菌株，在LBG固體培養(yǎng)基上活化，31℃培養(yǎng)12h；
從斜面接種一環(huán)菌體到30mlLBG培養(yǎng)基中，31℃、200rpm，培養(yǎng)12h；取菌液1ml，12000rpm離心2min，棄上清，用生理鹽水對(duì)細(xì)胞進(jìn)行洗滌3次，用PH7.0的磷酸緩沖液重懸菌體，制成10-3-10-7倍的菌懸液備用。
LBG培養(yǎng)基配方為：蛋白胨1.0％、酵母0.5％、氯化鈉1.0％、葡萄糖0.5％，余量為去離子水，PH為6.5-7.0。
1.3EDS誘變篩選
取2-10ml菌懸液，加入過(guò)無(wú)菌瓶中，加入1％(V/V)硫酸二乙酯，反應(yīng)0.5-1h；用無(wú)菌水稀釋103倍，涂布于含有磺胺胍、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸鹽酸鹽、α-氨基丁酸、DL-α-氨基-β-羥基戊酸等L-異亮氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的抗性篩選培養(yǎng)基上，31℃，培養(yǎng)6-48h待單菌落長(zhǎng)出；
單菌落轉(zhuǎn)接10ml發(fā)酵培養(yǎng)基，31℃，200rpm振蕩培養(yǎng)72h，HPLC檢測(cè)各單菌落發(fā)酵得到的L-異亮氨酸產(chǎn)量，其中，出發(fā)菌株ATCC13032產(chǎn)L-異亮氨酸小于0.02g/L，突變株H5產(chǎn)L-異亮氨酸為22g/L。將該突變菌株命名為Corynebacterium glutamicum H5，并于2016年11月1日保藏于位于湖北省武漢市武漢大學(xué)內(nèi)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2016609。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖24.0％、硫酸銨0.8％、玉米漿3.5％、酵母膏0.3％、磷酸氫二鉀0.12％、硫酸鎂0.05％、維生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸鐵0.00001％、丙氨酸0.004％，余量為去離子水，PH為7。
實(shí)施例2基因工程菌C.glutamicumH5ΔargG的構(gòu)建
2.1實(shí)驗(yàn)材料與試劑
質(zhì)粒pk18mobsacB、大腸桿菌DH5α均為商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)；
DNA聚合酶(KOD DNA Polymerase)購(gòu)自toyobo東洋紡(上海)生物科技有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶(EcoRI、SalI、NsiI、NotI)、DNAmarker、質(zhì)粒小提取試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒，均購(gòu)自takara寶生物工程(大連)有限公司；Gibson克隆重組試劑盒購(gòu)自NEB北京公司；硫酸卡那霉素購(gòu)自Biosharp公司；蔗糖等其余化學(xué)藥品試劑均為國(guó)藥分析純。
2.2敲除載體argG-pk18mobsacB的構(gòu)建
利用EcoRI/SalI雙酶切載體pk18mobsacB，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒1ug、10×buffer 5ul、BamHI 1ul、EcoRI 1ul、補(bǔ)水至50ul，37℃酶切5h。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并DNA膠回收純化試劑盒回收5.6kb核苷酸片段；
甘油保存的菌株Corynebacterium glutamicum H5接種至1-4ml的LBG液體培養(yǎng)基中，31℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16h；取1-4ml的菌液，10,000rpm離心2分鐘，棄上清；濕菌體用天根基因組提取試劑盒抽提基因組DNA。
以Corynebacterium glutamicum H5基因組為模板，設(shè)計(jì)argG基因上下游片段argG-L(SEQ ID NO:1所示)、argG-R(SEQ ID NO:2所示)的引物：
argG-L-FP:5‘-CTATGACATGATTACGAATTCGTGCCACTGGTGAACTCCTTG-3’
argG-L-RP:5‘-TGAAAAGGTGGCTTATGCATGTGTTGAAAGGGTTGGTATT-3’
argG-R-FP:5‘-AACCCTTTCAACACATGCATAAGCCACCTTTTCAAGCATC-3’
