一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)的理化分析方法繁瑣復(fù)雜、成本較高、分析速度慢等問題，提供了簡便、快速、靈敏的免疫分析技術(shù)。該制備方法包括以下幾個主要步驟：第一步采用微波無溶劑法合成人工半抗原多效唑半琥珀酸酯。第二步以多效唑半琥珀酸酯為原料，采用碳二亞酰法與牛血清蛋白進行偶聯(lián)得到多效唑人工抗原。第三步用合成的人工抗原對Balb/c小鼠進行免疫，取血，離心得到抗血清，即為抗多效唑多克隆抗體。該抗體具有良好的特異性和靈敏度，且合成方法簡便，可用于多效唑的快速免疫檢測，具有良好的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法與應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法與應(yīng)用，屬于植物生長 調(diào)節(jié)劑小分子化合物免疫化學(xué)和食品安全分析領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0003] 多效唑是一種生長抑制類的植物生長調(diào)節(jié)劑，它在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用價值在于它對作 物生長的抑制作用，具有延緩植物生長、抑制莖桿伸長、縮短節(jié)間、促進花芽分化、增加植物 抗逆性能、提高產(chǎn)量等效果，因此被廣泛應(yīng)用于水稻、麥類、花生、果樹、煙草、油菜、大豆、花 卉、草坪等作(植）物。隨著植物生長調(diào)節(jié)劑使用規(guī)模的不斷擴大，其殘留對人類健康和環(huán) 境的慢性和長期效應(yīng)，日益引起人們的關(guān)注和擔(dān)憂。為此，世界各國對植物生長調(diào)節(jié)劑殘留 的限制也越來越嚴(yán)格，我國對多效唑在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量有較嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。我國食品 安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB2763-2014 (食品中農(nóng)藥最大殘留限量）對多效唑殘留量的規(guī)定如下：谷 物中稻谷、小麥彡0. 5mg/kg;油料和油脂中菜籽油和花生仁彡0. 5mg/kg，而油菜籽彡0. 2 mg/kg;水果中蘋果和蒸枝彡0· 5mg/kg。
[0004] 然而，由于分子量小于1000道爾頓的小分子化合物，如植物生長調(diào)節(jié)劑，其傳統(tǒng) 的殘留分析方法，主要是依靠液相色譜法、氣相色譜法或質(zhì)譜法等儀器分析方法，存在操作 過程繁瑣復(fù)雜、成本較高、分析速度慢等問題，難以滿足實際分析的需要，因此迫切要求發(fā) 展簡便、靈敏、特異性強、成本低廉的快速檢測技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法。
[0006] -種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法，是通過以下技術(shù)實現(xiàn)的。
[0007] 1、半抗原的合成：在4-二甲氨基吡啶的催化作用下，多效唑和琥珀酸酐發(fā)生?；?反應(yīng)，引入活性基團羧基和連接臂，得到半抗原，即多效唑半琥珀酸酯。
[0008] 2、全抗原的合成：采用碳二亞酰法將多效唑半琥珀酸酯與牛血清蛋白進行偶聯(lián)， 得到免疫全抗原。
[0009] 3、多克隆抗體的制備：用合成的全抗原免疫動物，取血，離心得到抗血清，即為多 效唑多克隆抗體。
[0010] 所述的動物優(yōu)選為Balb/c雌性小鼠，利用上述方法制備的鼠多克隆抗體，該抗體 效價達到1:80000倍。
