專利名稱：LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗體制備方法及在腫瘤發(fā)生中檢測的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗 體制備及在腫瘤發(fā)生中檢測的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
-U(B1基因，又名STKII( serinePthreonine proteinkinase 11)基因，是 由Hemminki等在1998年從Peutz Jeghers syndrome ( PJS)患者的血細(xì)胞 中克隆出來的一種基因，PJS是一種常染色體顯性遺傳疾病，患者不但腸道、 胃、胰腺發(fā)生惡性腫瘤的可能性增加，而且在乳腺、子宮頸、肺、卵巢、睪丸 發(fā)生惡性變危險度也增加，初步估計93 W的PJS患者平均在43歲時發(fā)生惡性 腫瘤。研究表明LKB1基因的突變失活不僅存在于PJS相關(guān)性腫瘤中而且在PJS 非相關(guān)性腫瘤如直腸癌、胃癌、睪丸腫瘤、乳腺癌、胰腺腫瘤、卵巢腫瘤、宮 頸癌、黑色素瘤、肺癌中也普遍存在，提示LKB1在這些腫瘤的發(fā)生中可能扮演 了腫瘤抑制基因的作用。Lkbl基因定位于人19p13. 3帶，cDNA全長2158bp， 編碼區(qū)1302 bp ，有9個外顯子，是由433個氨基酸組成的分子量為50KD的 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其N端含有一個核定位信號區(qū)和胞漿定位區(qū)LKB1的 某些磷酸化位點是其發(fā)揮抑制細(xì)胞生長功能所必須的。現(xiàn)已知LKB1的磷酸化位 點有8個Ser31 , Ser325 ， Thr366和Ser431可被其上游的激酶磷酸化，而 Thrl85 ，Thrl89 , Thr336和Thr402是自磷酸化的位點。Gopal P. SAPKOT等人制備了 LKB1的Thr336磷酸化抗體，抗原為329-343 位點的15個氨基酸KDRWRSMTpWPYLED，用此抗原免疫家兔獲得抗血清，先用 連有該磷酸化肽段的CH-S印harose吸附純化，然后再通過連有非磷酸化肽段 CH-S印harose進(jìn)一步純化。在不含LKB1的G361細(xì)胞中過表達(dá)GST-LKB1能夠抑 制細(xì)胞生長，而LKB1的突變體(T336A)則阻止了 LKB1的抑制效果，而其他自 我磷酸化位點的突變確沒有此效果，說明Thr336位點在LKB1抑制細(xì)胞生長中發(fā)揮著重要的作用(GopalP.SAPKOT， 2002)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗體制備方法及 在腫瘤發(fā)生中檢測的應(yīng)用，通過生物信息學(xué)分析法設(shè)計Thr336-p-LKBl特異性 氨基酸序列，并用該多肽免疫家兔以獲得特異性的抗體，為LKB1蛋白功能研究 和腫瘤診斷提供有力工具。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗體制備方法，其特征在于包括以下步驟(1) 、通過生物信息學(xué)方法選取LKB1基因的Thr336位點附近10個氨基酸 WRSMTpWPYL，且使Thr336位點磷酸化，并鉸鏈上BSA以增強其抗原性，以此為 Thr336-P-LKB1抗原，對兔子進(jìn)行免疫獲得Thr336-p-LKB1抗血清；(2) 、用Thr336-p-LKB1抗原條進(jìn)行抗血清純化(3) 、制備的抗血清通過Western blot檢測抗體效價及特異性檢測， Thr336-p-LKBl抗體陰性對照的底物為融合表達(dá)蛋白His-LKB1，陽性對照的底 物為Thr336-p-LKB1抗原肽段。所述的LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗體制備方法，其特征在于更為具 體的步驟為(1) 、通過生物信息學(xué)方法選取LKB1基因的Thr336位點附近10個氨基酸 WRSMTpWPYL，且使Thr336位點磷酸化，并鉸鏈上BSA，以此為Thr336-p-LKBl 抗原，對兔子進(jìn)行免疫獲得Thr336-p-LKB1抗血清；(2) 、用Thr336-p-LKBl抗原條進(jìn)行抗血清純化Thr336-p-LKB1抗原條的制備將蛋白質(zhì)電泳的加樣孔制成一個長槽，以增 加上樣量，Thr336-p-LKB1抗原經(jīng)SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜，根據(jù)麗春紅染色結(jié)果，剪 下目的條帶，即為Thr336-p-LKB1抗原條；抗血清純化抗原條經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，移到Thr336-p-LKBl抗血清中4'C 孵育過夜，TBST緩沖液洗滌2次，TBST緩沖液成份20 mmol/L Tris PH7. 