argG-R-RP:5‘-AGGTCGACTCTAGAGGATCCTTCTTCATCAGTGAGATCGA-3’
高保真KOD聚合酶PCR擴(kuò)增1.22kb的核苷酸片段argG-L、及1.31kb的核苷酸argG-R。PCR反應(yīng)體系(50ul)為：5×PCR buffer 10μl、dNTP5μl、引物各1.5μl、模板1μl、KOD酶1μl、加水至50μl。反應(yīng)條件為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，68℃2min，30個(gè)循環(huán)；68℃10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)且DNA膠回收純化試劑盒回收1.1kb的2個(gè)PCR產(chǎn)物。
Gibson克隆重組試劑盒重組上述雙酶切產(chǎn)物及兩個(gè)PCR產(chǎn)物，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，經(jīng)過(guò)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選轉(zhuǎn)化子送武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子即含有重組質(zhì)粒argG-pk18mobsacB。
2.3Corynebacterium glutamicum H5基因組敲除argG基因
將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接3mlLB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16h，取1-4ml的菌液，10,000rpm離心2分鐘，棄上清；濕菌體用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株Corynebacterium glutamicum H5中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含硫酸卡那霉素的LBHIS固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48h至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，挑選轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接3mlLB培養(yǎng)基，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)24h，菌液稀釋涂布于含10％蔗糖的平板，30℃培養(yǎng)48h至長(zhǎng)出單菌落，挑選單菌落分別接種于含硫酸卡那霉素的平板及含10％蔗糖的平板，挑選在10％的蔗糖平板上生長(zhǎng)而在硫酸卡那霉素平板上不生長(zhǎng)的單菌落送測(cè)序，測(cè)序正確的單菌落即為argG基因缺陷的工程菌C.glutamicum H5ΔargG。
LBHIS培養(yǎng)基配方為：蛋白胨1％、酵母0.5％、氯化鈉1％、腦心津液2％、山梨醇4％、瓊脂粉2％、硫酸卡那霉素100ug/ml、余量為去離子水，PH為7。
10％蔗糖培養(yǎng)基配方為：蛋白胨1％、酵母0.5％、氯化鈉1％、葡萄糖0.5％、蔗糖10％、余量為去離子水，PH為7。
實(shí)施例3基因工程菌C.glutamicumH5ΔargGΔalaT的構(gòu)建
3.1敲除載體alaT-pk18mobsacB的構(gòu)建
利用EcoRI/SalI雙酶切載體pk18mobsacB，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒1ug、10×buffer 5ul、BamHI 1ul、EcoRI 1ul、補(bǔ)水至50ul，37℃酶切5h。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并DNA膠回收純化試劑盒回收5.6kb核苷酸片段；
甘油保存的菌株Corynebacterium glutamicum H5接種至1-4ml的LBG液體培養(yǎng)基中，31℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16h；取1-4ml的菌液，10,000rpm離心2分鐘，棄上清；濕菌體用天根基因組提取試劑盒抽提基因組DNA。
以Corynebacterium glutamicum H5基因組為模板，設(shè)計(jì)alaT基因上下游片段alaT-L(SEQ ID NO:3所示)、alaT-R(SEQ ID NO:4所示)的引物：
