專利名稱：兔抗豬tpo多克隆抗體的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種兔抗豬TPO (甲狀腺過(guò)氧化物酶， thyroid peroxidase)多克隆抗體的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
TPO是一種糖基化血紅素蛋白，是催化甲狀腺激素合成的關(guān)鍵酶。它參與了兩個(gè)重要的反應(yīng)甲狀腺球蛋白酪氨酸殘基的碘化和碘化酪氨酸的偶聯(lián)作用，從而產(chǎn)生T3和T4。 TPO是甲狀腺微粒體抗原的重要組成部分之一，與自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。TPO不僅在甲狀腺細(xì)胞表面表達(dá)，還在胞漿中表達(dá)，是參與補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的細(xì)胞表面抗原，具有特殊的免疫學(xué)特性。正常時(shí)，TPO不會(huì)溢出甲狀腺入血，但當(dāng)甲狀腺發(fā)生病變時(shí)，濾泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)會(huì)受到破壞，TPO就會(huì)由被隔絕于甲狀腺濾泡細(xì)胞腔邊緣向外周血溢漏，并作為AITD —種重要自身抗原刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生甲狀腺組織成分抗體即TPO-Ab， 通過(guò)激活補(bǔ)體和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用對(duì)甲狀腺造成免疫性損傷。目前關(guān)于豬TPO蛋白的抗體尚無(wú)商業(yè)化產(chǎn)品，限制了對(duì)豬TPO蛋白生物學(xué)功能的深入分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種特異性好、純度高、可與甲狀腺細(xì)胞的TPO蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的兔抗豬TPO多克隆抗體的制備及應(yīng)用。本發(fā)明的具體實(shí)施步驟如下
步驟(1).經(jīng)DNAMar軟件分析后，將豬的TPO蛋白N端第95 113位20個(gè)氨基酸作為兔抗豬TPO多克隆抗體抗原表位，氨基酸序列如下 GluThrAlaValGlnGluValLysArgArgValCysArgArgArgAspThrAspGluLeUo步驟O).用多肽自動(dòng)合成儀化學(xué)合成豬的TPO多肽并純化，純化后與載體蛋白 KLH偶聯(lián)，形成豬的TPO多肽-KLH復(fù)合蛋白；
步驟(3).將豬的TPO多肽-KLH復(fù)合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點(diǎn)注射，先后注射三次，每次間隔7 ~ 10天；
步驟第三次注射10 ~ 12天后，收集、分離得到含有兔抗豬TPO多克隆抗體的血清；ELISA檢測(cè)血清中兔抗豬TPO多克隆抗體的效價(jià)；
所述的兔抗豬TPO多克隆抗體，其效價(jià)在1:50000以上；
步驟(5).將步驟( 合成并純化的豬的TPO多肽與溴化氰活化的kpharose 4B偶聯(lián)， 制備多肽親和層析柱；
步驟(6).將含有兔抗豬TPO多肽抗體的血清加入到步驟(5)制備的多肽親和層析柱中，并在4°C孵育過(guò)夜后，洗脫抗體，得到兔抗豬TPO多克隆抗體；
所述的步驟(2)豬的TPO多肽的純化，采用HPLC對(duì)其進(jìn)行純化，使豬的TPO多肽的純度達(dá)到95%以上；
所述的步驟(6)兔抗豬TPO多克隆抗體的純化，采用免疫親和純化的方式。
兔抗豬TPO多克隆抗體應(yīng)用廣泛，可與豬甲狀腺細(xì)胞TPO蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，可用于免疫組化等實(shí)驗(yàn)的要求。本發(fā)明有益效果如下
本發(fā)明制備的抗TPO多克隆抗體具有特異性好、純度高的特點(diǎn)。本發(fā)明兔抗豬TPO多克隆抗體的制備，為深入研究豬TPO蛋白的生物學(xué)功能和在甲狀腺細(xì)胞水平調(diào)控豬的生長(zhǎng)發(fā)育提供了一個(gè)重要工具，具有重要的理論意義和生產(chǎn)價(jià)值。


圖1為本發(fā)明在豬甲狀腺細(xì)胞中的免疫組化染色。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例1
兔抗豬TPO多克隆抗體的制備步驟如下
