本發(fā)明涉及菌株領域，具體涉及一種新型致病性蠟樣芽孢桿菌HB-SS-1及其培養(yǎng)方法和應用。

背景技術(shù)：

蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus，B.C)在土壤等環(huán)境中廣泛存在，是一種需氧型的芽孢桿菌，其產(chǎn)生豐富的蛋白酶、SOD、淀粉酶及抑菌物質(zhì)等代謝產(chǎn)物。微生態(tài)制劑，以蠟樣芽孢桿菌為主要細菌，可以克服很多副作用，例如使用抗生素作為飼料和藥品添加劑所帶來的副作用，人和動物腸道微生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)、免疫力下降、藥物殘留及產(chǎn)生抗藥性等。B.C菌類制劑大多為非消化性藥劑或食品添加劑，能選擇性促進生活在腸道的微生物的活性，同時抑制腸道內(nèi)有害病菌的生長，降低宿主染病的機會，使宿主保證健康。另外，B.C菌在生長過程中還會產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，刺激和促進宿主的生長。

B.C菌雖然在其作為有益菌方面已獲得了長足的發(fā)展和足夠的重視，但是B.C菌也是一種條件致病菌，在一定旳條件下也會對動物機體造成很強的致病性，因此它危害也應該引起我們足夠的重視。研究表明，該菌同昆蟲病原菌蘇云金桿菌、人畜病原菌、炭疽芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、韋氏芽抱桿菌組成芽孢桿菌屬蠟樣芽孢桿菌組，它們的形態(tài)特征、生理生化特征非常相似并有著極高的同源性，該菌也曾被多次報道引起人食物中毒、以及在養(yǎng)殖過程中引發(fā)部分動物疾病等。鑒于B.C菌包含有益菌株和致病性菌株，因此在使用前應首先確定菌株是否為致病菌株，確保其安全性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新型致病性蠟樣芽孢桿菌HB-SS-1及其培養(yǎng)方法和應用。

為實現(xiàn)上述目的，發(fā)明人從發(fā)病麋鹿群中分離到了一株新型致病性蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)HB-SS-1，所述菌株于2016年11月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武昌珞珈山，保藏編號為：CCTCC NO：M2016672。

所述(Bacillus cereus)HB-SS-1的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明還提供了上述新型致病性蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)HB-SS-1的分離純化方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、培養(yǎng)基配制

TSA固體培養(yǎng)基配制：準確稱取TSA粉末40g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至50-60℃時，加入過濾除菌的羊血清60mL，混合均勻后倒板備用；

TSB液體培養(yǎng)基配制：準確稱取TSB粉末30g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121℃高壓蒸汽滅菌15min，臨用前加入過濾除菌的羊血清60mL即可；

S2、分離純化

選取發(fā)病麋鹿的肺、胸水、心包液、關(guān)節(jié)液接種TSA/NAD固體培養(yǎng)基，置37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24-48小時，挑取乳白色的圓形光滑小菌落涂片，革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陽性小桿狀菌，再進行兩次TSA/NAD固體培養(yǎng)基亞克隆培養(yǎng)。

本發(fā)明人對該菌株進行了一系列生物學特性試驗如：細菌純化培養(yǎng)、涂片染色鏡檢、生化試驗、藥敏試驗、PCR鑒定、動物實驗。試驗結(jié)果證實該菌株16SrDNA序列與炭疽桿菌部分菌株序列一致，通過動物實驗證明HB-SS-1有較強毒力，能夠致死實驗小白鼠，該毒株可作為以后防疫麋鹿細菌病的候選疫苗菌株，可用于制備蠟樣芽孢桿菌病疫苗。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例中HB-SS-1菌株培養(yǎng)基生長形態(tài)。