alaT-L-FP:5‘-ATGACATGATTACGAATTCGCCACTTTGGACTAATCAATAT-3’
alaT-L-RP:5‘-ATGCGGCCGCTTTTATGCATTGGAAGGTTGGCGATCATG-3’
alaT-R-FP:5‘-CAATGCATAAAAGCGGCCGCATCTCCTTTGCATCACATAC-3’
alaT-R-RP:5‘-TTGCATGCCTGCAGGTCGACCGGTGTTTCCACCATGCGG-3’
高保真KOD聚合酶PCR擴(kuò)增1.42kb的核苷酸片段alaT-L、及1.51kb的核苷酸片段alaT-R。PCR反應(yīng)體系(50ul)為：5×PCR buffer 10μl、dNTP 5μl、引物各1.5μl、模板1μl、KOD酶1μl、加水至50μl。反應(yīng)條件為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，68℃2min，30個(gè)循環(huán)；68℃10min。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)且DNA膠回收純化試劑盒回收1.5kb的2個(gè)PCR產(chǎn)物。
Gibson克隆重組試劑盒重組上述雙酶切產(chǎn)物及兩個(gè)PCR產(chǎn)物，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，經(jīng)過(guò)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選轉(zhuǎn)化子送武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子即含有重組質(zhì)粒alaT-pk18mobsacB。
3.2C.glutamicum H5ΔargG基因組敲除alaT基因
將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接3mlLB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16h，取1-4ml的菌液，10,000rpm離心2分鐘，棄上清；濕菌體用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株C.glutamicum H5ΔargG中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含硫酸卡那霉素的LBHIS固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48h至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，挑選轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接3mlLB培養(yǎng)基，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)24h，菌液稀釋涂布于含10％蔗糖的平板，30℃培養(yǎng)48h至長(zhǎng)出單菌落，挑選單菌落分別接種于含硫酸卡那霉素的平板及含10％蔗糖的平板，挑選在10％的蔗糖平板上生長(zhǎng)而在硫酸卡那霉素平板上不生長(zhǎng)的單菌落送測(cè)序，測(cè)序正確的單菌落即為alaT基因缺陷的工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT。
實(shí)施例4工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC的構(gòu)建
4.1實(shí)驗(yàn)材料
質(zhì)粒pk18mobsacB、PVB220、PXMJ19等均為商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)。
4.2插入載體ilvC-alaT-pk18mobsacB的構(gòu)建
利用NsiI/NotI雙酶切載體pk18mobsacB，反應(yīng)體系為：質(zhì)粒1ug、10×buffer 5ul、NsiI 1ul、NotI 1ul、補(bǔ)水至50ul。37℃酶切5h。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并DNA膠回收純化試劑盒回收8.7kb核苷酸片段。
甘油保存的菌株Corynebacterium glutamicum H5接種至1-4ml的LBG液體培養(yǎng)基中，31℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16h；取1-4ml的菌液，10,000rpm離心2分鐘，棄上清；濕菌體用天根基因組提取試劑盒抽提基因組DNA。