[0011] 一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法，具體的步驟如下： 1、多效唑半抗原的合成 分別取1.1mg多效唑、5~10mg琥珀酸酐和0.46mg4-二甲氨基吡啶，置于玻璃離心 管中，用吡啶做溶劑將三種物質(zhì)混合均勻，氮氣吹干溶劑。將玻璃管置于微波爐中，用中火 在406W功率下間歇反應(yīng)185min。反應(yīng)結(jié)束后加入1.5mL氯仿溶解混合物，離心去沉淀， 上清液再加入1.5mL超純水，迷你振蕩器上混勻1~2min。分離出氯仿相，氮氣吹干后得到 淡黃色粉末，即為半抗原多效唑半琥珀酸酯； 2、 多效唑免疫抗原的合成 將2mg、5μm〇L多效唑半琥珀酸酯溶于200μL二甲基甲酰胺中，同時加入N-羥基 琥珀酰亞胺3mg，碳酰二亞胺:Γ6mg，室溫振蕩反應(yīng)完全后，得到溶液I;5mg牛血清蛋白 溶于1.6mLIXPBS緩沖溶液，得到溶液2,再將溶液1加入溶液2中，反應(yīng)6h，反應(yīng)后的 混合物移入透析袋中，用超純水透析3d，每天更換透析液2次，透析后即得到多效唑免疫 抗原EDC-PAC-HS-BSA，測定其濃度并于-20°C保存?zhèn)溆茫?3、 多效唑檢測抗原的制備 將2mg、5ymoL多效唑半琥珀酸酯溶于200yL二甲基甲酰胺中，同時加入N-羥基琥 拍酰亞胺3~6mg,碳酰二亞胺6.0mg,室溫振蕩反應(yīng)完全后，得到溶液I;4mg卵清蛋白溶 于I. 6mLIXPBS緩沖溶液，得到溶液2,再將溶液1加入溶液2中，反應(yīng)6h，反應(yīng)后的混 合物移入透析袋中，用超純水透析3d，每天更換透析液2次，透析后即得到多效唑檢測抗 原EDC-PAC-HS-OVA，測定其濃度并于-20°C保存?zhèn)溆茫?4、 抗多效唑多克隆抗體的制備 用得到的免疫抗原對體重為15~20g的雌性Balb/c小鼠進行免疫，每次免疫劑量均 為100μg/只，第一次免疫采用弗氏完全佐劑與等體積的免疫抗原混合后乳化，腹部皮下 多點注射，之后每間隔3周加強免疫一次，加強免疫采用弗氏不完全佐劑與等體積抗原乳 化后腹部皮下多點注射，從第2次加強免疫開始，在免疫后的第七天斷尾取血，監(jiān)測小鼠抗 血清的效價和特異性當(dāng)抗體的效價和特異性達到要求后，摘除眼球采血，離心后獲得抗血 清，-20°C保存。
[0012] 采用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗體效價。具體方法如下： (1)包被：向酶標(biāo)板的小孔中加入100μL2. 4μg/mL包被原溶液，包被原溶液是將 檢測抗原用IXPBS稀釋得到的，4°C過夜。
[0013] (2)封閉：傾去包被液，用PBST(含0· 05%Tween-20的IXPBS溶液)洗板3次，力口 入300yL5%脫脂牛奶(溶于1XPBS)，37 °C保濕封閉lh。
[0014] (3)加一抗：傾去封閉液，PBST洗板三次。在每孔中先加入100 μ L 10XPBS緩 沖液（ρΗ=7.4,0. 1Μ)，然后用1:500稀釋的抗血清從第一孔開始做倍比稀釋，濃度依次為 1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000(以此類推）倍比稀釋，以空白對照孔調(diào) 零，37 °C保濕溫育45 min。
[0015] (4)加二抗：傾去反應(yīng)液，PBST洗板三次，每孔加入100μL酶標(biāo)二抗（1:2000稀 釋的羊抗鼠IgG_HRP)，37 °C保濕30min。