圖2為本發(fā)明實施例中HB-SS-1菌株革蘭氏染色鏡檢。

圖3為本發(fā)明實施例中HB-SS-1菌株16SrDNA基因進化樹。

表1生化鑒定試驗結(jié)果

注：″+″表示只產(chǎn)酸或陽性，″-″表示陰性

表2 HB-SS-1株藥敏試驗結(jié)果

注：S表示敏感；I表示中度敏感；R表示耐藥。

表3半數(shù)致死量測定試驗結(jié)果

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

蠟樣芽孢桿菌HB-SS-1株的分離純化和鑒定。

培養(yǎng)基配制

TSA固體培養(yǎng)基配制：準確稱取TSA粉末40g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121℃高壓蒸汽滅菌15min，冷卻至50-60℃時，加入過濾除菌的羊血清60mL，混合均勻后倒板備用；

TSB液體培養(yǎng)基配制：準確稱取TSB粉末30g，溶于940mL蒸餾水，充分搖勻后121℃高壓蒸汽滅菌15min，臨用前加入過濾除菌的羊血清60mL即可；

分離純化

選取發(fā)病麋鹿的肺、胸水、心包液、關(guān)節(jié)液接種TSA/NAD固體培養(yǎng)基，置37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24-48小時，挑取乳白色的圓形光滑小菌落涂片見圖.1，革蘭氏染色鏡檢，選取革蘭氏陽性小桿狀菌見圖.2，再進行兩次TSA/NAD固體培養(yǎng)基亞克隆培養(yǎng)。

同時接種鮮血瓊脂固體培養(yǎng)基和普通瓊脂固體培養(yǎng)基，結(jié)果TSA/NAD固體培養(yǎng)基上生長速度和形態(tài)更為良好。

生化鑒定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，將分離菌株進行生化試驗，觀察形態(tài)特征和生化反應特性，測定生化指標。

分離菌株的生化特性符合蠟樣芽孢桿菌特有特征見表1，判定為蠟樣芽孢桿菌屬。

16SrDNA基因序列測定與分析

將菌株接種至普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜(37℃)，離心收集菌體，

按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌總DNA。16SrRNA基因PCR擴增引物分別為：P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，P2：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。

菌體DNA模板的制備取培養(yǎng)物1.5mL，10000r/min離心5min，棄上清，沉淀用200μL雙蒸水重懸，100℃水浴10min后，12000r/min離心5min收集上清，即為PCR模板，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增及測序用提取的菌體DNA作為PCR模板。PCR擴增體系為：10×PCRBuffer10μL，MgCl₂(25mM)2.5μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，引物P1(20μM)2.0μL，引物P2(20μM)2.0μL，模板DNA5.0μL，Taq酶(5U/μL)2.5μL加雙蒸水至50μL。反應條件為：95℃預變性5min，94℃變性2min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃終延伸7min。取10μL PCR擴增產(chǎn)物，用1％的瓊脂糖凝膠在120V電壓下電泳鑒定，同時以標準株作為陽性對照，結(jié)果出現(xiàn)了1000bp大小的特異性條帶，經(jīng)過回收鑒定為陽性的PCR擴增產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司測序。

HB-SS-1株16SrDNA基因測序結(jié)果見圖.3所示，該序列與GenBank中公布的序列進行BLAST比對，與國內(nèi)外已有的蠟樣芽孢桿菌相應序列的同源性達99％以上。

蠟樣芽孢桿菌藥敏試驗

用滅菌接種環(huán)挑取純化好的菌落到含有TSB的試管中，37℃搖床培養(yǎng)8h；使用滅菌棉試子蘸取培養(yǎng)好的菌液，在15min內(nèi)均勾涂布于整個TSA平板表面；將接種好的TSA平板置室溫干燥5min；然后采用藥敏紙片法，用無菌鑷子將19種抗生素紙片貼在含菌瓊脂表面，每個TSA平板貼種抗生素紙片，紙片貼好后室溫放置15min，再將平板倒置于恒溫箱，于37℃培養(yǎng)24h；觀察結(jié)果，并測量抑菌圈直徑，根據(jù)CLSI2009年藥敏判定標準對結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析表見表2，檢測分離菌株的藥物敏感性。