以Corynebacterium glutamicum H5基因組為模板，設(shè)計(jì)引物ilvC FP/RP，高保真KOD聚合酶PCR擴(kuò)增ilvC基因片段(SEQ ID NO:6所示)；以大腸桿菌表達(dá)載體PVB220為模板，設(shè)計(jì)引物placUV5FP/RP，高保真KOD聚合酶PCR擴(kuò)增PlacUV5啟動(dòng)子片段(SEQ ID NO:5所示)；以大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭載體PXMJ19為模板，設(shè)計(jì)引物rrnB FP/RP，高保真KOD聚合酶PCR擴(kuò)增終止子rrnB片段(SEQ ID NO:7所示)；PCR反應(yīng)體系(50ul)為：5×PCR buffer 10μl、dNTP 5μl、引物各1.5μl、模板1μl、KOD酶1μl、加水至50μl。反應(yīng)條件為：95℃5min，95℃30s，55℃30s，68℃2min，30個(gè)循環(huán)；68℃10min。擴(kuò)增3個(gè)片段所用的引物分別為：
placUV5FP:5‘-TCGCCAACCTTCCAATGCATGTAGAGGATCGAGATCTCCA-3’
placUV5RP:5‘-TAAAGCAGTTCAATAGCCATATGGCTGCTGCCCATGGAAT-3’
ilvC FP:5‘-ATTCCATGGGCAGCAGCCATATGGCTATTGAACTGCTTTA-3’
ilvC RP:5‘-tctcatccgccaaaacagccTTAAGCGGTTTCTGCGCGAG-3’
rrnB FP:5‘-CTCGCGCAGAAACCGCTTAAggctgttttggcggatgaga-3’
rrnB RP:5‘-TGCAAAGGAGATGCGGCCGCagagtttgtagaaacgcaaa-3’
1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)且DNA膠回收純化試劑盒回收3個(gè)PCR產(chǎn)物。Gibson克隆重組試劑盒重組上述雙酶切產(chǎn)物3個(gè)PCR產(chǎn)物，重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含硫酸卡那霉素的平板，經(jīng)過(guò)37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑選轉(zhuǎn)化子送武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)公司測(cè)序，測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子即含有重組質(zhì)粒ilvC-alaT-pk18mobsacB，該質(zhì)粒中ilvC操縱子包括PlacUV5啟動(dòng)子、ilvC基因及rrnB終止子3個(gè)片段。
4.3C.glutamicum H5ΔargGΔalaT基因組中插入ilvC操縱子
將測(cè)序正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接3mlLB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16h，取1-4ml的菌液，10,000rpm離心2分鐘，棄上清；濕菌體用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株C.glutamicum H5ΔargGΔalaT中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含硫酸卡那霉素的LBHIS固體培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48h至長(zhǎng)出轉(zhuǎn)化子，挑選轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接3mlLB培養(yǎng)基，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)24h，菌液稀釋涂布于含10％蔗糖的平板，30℃培養(yǎng)48h至長(zhǎng)出單菌落，挑選單菌落分別接種于含硫酸卡那霉素的平板及含10％蔗糖的平板，挑選在10％的蔗糖平板上生長(zhǎng)而在硫酸卡那霉素平板上不生長(zhǎng)的單菌落送測(cè)序，測(cè)序正確的單菌落即為工程菌C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC。
實(shí)施例5菌株的培養(yǎng)、發(fā)酵
5.1種子培養(yǎng)