4, 500 mmol/L NaCL 0.05% Tween-20 ，每次10min，將抗原條剪碎，放入2ml eppendorf管中，加入lml 100mM/L glycine/HCL pH2. 5,旋渦振蕩儀振蕩5min，取出液體，用pH 8.0的1M Tris溶液調(diào)pH至7.0， 4'C保存；(3)制備的抗血清通過Western blot檢測抗體效價，His-LKB1蛋白及 Thr336-p-LKB1肽段作為抗體特異性檢測底物。上述方法制備的抗體的應(yīng)用，其特征在于作為腫瘤診斷檢測試劑在正 常細(xì)胞HEK293、HL7702細(xì)胞和在Hela細(xì)胞中，Thr336-p-LKB1都基本沒有表達(dá)， 在腫瘤細(xì)胞S180、 C0S7、 Caco2以及H印G2中，Thr336-p-LKB1均有表達(dá)，在增 殖越快的細(xì)胞中，Thr336-p-LKBl表達(dá)量越高。通過生物信息學(xué)方法選取LKB1基因的Thr336位點附近10個氨基酸 WRSMTpVVPYL，且使Thr336位點磷酸化，并鉸鏈上BSA，以此為Thr336-p-LKBl 抗原，對家兔免疫獲得抗血清；用Thr336-p-LKBl抗原條進(jìn)行抗血清純化， Western blot檢測其效價及特異性檢測，Thr336-p-LKB1抗體陰性對照的底物 為融合表達(dá)蛋白His-LKB1，陽性對照的底物為Thr336-p-LKBl抗原肽段。然后， 用自制的磷酸化抗體檢測LKB1在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中表達(dá)規(guī)律，同時，用商 品化的LKBl非磷酸化抗體進(jìn)行對照檢測，0 -actin抗體檢測各樣品蛋白質(zhì)量是 否一致。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明 Thr336-p-LKBl抗體不僅識別His-LKBl蛋白而且識別 p-LKBl(Thr336)肽段，而p-LKBl (Thr336)抗體僅識別p-LKBl (Thr336)抗原。 Thr336-p-LKBl抗體為LKBl蛋白功能研究和腫瘤診斷提供有力工具。


圖1為免疫印跡法檢測LKBl在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)。 圖中Rabbit-anti-LKBl: polyclonal antibodies against LKBl protein (1:1000) p-LKBl(Thr336)隱R: polyclonal antibodies against LKBl peptide (1:400)(自制抗體)P -actin/HRP: polyclonal antibodies against P -actin (1:1000)具體實施方式
本例通過生物信息學(xué)方法選取LKBl Thr336位點附近10個氨基酸 WRSMTpWPYL且使Thr336位點磷酸化，并鉸鏈上BSA，以此為抗原，對兔子進(jìn)行 免疫獲得抗血清。然后用p-LKBl(Thr336)抗原條進(jìn)行純化。制備p-LKBl (Thr336)抗原條制備12. 5% SDS-PAGE膠，將加樣孔制成一個 長槽，以增加上樣量，p-LKBl(Thr336)抗原經(jīng)SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，根據(jù)麗春紅染 色結(jié)果，剪下目的條帶，即為p-LKBl(Thr336)抗原條，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉lh 后，移到p-LKBl(Thr336)抗血清中4'C孵育過夜，TBST(20 mmol/L Tris pH7. 4， 500 mmol/L NaCL 0. 05% Tween-20)緩沖液洗滌2次，每次lOmin.將抗 原條剪碎，放入2ml eppendorf管中，加入lml 100mM/L glycine/HCL pH2. 5，旋 渦振蕩儀振蕩5min，取出液體，用1M Tris( pH 8.0)調(diào)pH至7.0， 4'C保存.制備的抗血清通過Western blot檢測抗體效價，His-LKB1蛋白及 p-LKBl (Thr336)肽段作為抗體特異性檢測底物。用LKB1抗體和p-LKBl (Thr336)抗體分別對人正常肝臟細(xì)胞HL7702、人胚腎 細(xì)胞HEK293、小鼠肉瘤細(xì)胞S180、非洲綠猴腎細(xì)胞C0S7及人肝癌細(xì)胞H印G2、 結(jié)腸癌細(xì)胞Caco2、乳腺癌細(xì)胞MCF7檢測在正常細(xì)胞HEK293和HL7702細(xì)胞 中，LKB1表達(dá)較多，在已知的LKBl缺陷型Hela細(xì)胞中，LKB1基本沒有表達(dá)， 這與預(yù)期結(jié)果相符；而在這三種細(xì)胞中p-LKBl(Thr336)都基本沒有表達(dá)。在腫 瘤細(xì)胞S180， C0S7、 Caco2以及H印G2中，LKB1和p-LKB1 (Thr336)均有表達(dá)， 同時還發(fā)現(xiàn)p-LKBl(Thr336)磷酸化程度與腫瘤惡變度相關(guān)。另外，乳腺癌細(xì)胞 MCF7沒有檢測到LKB1-Thr336位點的磷酸化，可能與其發(fā)病機理有關(guān)。本實驗結(jié)果顯示，LKB1-Thr336位點的磷酸化可能是某些腫瘤發(fā)生的特征， 有望成為腫瘤診斷的指標(biāo)之一。用自制的磷酸化抗體檢測LKB1在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中表達(dá)規(guī)律，同時， 用商品化的LKB1非磷酸化抗體進(jìn)行對照檢測，0 -actin抗體檢測各樣品蛋白質(zhì) 量是否一致。見圖1。