蠟樣芽孢桿菌半數(shù)致死量(LD₅₀)測定試驗

選用70只4周齡雌性健康昆明小白鼠，通過″平板活菌計數(shù)法”進行細菌計數(shù)。具體過程如下：將小白鼠設二個組：空白對照組1組小白鼠、正常試驗組6組小白鼠，每組10只小白鼠，采用腹腔注射，進行隔離詞養(yǎng)觀察?？諏φ战M的小鼠腹腔注射生理鹽水，200μL只；正常試驗組小鼠分別腹腔注射從3.8×10⁹、1.9×10⁹、9.5×10⁸、4.75×10⁸、2.38×10⁸、1.19×10⁸、5.94×10⁷CFU/mL劑量的分離菌，200uL只。接種每天觀察、記錄小白鼠發(fā)病死亡情況見表3，對死亡后的小白鼠采集肝臟接種TSA培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)后進行細菌染色鏡檢。

試驗結(jié)果顯示，在感染后48h內(nèi)，有3組別開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，其中9.5×10⁸CFU/mL及以上高濃度組別可全部死亡；96h后所有試驗組別的小鼠均發(fā)病死亡，而對照組死亡率為0(表2)。根據(jù)改良寇氏法計算HB-SS-1菌株72h的LD₅₀為3.36×10⁸CFU/mL。同時從發(fā)病死亡的小鼠肝臟中也分離到了該菌株。說明該菌株具有較強的毒力，可以作為防控該病的疫苗株。

蠟樣芽孢桿菌滅活疫苗的制備

菌種檢驗

取分離菌種少許，接種于血瓊脂平板上培養(yǎng)，取菌落涂片染色鏡檢，做細菌純度檢驗，應該純粹無雜菌。該菌保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為：CCTCC NO：M2016672。

菌液滅活

將分離的菌種勾取接種至馬丁肉湯內(nèi)培養(yǎng)，并利用比濁法使菌濃度達10¹⁰CFU/mL為止。滅活在細菌計數(shù)基礎上，按照0.4％體積比加入甲醛液，并置于37℃下滅活24-72h。其間每12h震蕩一次并做滅活檢驗。

滅活疫苗配置

將高壓后的氫氧化鋁膠與滅活后菌液按1∶5的比例混合混勻，既成乳白色氫氧化鋁膠滅活疫苗。

滅活疫苗安全性試驗

將疫苗分別腹腔接種于12只四周齡的健康昆明小鼠上，0.1ml/只。同時設立健康對照組注射生理鹽水0.1ml/只。觀察10d，看有無不良反應，并剖解

注射小鼠，檢查注射部位有無異常。

試驗結(jié)果：接種疫苗組小鼠在注射后無任何不良反應，全部存活。證明疫苗安全，剖解注射部位也無異常。

滅活疫苗內(nèi)毒素測定

取0.1mL鱟試劑放置于10x75mm試管中，然后加入0.1ml滅活的菌液，輕輕搖動置37℃水浴1h。取出放置室溫10min觀察結(jié)果。

試驗結(jié)果：將試管緩慢的旋轉(zhuǎn)180°，僅有少量渾濁物，表明內(nèi)毒素已經(jīng)被滅活。

滅活疫苗動物保護試驗

用4月齡新西蘭白兔4只，每只頸部皮下注射氫氧化鋁滅活疫苗1ml，14d后連同另外4只未免疫對照組每只肌肉注射培養(yǎng)的活菌0.2ml(含10億CFU)，并觀察10-14d。免疫組白兔得到保護存活，保護率為100％(4/4)，而對照組全部發(fā)病、死亡。

試驗結(jié)果：表明對照組全部死亡死亡率為100％(4/4)，免疫組全部存活保護率100％(4/4)。說明注射疫苗后能產(chǎn)生抗體來保護機體。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