取一支甘油管保存的工程菌菌種C.glutamicum H5ΔargGΔalaT：：ilvC，室溫放置融化，吸取1ml菌液至固態(tài)活化培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，30℃培養(yǎng)16h；從活化培養(yǎng)基上挑一接種環(huán)菌苔轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，30℃、200rpm振蕩培養(yǎng)16h。
活化培養(yǎng)基配方為：玉米漿5％、胰蛋白胨1％、氯化鈉0.5％、硫酸銨0.4％、葡萄糖0.3％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、丙氨酸0.004％、瓊脂粉2％，余量為去離子水，PH為7。
種子培養(yǎng)基培養(yǎng)為：葡萄糖3％、硫酸銨2.5％、玉米漿3.5％、酵母膏0.3％、絲肽粉0.3％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、維生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸鐵0.00001％、碳酸鈣4％、丙氨酸0.004％、余量為去離子水，PH為7。
5.2發(fā)酵培養(yǎng)
按10％的體積比接種種子至3L發(fā)酵培養(yǎng)基中，控溫30℃，氨水控制PH在7.0，通過(guò)調(diào)整轉(zhuǎn)速及通氣量維持溶氧在30％，當(dāng)殘?zhí)呛康陀?.5％時(shí)，流加80％的葡萄糖，維持殘?zhí)呛吭?.5～2.5％，發(fā)酵時(shí)間為65h。最終通過(guò)HPLC檢測(cè)到發(fā)酵液中L-異亮氨酸含量為4.8％。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖16％、硫酸銨0.8％、玉米漿3.5％、酵母膏0.3％、絲肽粉0.3％、磷酸氫二鉀0.1％、硫酸鎂0.05％、維生素B1 0.00003％、生物素0.00002％、硫酸鐵0.00001％、丙氨酸0.004％，余量為去離子水，PH為7。
序列表
<110> 武漢遠(yuǎn)大弘元股份有限公司
<120> 一株高產(chǎn)L-異亮氨酸的基因工程菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
<160> 7
<210> 1
<211> 1220
<212> DNA
<213> 精氨基琥珀酸合成酶上游argG-L核苷酸片段
<400> 1
GTGCCACTGGTGAACTCCTTGTCCGATGATCTGCACCCATGCCAGATTCTGGCTGATCTGCAGACCATCGTGG
AAAACCTCAGCCCTGAAGAAGGCCCAGCAGGCCTTAAGGGTAAGAAGGCTGTGTACCTGGGCGATGGCGACAA
CAACATGGCCAACTCCTACATGATTGGCTTTGCCACCGCGGGCATGGATATCTCCATCATCGCTCCTGAAGGG
TTCCAGCCTCGTGCGGAATTCGTGGAGCGCGCGGAAAAGCGTGGCCAGGAAACCGGCGCGAAGGTTGTTGTCA
CCGACAGCCTCGACGAGGTTGCCGGCGCCGATGTTGTCATCACCGATACCTGGGTATCCATGGGTATGGAAAA
CGACGGCATCGATCGCACCACACCTTTCGTTCCCTACCAGGTCAACGATGAGGTCATGGCGAAAGCTAACGAC
GGCGCCATCTTCCTGCACTGCCTTCCTGCCTACCGCGGCAAAGAAGTGGCAGCCTCCGTGATTGATGGACCAG
CGTCCAAAGTTTTCGATGAAGCAGAAAACCGCCTCCACGCTCAGAAAGCACTGCTGGTGTGGCTGCTGGCCCA
CCAGCCGAGGTAAGACATGTCCCTTGGCTCAACCCCGTCAACACCGGAAAACTTAAATCCCGTGACTCGCACT
GCACGCCAAGCTCTCATTTTGCAGATTTTGGACAAACAAAAAGTCACCAGCCAGGTACAACTGTCTGAATTGC
TGCTGGATGAAGGCATCGATATCACCCAGGCCACCTTGTCCCGAGATCTCGATGAACTCGGTGCACGCAAGGT
TCGCCCCGATGGGGGACGCGCCTACTACGCGGTCGGCCCAGTAGATAGCATCGCCCGCGAAGATCTCCGGGGT
CCGTCGGAGAAGCTGCGCCGCATGCTTGATGAACTGCTGGTTTCTACAGATCATTCCGGCAACATCGCGATGC
TGCGCACCCCGCCGGGAGCTGCCCAGTACCTGGCAAGTTTCATCGATAGGGTGGGGCTGAAAGAAGTCGTTGG
CACCATCGCTGGCGATGACACCGTTTTCGTTCTCGCCCGTGATCCGCTCACAGGTAAAGAACTAGGTGAATTA