[0016] (5)顯色：傾去反應(yīng)液，PBST洗板3次，每孔加入TMB底物顯色液100μL，37°C保 濕避光顯色5-10min。TMB顯色液配制方法如下：A液：檸檬酸0.21g，乙二胺四乙酸二鈉 化0了4-2似)0.036 8，用超純水溶解并定容至60 1^，然后加入溶有0.0583,3'，5,5'-四 甲基聯(lián)苯胺（TMB)的丙酮溶液40mL;B液：乙酸鈉0.49g，過氧化脲0.1g，冰乙酸60mL， 加超純水定容至100mL。使用時A、B液等體積混合。
[0017] (6)終止：每孔加入終止液（2 111〇1/14504)50 111^溶液終止反應(yīng)，輕輕搖勻，然后 用酶標(biāo)儀檢測每孔在波長450nm下的吸光值（OD45tl ?)。選OD45tlΜ達到I. (Tl. 5時抗血清 的最大稀釋倍數(shù)為抗體的效價。
[0018] 采用間接競爭酶聯(lián)免疫法檢測抗血清中抗體對多效唑的特異性。
[0019] 本發(fā)明的第二個目的是提供抗多效唑多克隆抗體在檢測多效唑中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明所述的抗多效唑多克隆抗體在檢測多效唑中的應(yīng)用，其使用方法為間接競 爭酶聯(lián)免疫法，它所使用的試劑包括酶聯(lián)免疫的常規(guī)試劑、酶標(biāo)板和多效唑多克隆抗體。所 述的酶標(biāo)板是將多效唑半琥珀酸酯與卵清蛋白通過碳二亞酰法偶聯(lián)，將此偶聯(lián)物作為包被 原吸附于固相載體中而形成的。然后在酶標(biāo)板上加入多效唑樣品溶液和抗多效唑多克隆抗 體工作液，樣品中的多效唑就會與固相載體中的包被原競爭吸附有限的抗體。通過洗滌，將 結(jié)合了樣品中游離的多效唑的抗多效唑多克隆抗體洗去，再使用酶標(biāo)二抗標(biāo)記已經(jīng)與包被 原結(jié)合的抗體，顯色后，測定吸光光度值，該值與樣品中多效唑的含量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲 線比較即可得出多效唑的含量。應(yīng)用本方法可以快速、靈敏、簡便地檢測樣品中的多效唑殘 留，適用于大量樣品的快速篩查。因此本發(fā)明的間接競爭酶聯(lián)免疫方法具有使用方便和成 本低廉的優(yōu)點。
[0021] 利用本發(fā)明的抗多效唑多克隆抗體可以檢測蘋果等水果樣品，所述的蘋果樣品經(jīng) 過前處理，即將蘋果樣品勻漿，用乙腈進行振蕩提取，加無水MgSO4脫水，離心將上清液減壓 旋蒸至干，殘留物用甲醇溶解，并用IXPBS緩沖溶液(磷酸鹽緩沖溶液，pH=7. 4,0. 01M)稀 釋10倍，即可進行酶聯(lián)免疫分析。
[0022] 應(yīng)用抗多效唑多克隆抗體檢測蘋果中多效唑殘留量的間接競爭酶聯(lián)免疫方法具 體如下： 1、 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取10g左右勻漿好的蘋果樣品于50mL離心管中，加入20mL乙腈，于迷你振蕩 器上劇烈振蕩2min,然后加入5g無水MgSO4，劇烈振蕩2min后4000rpm離心10min, 將上清液轉(zhuǎn)移到濃縮瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以30 °C減壓蒸干，殘留物用ImL甲醇振蕩溶解， 取100μL用IXPBS緩沖溶液稀釋10倍，即可進行酶聯(lián)免疫分析； 2、 間接競爭酶聯(lián)免疫法 采用方正滴定法測定了檢測抗原的最佳包被濃度(見表1)，同時對ELISA條件中的多 效唑標(biāo)準(zhǔn)溶液中有機溶劑用量、抗血清稀釋液的離子強度和PH值進行了優(yōu)化(見表2)，確 定了最佳工作條件，具體如下： (1) 向96孔酶標(biāo)板的小孔中加入100μL2.2μg/mL包被原溶液，包被原溶液是將檢 測抗原用IXPBS緩沖溶液稀釋得到，4°C過夜； (2) 傾去包被液，用PBST洗板3次，加入300μL5%脫脂牛奶溶于IXPBS，37 °C保濕 封閉Ih; (3) 傾去封閉液，PBST洗板三次。