<110>湖北省農(nóng)業(yè)科學研究院畜牧獸醫(yī)研究所

<120> 一種新型致病性蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）HB-SS-1及其培養(yǎng)方法和應用

<160> 5

<210> 1

<211> 1673

<212> DNA

<213> 蠟樣芽孢桿菌HB-SS-1（Bacillus cereus HB-SS-1）

<400> 1

accgaggccc cgagcctctc cgccgagacg accccgggcc ccgtcaccga ggtcccgagt 60

ccctcggccg aggtctggga cgacctctcc accgaggccg acgacgatga cctcaacggc 120

gacctcgacg gcgacgaccg ccgcgcgggc ttcggctcgg ccctcgcatc cctgagggag 180

gcgcccccgg cccatctggt gaacgtgtcc gagggcgcca acttcaccct cgacgcgcgc 240

ggcgacggcg ccgtgctggc cgggatctgg acgttcctgc ccgtccgcgg ctgcgacgcc 300

gtgtcggtga ccacggtgtg cttcgagacc gcgtgccacc cggacctggt gctgggccgc 360

gcctgcatcc ccgaggcccc ggagatgggc atcggcgact acctgccgcc cgaggtgccg 420

cggctccggc gcgagccgcc catcgtcacc ccggagcggt ggtcgccgca cctgagcgtc 480

ctgcgggcca cgcccaacga cacgggcctc tacacgctgc acgacgcctc ggggccgcgg 540

gccgtgttct ttgtggcggt gggcgaccgg ccgcccgcgc cggcggaccc ggtgggcccc 600

gcgcgccacg agccccgctt ccacgcgctc ggcttccact cgcagctctt ctcgcccggg 660

gacacgttcg acctgatgcc gcgcgtggtc tcggacatgg gcgactcgcr cgagaacttt 720

ascgccacgc tggastggta ctacgcgcgc gcgcccccgc ggtgcctgct rtactacgtg 780

tacgagccct gcatctacca cccgcgcgcg cycgagtgcc tgcgcccggt ggacccggcg 840

tgcagcttca cctcgycggc gcgcgcgcgg ctggtggcgc gccgcgcgta cgcctcgtgc 900

agcccgctgc tcggggaccg gtggctgacc gcctgcccct tcgacgcctt cggcgaggag 960

gtgcacacga acgccaccgc ggacgagtcg gggctgtacg tgctcgtgat gacccacaac 1020

ggccacgtcg ccacctggga ctacacgctc gtcgccaccg cggccgagta cgtcacggtc 1080

atcaaggagc tgacggcccc ggcccgggcc ccgggcaccc cgtggggccc cggcggcggc 1140

gacgacgcga tctacgtgga cggcgtcacg acgccggcgc cgcccgcgcg cccgtggaac 1200

ccgtacggcc ggacgacgcc cgggcggctg tttgtgctgg cgctgggctc cttcgtgatg 1260

acgtgcgtcg tcgggggggc catctggctc tgcgtgctgt gctcccggcg ccgggcggcc 1320

tcgcggccgt tccgggtgcc gacgcgggcg cggacgcaca tgctctctcc ggtgtacacc 1380

agcctgccca cgcacgagga ctactacgac ggcgacgacg acgacgacga ggaggcgggc 1440

gtcatccgcc ggcggcccgc ctcccccggc ggagacagcg gctacgaggg gccgtacgcg 1500

agcctggacc ccgaggacga gttcagcagc gacgaggacg acgggctata cgtgcacccc 1560

gaggaggcgc cccgctccgg cttcgacgtc tggttccgcg atccggagaa accggaagtg 1620

aagaatggac ccaactatgg cgtgaccgcc aaccgcctgt tgaatgcccg ccc 1673

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctccacaagc taacactttc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catagaaact tcttttgaac c 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GCGGCCCTTT CTGCTGCG

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

AGCGGGGCAG GACATCAA