CTCAGCGGGCGCACCACTTAAAGCGCCCCTAGTTCAAGGCTTGTTAATCGCTTGTTAATGCAGGCAGGTAAGG
TATAACCCGAGTGTTTTTTCGAGGAATACCAACCCTTTCAACACATGCATAA
<210> 2
<211> 1313
<212> DNA
<213> 精氨基琥珀酸合成酶下游argG-R核苷酸片段
<400> 2
AAGCCACCTTTTCAAGCATCCAGACTAGAACTTCAAGTATTTAGAAAGTAGAAGAACACCACATGGAACAGCA
CGGAACCAATGAAGGTGCGCTGTGGGGCGGCCGCTTCTCCGGTGGACCCTCCGAGGCCATGTTCGCCTTGAGT
GTCTCCACTCATTTCGACTGGGTTTTGGCCCCTTATGATGTGTTGGCCTCCAAGGCACACGCCAAGGTTTTGC
ACCAAGCAGAGCTACTTTCTGATGAAGATCTAGCCACCATGCTGGCTGGGCTTGATCAGCTGGGCAAGGATGT
CGCCGACGGAACCTTCGGTCCGCTGCCTTCTGATGAGGATGTGCACGGCGCGATGGAACGCGGTCTGATTGAC
CGCGTTGGTCCTGAGGTGGGCGGCCGTCTGCGCGCTGGTCGTTCCCGCAATGACCAGGTGGCAACCCTGTTCC
GCATGTGGGTCCGCGACGCAGTGCGCGACATCGCGCTGGGAACAACCGAGCTTGTCGACGCCCTCAGCGCCCA
AGCTAAGGCACATGCAGACGCGATCATGCCAGGCAAGACCCACTTCCAGGCAGCTCAGCCGGTCCTTCTGGCA
CACCAGCTGCTGGCACACGCACAGCCTTTGCTGCGCGATATTGATCGTATCCGTGACCTGGACAAGCGTCTTG
CGGTGTCTCCTTACGGTTCCGGCGCACTTGCTGGTTCCTCTTTGAAGCTCAACCCTGAAGCAATCGCTGAAGA
ACTCGGCTTTGATTCCGCAGCAGATAACTCCATTGATGCCACCAGCTCCCACGATTTCGCATCTGAAACCGCC
TTCGTGCTGGCGCAGCTTGCAGTGGATATGTCCCGCTTGGCTGAAGAAATCATCGCATGGTGCACCCCAGAAT
TTGGTTACATCACCTTGTCTGATTCCTGGTCCACAGGCAGCTCAATCATGCCGCAGAAGAAGAACCCTGACGT
GGCAGAGCTGACCCGTGGCAAGTCTGGTCGCTTGATCGGTAACCTCACCGGTCTGCTGGCTACCCTGAAGGCA
CAGCCTTTAGCGTACAACCGCGACCTGCAGGAAGATAAGGAACCAATCGTAGATTCCGTGGCGCAGCTCAACC
TGCTGCTCCCTGCAATGACTGGTTTGGTTTCCACCTTGACCTTCAACACCGAGCGCATGCGTGAACTTGCACC
AGCAGGTTTCACCCTTGCCACCGACTTGGCTGAGTGGATGGTGCGCCAGGGCGTTCCATTCCGTGAGGCACAC
GAAGCATCCGGCGCTTGCGTGCGGATCGCGGAGTCCAGGGGAGTGGACCTTATCGATCTCACTGATGAAGAA
<210> 3
<211> 1420
<212> DNA
<213> 氨基轉(zhuǎn)移酶上游alaT-L核苷酸片段
<400> 3
GCCACTTTGGACTAATCAATATCTTCACCTGGTTTTTTCTGGAAACCCACACCTCATCCGGTCAGTACCACCT
CGGCACCGTCTTTCATGGCAAGCACAACATTATTGTTGAGCACTCTCAACCCTTTCACCGAAGTGACACCTAC
CTTTATTTCTTAGGATTCCAGGCTTTCGCCATTGGTGGCGATGACGTCGCGGCACCAATCAAAGGACTTCTTC
TTGTAGCGCTTCAAGATTCCTGAGCCGCCGTCGTCGAGGTATTTGATGCGGTAGTCATCGTTTACTGTTGGGC
CGGAGGGTCCGTCGATAAGCACGTCCTTTGCTCCTAGTCCGTTTTCGACGATGAACAGTGGCTTCTGCCAGCG
CTCCCAGTAGTTGTTCAGGACGATGCGCAAACCGAGGGGATCAACTTGCCAACCCCATTCGGAAGCCGCGAGA
GTGGGGCTGACCACTCCGCCGATGATGTTACCGCCACCGGTTGAGTAGTTTTCGGGGTTGTGGGCTTCACATA
CGGACATGTAATAGGAGAAGGAAATGAAATCGACGGTGTTTTTTTAAAATCTCACGGTCTTCATCTGTGATGT