在每孔中先加入50μLIXPBS緩沖液，再加入50 μL多效唑標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，然后加入50μL1:40000稀釋的抗多效唑多克隆抗體工 作液，稀釋液為10XPBS緩沖液，ρΗ=5. 5,同時設(shè)置空白對照為PBS，37 °C保濕溫育45min; (4) 傾去反應(yīng)液，PBST洗板三次，每孔加入100μL酶標(biāo)二抗，37 °C保濕30min; (5) 傾去反應(yīng)液，PBST洗板四次，每孔加入TMB底物顯色液100μL，37 °C保濕避光顯 色 5-10min; (6)每孔加入50μL終止液終止反應(yīng)，輕輕搖勻，然后用酶標(biāo)儀檢測每孔在波長450nm 下的吸光值OD45tlmj0
[0023] 其中：多效唑標(biāo)準(zhǔn)溶液(溶解在含體積比為10%甲醇的IXPBS緩沖溶液中）。
[0024] 10XPBS(0.IM,pH7. 4)=NaCl80g,KH2PO4 2g,Na2HPO4 · 12H20 29g,KCl2 g，蒸饋水定容至1000mL。
[0025] IXPBS(10XPBS稀釋十倍配制）。
[0026] PBST:1XPBS1L，Tween-20 0· 5mL，混勻后使用（現(xiàn)配現(xiàn)用）。
[0027] 終止液（2mol/LH2SO4):取20mL濃硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98 %)，加入160mL蒸餾水 中。
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法，其特征在于：是通過以下技術(shù)實現(xiàn) 的： (1) 半抗原的合成：在4-二甲氨基吡啶的催化作用下，多效唑和琥珀酸酐發(fā)生?；?應(yīng)，引入活性基團羧基和連接臂，得到半抗原，即多效唑半琥珀酸酯； (2) 全抗原的合成：采用碳二亞酰法將多效唑半琥珀酸酯與牛血清蛋白進行偶聯(lián)，得到 免疫全抗原； (3) 多克隆抗體的制備：用合成的全抗原免疫動物，取血，離心得到抗血清，即為多效唑 多克隆抗體。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法，其特征在于： 所述的動物優(yōu)選為Balb/c雌性小鼠，制備的鼠多克隆抗體效價達到1:80000倍。
3. -種多效唑人工抗原和多克隆抗體的制備方法，其特征在于：具體的步驟如下： (1) 多效唑半抗原的合成 分別取1.1 mg多效唑、5~10 mg琥珀酸酐和0.46 mg 4-二甲氨基吡啶，置于玻璃離心 管中，用吡啶做溶劑將三種物質(zhì)混合均勻，氮氣吹干溶劑，將玻璃管置于微波爐中，用中火 在406 W功率下間歇反應(yīng)185min，反應(yīng)結(jié)束后加入1.5 mL氯仿溶解混合物，離心去沉淀，上 清液再加入1.5 mL超純水，迷你振蕩器上混勻1~2 min，分離出氯仿相，氮氣吹干后得到淡 黃色粉末，即為半抗原多效唑半琥珀酸酯； (2) 多效唑免疫抗原的合成 將2mg、5 iimoL多效唑半琥珀酸酯溶于200 yL二甲基甲酰胺中，同時加入N-羥基 琥珀酰亞胺3 mg，碳酰二亞胺:T6 mg，室溫振蕩反應(yīng)完全后，得到溶液1 ;5 mg牛血清蛋白 溶于1.6 mL 1XPBS緩沖溶液，得到溶液2,再將溶液1加入溶液2中，反應(yīng)6 h，反應(yīng)后的 混合物移入透析袋中，用超純水透析3 d，每天更換透析液2次，透析后即得到多效唑免疫 抗原EDC-PAC-HS-BSA，測定其濃度并于-20°C保存?zhèn)溆茫? (3) 多效唑檢測抗原的制備 將2mg、5 iimoL多效唑半琥珀酸酯溶于200 yL二甲基甲酰胺中，同時加入N-羥基琥 拍酰亞胺3~6 mg,碳酰二亞胺6.0 mg,室溫振蕩反應(yīng)完全后，得到溶液1 ;4 