權(quán)利要求
1、LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗體制備方法，其特征在于包括以下步驟(1)、通過生物信息學(xué)方法選取LKB1基因的Thr336位點附近10個氨基酸WRSMTpVVPYL，且使Thr336位點磷酸化，并鉸鏈上BSA以增強其抗原性，以此為Thr336-p-LKB1抗原，對兔子進(jìn)行免疫獲得Thr336-p-LKB1抗血清；(2)、用Thr336-p-LKB1抗原條進(jìn)行抗血清純化(3)、制備的抗血清通過Western blot檢測抗體效價及特異性檢測，Thr336-p-LKB1抗體陰性對照的底物為融合表達(dá)蛋白His-LKB1，陽性對照的底物為Thr336-p-LKB1抗原肽段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的LKBl基因Thr336磷酸化多克隆抗體制備方法，其特 征在于更為具體的步驟為(1) 、通過生物信息學(xué)方法選取LKB1基因的Thr336位點附近10個氨基酸 WRSMTpWPYL，且使Thr336位點磷酸化，并鉸鏈上BSA，以此為Thr336-p-LKB1 抗原，對兔子進(jìn)行免疫獲得Thr336-p-LKBl抗血清；(2) 、用Thr336-p-LKB1抗原條進(jìn)行抗血清純化Thr336-p-LKBl抗原條的制備將蛋白質(zhì)電泳的加樣孔制成一個長槽，以增 加上樣量，Thr336-p-LKBl抗原經(jīng)SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜，根據(jù)麗春紅染色結(jié)果，剪 下目的條帶，即為Thr336-p-LKBl抗原條；抗血清純化抗原條經(jīng)5%脫脂奶粉封閉，移到Thr336-p-LKBl抗血清中4'C 孵育過夜，TBST緩沖液洗滌2次，TBST緩沖液成份20 mmol/L Tris PH7. 4， 500 mmol/L NaCL0.05% Tween-20，每次10min，將抗原條剪碎，放入2ml eppendorf管中，加入lml 100mM/L glycine/HCL pH2. 5，旋渦振蕩儀振蕩5min， 取出液體，用pH 8. 0的1M Tris溶液調(diào)pH至7. 0， 4'C保存；(3)制備的抗血清通過Western blot檢測抗體效價，His-LKBl蛋白及 Thr336-p-LKBl肽段作為抗體特異性檢測底物。
3、用權(quán)利要求1或2方法制備的抗體的應(yīng)用，其特征在于作為腫瘤診斷 檢測試劑在正常細(xì)胞HEK293、 HL7702細(xì)胞和在Hela細(xì)胞中，Thr336-p-LKBl 都基本沒有表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞S180、 C0S7、 Caco2以及H印G2中，Thr336-p-LKBl 均有表達(dá)，在增殖越快的細(xì)胞中，Thr336-p-LKBl表達(dá)量越高。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗體制備方法及在腫瘤發(fā)生中檢測的應(yīng)用，其抗體制備是通過生物信息學(xué)方法選取LKB1基因的Thr336位點附近10個氨基酸WRSMT_pVVPYL，且使Thr336位點磷酸化，并鉸鏈上BSA，以此為Thr336-p-LKB1抗原，對兔子進(jìn)行免疫獲得Thr336-p-LKB1抗血清；用Thr336-p-LKB1抗原條進(jìn)行抗血清純化；Thr336-p-LKB1抗體陰性對照的底物為融合表達(dá)蛋白His-LKB1，陽性對照的底物為Thr336-p-LKB1抗原肽段，商品非磷酸化LKB1抗體不僅識別His-LKB1蛋白而且識別p-LKB1(Thr336)肽段，而本發(fā)明的p-LKB1(Thr336)抗體僅識別p-LKB1(Thr336)抗原。為LKB1蛋白功能研究和腫瘤診斷提供有力工具。
文檔編號C07K16/18GK101235087SQ20081002048
公開日2008年8月6日 申請日期2008年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月5日
發(fā)明者任艷敏, 左慢慢, 皓 魏, 蓓 黃 申請人:蓓 黃