CGATGGTGATACCCTTTCGCGGAATTTGCGCAGCAAGTAGCCTGGGTATTCGCCACGGACGTGAATATCGCCG
AAGGCATAGTCCTCGTGGGACTTTTGCTGGGCGGTAAGTTGATCGCGTGGGTCCGGGGTAATGCCATAACGAG
GAACGGCAATAATCATGCAACCGATCTGGTTTTGTGGGTCGATCTCATGAGCAATCTTAGTTGCCAAAGCACT
TGCTACTCAATCATGGTAAACAGCCTGGTCGCAGTCCTTCACGATTCAAACTTTGCCTTCCGCTACGCCTTCC
ACCTGATCATCATAGAAGACGGTGAAGTAACAGCAGCCGGAGATCCCACAGAGATCGTCACTGCGGGACTGAT
CGAAGAAGTCTACAACGTCAAAGCCTGTGCATCCCAGACCCCGTGAACAGCAAACCGATGATCGTGCCACTGG
AAAGATCTTAGGCAGCCGTGGGATTACACCCTTTTAGAGTTAGAACAGTAAAAATTCGCCCAATAGCTTTCAA
CTACGCACACAAAGTGGCAACATTGAGCGGGTGACTACAGACAAGCGCAAAACCTCTAAGACCACCGACACCG
CCAACAAGGCTGTGGGCGCGGATCAGGCGGCGCGTCCCACTCGGCGAACAACTCGCCGCATCTTCGATCAGTC
GGAGAAGATGAAGGACGTGCTGTACGAGATCCGTGGCCCGGTGGCCGCGGAGGCGGAACGCATGGAGCTTGAT
GGGCACAACATCTTAAAGCTCAACACGGGAAATCCAGCCGTGTTCGGATTCGATGCCCCCGACGTGATTATGC
GTGACATGATCGCCAACCTTCCAATGCATAAAA
<210> 4
<211> 1509
<212> DNA
<213> 氨基轉(zhuǎn)移酶下游alaT-R核苷酸片段
<400> 4
GCGGCCGCATCTCCTTTGCATCACATACAACGGTCTATCCAAGGCATACCGCGTCGCAGGATACCGAGCTGGC
TGGATGGTATTGACTGGACCAAAGCAATACGCACGTGGATTTATTGAGGGCCTCGAACTCCTCGCAGGCACTC
GACTCTGCCCGAATGTCCCAGCTCAGCACGCTATTCAGGTGGCTCTCGGTGGACGCCAGTCCATCTACGACCT
CACTGGCGAACACGGCCGACTCTTGGAACAGCGCAACATGGCATGGACGAAACTCAACGAAATCCCAGGTGTC
AGCTGTGTGAAACCAATGGGAGCTCTATACGCGTTCCCCAAGCTCGACCCCAACGTGTACGAAATCCACGACG
ACACCCAACTCATGCTGGATCTTCTCCGTGCCGAGAAAATCCTCATGGTTCAGGGCACTGGCTTCAACTGGCC
ACATCACGATCACTTCCGAGTGGTCACCCTGCCATGGGCATCCCAGTTGGAAAACGCAATTGAGCGCCTGGGT
AACTTCCTGTCCACTTACAAGCAGTAGTAGTTGTTAGGATTCACCACGAATCTCAGGATTTTTGAGATTCGTG
GTGAATTTTTGCGTTTTCCAGTCAGGCTCTTGCAACTTTCGGACCGATTTCAGAGGGGCGGAGCTGGTTTGTG
GTGGATCCTTGCAATGGAACCGCTTAGGAATACCAAGTTGGAGGCCAGGGTGTTGGGATTGCAAAAATCCGTC
CCCAGTTCGTTGTAAAATATCGATCTTGATCGAATATTAGAGCTAATATTGGACTATTATGCAAAAACTCGTT
CGATTCAAGGATCTCCTAGCGATCTGAGACGAGAAGTTGGACAGCTAACCTGCAGAAACCTTGCAAGAATCAC
AACAGCCCCAATGGCCTCAAAAGTCACGCCCTCAGAATCGCTGCCAAGCGTCTAAATCCCCTAAAACGGGACA
ATAGGTCACTGGGCGATCCCAAGCCCTTAAAACGTGATCCTTAAATACCCACTGTCCTCTATTCTGGGTTAGG
CTTCACTGGGTAAAAGTGCCTGCCTATGCCTGAAACTTGAGCATGGCAACAGCAAGGAGACACCGTGGGAAAA
CATGCAGCTGAAACATCGGAACCGAAGAAAAATTCACCGTGGCGCATTGGTTTGTTGACGTTTTTGATTTCTT
CAGTTGTCGTGACGCTGGTGGGCATGGTGATGCTGTGGCCGGATTCTGATGATGTGGTGTTGGCGGATAACTT