mg卵清蛋白溶 于1.6 mL 1XPBS緩沖溶液，得到溶液2,再將溶液1加入溶液2中，反應(yīng)6 h，反應(yīng)后的混 合物移入透析袋中，用超純水透析3 d，每天更換透析液2次，透析后即得到多效唑檢測抗 原EDC-PAC-HS-OVA，測定其濃度并于-20°C保存?zhèn)溆茫? (4) 抗多效唑多克隆抗體的制備 用得到的免疫抗原對體重為15~20 g的雌性Balb/c小鼠進行免疫，每次免疫劑量均 為100 U g/只，第一次免疫采用弗氏完全佐劑與等體積的免疫抗原混合后乳化，腹部皮下 多點注射，之后每間隔3周加強免疫一次，加強免疫采用弗氏不完全佐劑與等體積抗原乳 化后腹部皮下多點注射，從第2次加強免疫開始，在免疫后的第七天斷尾取血，監(jiān)測小鼠抗 血清的效價和特異性當(dāng)抗體的效價和特異性達到要求后，摘除眼球采血，離心后獲得抗血 清，-20°C保存。
4. 一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于：多效唑多克隆抗體在檢測 水果中多效唑的應(yīng)用。
5. 如權(quán)利要求4所述的一種多效唑人工抗原和多克隆抗體的應(yīng)用，其特征在于：應(yīng)用 抗多效唑多克隆抗體檢測蘋果中多效唑殘留量的間接競爭酶聯(lián)免疫方法具體如下： (1) 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取10 g左右勻漿好的蘋果樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，于迷你振蕩 器上劇烈振蕩2 min,然后加入5 g無水MgS04，劇烈振蕩2 min后4000 rpm離心10 min, 將上清液轉(zhuǎn)移到濃縮瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上以30 °C減壓蒸干，殘留物用1 mL甲醇振蕩溶解， 取100 y L用1 XPBS緩沖溶液稀釋10倍，即可進行酶聯(lián)免疫分析； (2) 間接競爭酶聯(lián)免疫法 采用方正滴定法測定了檢測抗原的最佳包被濃度，同時對ELISA條件中的多效唑標(biāo) 準(zhǔn)溶液中有機溶劑用量、抗血清稀釋液的離子強度和pH值進行了優(yōu)化，確定了最佳工作條 件，具體如下： (A) 向96孔酶標(biāo)板的小孔中加入100 y L 2. 2 y g/mL包被原溶液，包被原溶液是將檢 測抗原用1XPBS緩沖溶液稀釋得到，4°C過夜； (B) 傾去包被液，用PBST洗板3次，加入300 ii L 5%脫脂牛奶溶于1 XPBS，37 °C保濕 封閉lh ; (C) 傾去封閉液，PBST洗板三次，在每孔中先加入50 yL 1XPBS緩沖液，再加入50 UL多效唑標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，然后加入50 iiL 1:40000稀釋的抗多效唑多克隆抗體工 作液，稀釋液為10XPBS緩沖液，pH=5. 5,同時設(shè)置空白對照為PBS，37 °C保濕溫育45 min ; (D) 傾去反應(yīng)液，PBST洗板三次，每孔加入100 ii L酶標(biāo)二抗，37 °C保濕30 min ; (E) 傾去反應(yīng)液，PBST洗板四次，每孔加入TMB底物顯色液100 y L，37 °C保濕避光顯 色 5-10 min ; (F) 每孔加入50 yL終止液終止反應(yīng)，輕輕搖勻，然后用酶標(biāo)儀檢測每孔在波長450 nm 下的吸光值〇D45(lnm。
【文檔編號】C07K14/765GK104327183SQ201410599853
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】郭嵐, 萬益群, 劉香香, 鄢愛平, 柳英霞, 譚婷 申請人:南昌大學(xué)