TTCGCAGACGTTTGCGGGAAATCATGAGCAGGTGGATGGAACGATCACGCTCGTTGATAATTCTGCGTGTAAT
TCGCCAGACACCGGCCGAGTTTTTGCGGAAAGCCCCACGATTTCTGCGGAGCCGGCAACGTTGGAGTGCGTGC
GTGCACTCGTAGACATCACATCGGGTGCCAATGAGGGGCAGAAAACTCAGCTGATCACTTACGCGCAACCTGG
TGATCCGGAGTTTTCCGAGGGCGACAAGATCCGCATGGTGGAAACACCG
<210> 5
<211> 116
<212> DNA
<213> 啟動(dòng)子PlacUV5
<400> 5
GTAGAGGATCGAGATCTCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGAT
AACAATTTCACACAGGAAACAGAATTCCATGGGCAGCAGCCAT
<210> 6
<211> 1017
<212> DNA
<213> 乙酰羥酸還原異構(gòu)酶ilvC
<400> 6
ATGGCTATTGAACTGCTTTATGATGCTGACGCTGACCTCTCCTTGATCCAGGGCCGTAAGGTTGCCATCGTTG
GCTACGGCTCCCAGGGCCACGCACACTCCCAGAACCTCCGCGATTCTGGCGTTGAGGATGTCATTGGTCTGCA
CGAGGGCTCCAAGTCCGCAGAGAAGGCAAAGGAAGCAGGCTTCGAGGACAAGACCACCGCTGAGGCTGCAGCT
TGGGCTGACGTCATCATGCTCCTGGCTCCAGACACCTCCCAGGCAGAAATCTTCACCAACGACATCGAGCCAA
ACCTGAACGCAGGCGACGCACTGCTGTTCGGCCACGGCCTGAACATTCACTTCGACCTGATCAAGCCAGCTGA
CGACATCATCGTTGGCATGGTTGCGCCAAAGGGCCCAGGCCACTTGGTTCGCCGTCAGTTCGTTGATGGCAAG
GGTGTTCCTTGCCTCATCGCAGTCGACCAGGACCCAACCGGAACCGCACAGGCTCTGACCCTGTCCTACGCAG
CAGCAATCGGTGGCGCACGCGCAGGCGTTATCCCAACCACCTTCGAAGCTGAGACCGTCACCGACCTCTTCGG
CGAGCAGGCTGTTCTCTGCGGTGGCACCGAGGAACTGGTCAAGGTTGGCTTCGAGGTTCTCACCGAAGCTGGC
TACGAGCCAGAGATGGCATACTTCGAGGTTCTTCACGAGCTCAAGCTCATCGTTGACCTCATGTTCGAAGGTG
GCATCAGCAACATGAACTACTCTGTTTCTGACACCGCTGAGTTCGGTGGCTACCTCTCCGGCCCACGCGTCAT
CGATGCAGACACCAAGTCCCGCATGAAAGACATCCTGACCGATATCCAGGACGGCACCTTCACCAAGCGCCTC
ATCGCAAACGTTGAGAACGGCAACACCGAGCTTGAGGGCCTTCGTGCTTCCTACAACAACCACCCAATCGAGG
AGACCGGCGCTAAGCTCCGCGACCTCATGAGCTGGGTCAAGGTTGACGCTCGCGCAGAAACCGCTTAA
<210> 7
<211> 426
<212> DNA
<213> 終止子rrnB
<400> 7
GGCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAGATTTTCAGCCTGATACAGATTAAATCAGAACGCAGAAGCGGTCTGATAA
AACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCACCTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCG
TAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTCCCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGC
TCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCG
CCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAAGCAACGGCCCGGAGGGTGGCGGGCAGGACGCCCGCCATAAACTGCCA
GGCATCAAATTAAGCAGAAGGCCATCCTGACGGATGGCCTTTTTGCGTTTCTACAAACTCT