步驟(1).經(jīng)DNAMar軟件分析后，將豬的TPO蛋白N端第如~ 113位20個(gè)氨基酸作為兔抗豬TPO多克隆抗體抗原表位，氨基酸序列如下
GluThrAlaValGlnGluValLysArgArgValCysArgArgArgAspThrAspGluLeUo步驟O).用多肽自動(dòng)合成儀化學(xué)合成豬的TPO多肽并純化，純化后與載體蛋白 KLH偶聯(lián)，形成豬的TPO多肽-KLH復(fù)合蛋白；
步驟(3).將豬的TPO多肽-KLH復(fù)合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點(diǎn)注射，先后注射三次，每次間隔7 ~ 10天；
步驟第三次注射10 12天后，收集、分離得到含有兔抗豬TPO多克隆抗體的血清；ELISA檢測(cè)血清中兔抗豬TPO多克隆抗體的效價(jià)；
所述的兔抗豬TPO多克隆抗體，其效價(jià)在1:50000以上；
步驟(5).將步驟( 合成并純化的豬的TPO多肽與溴化氰活化的kpharose 4B偶聯(lián)， 制備多肽親和層析柱；
步驟(6).將含有兔抗豬TPO多肽抗體的血清加入到步驟(5)制備的多肽親和層析柱中，并在4°C孵育過(guò)夜后，洗脫抗體，得到兔抗豬TPO多克隆抗體；
所述的步驟(2)豬的TPO多肽的純化，采用HPLC對(duì)其進(jìn)行純化，使豬的TPO多肽的純度達(dá)到95%以上；
所述的步驟(6)兔抗豬TPO多克隆抗體的純化，采用免疫親和純化的方式。兔抗豬TPO多克隆抗體的應(yīng)用步驟如下
步驟(1).取豬甲狀腺組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟入水，0. 3 ) -甲醇浸泡30 ~ 40分鐘， PBS浸洗3次后，0. 1%的凝膠封閉，30-60分鐘后除去多余封閉液；
步驟O).加入兔抗豬TPO多克隆抗體，37°C 1小時(shí)或4°C孵育過(guò)夜； 步驟(3). PBS洗片3次，每次5分鐘，加入羊抗兔IgG-HRP，37°C孵育1小時(shí)； 步驟如圖1所示，PBS洗片后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，返藍(lán)后封片鏡檢，放大 400倍拍照記錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1.兔抗豬TPO多克隆抗體的制備，其特征在于如下步驟步驟(1).經(jīng)DNAMar軟件分析后，將豬的TPO蛋白N端第95 ~ 113位20個(gè)氨基酸作為兔抗豬TPO多克隆抗體抗原表位，氨基酸序列如下 GluThrAlaValGlnGluValLysArgArgValCysArgArgArgAspThrAspGluLeu ； 步驟O).用多肽自動(dòng)合成儀化學(xué)合成豬的TPO多肽并純化，純化后與載體蛋白KLH偶聯(lián)，形成豬的TPO多肽-KLH復(fù)合蛋白；步驟(3).將豬的TPO多肽-KLH復(fù)合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點(diǎn)注射，先后注射三次，每次間隔7 ~ 10天；步驟第三次注射10 ~ 12天后，收集、分離得到含有兔抗豬TPO多克隆抗體的血清；ELISA檢測(cè)血清中兔抗豬TPO多克隆抗體的效價(jià)；所述的兔抗豬TPO多克隆抗體，其效價(jià)在1:50000以上；步驟(5).將步驟( 合成并純化的豬的TPO多肽與溴化氰活化的kpharose 4B偶聯(lián)， 制備多肽親和層析柱；步驟(6).將含有兔抗豬TPO多肽抗體的血清加入到步驟(5)制備的多肽親和層析柱中，并在4°C孵育過(guò)夜后，洗脫抗體，得到兔抗豬TPO多克隆抗體；所述的步驟(2)豬的TPO多肽的純化，采用HPLC對(duì)其進(jìn)行純化，使豬的TPO多肽的純度達(dá)到95%以上；所述的步驟(6)兔抗豬TPO多克隆抗體的純化，采用免疫親和純化的方式。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兔抗豬TPO多克隆抗體的制備后的應(yīng)用，其特征在于該抗體可與豬甲狀腺細(xì)胞TPO蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，可用于免疫組化實(shí)驗(yàn)的要求。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了兔抗豬TPO多克隆抗體的制備與應(yīng)用。目前沒(méi)有兔抗豬TPO多克隆抗體的制備，本發(fā)明方法包括以下步驟1)TPO分子N端多肽抗原的合成；2)兔抗人TPO分子多克隆抗體的制備；3)ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià)；4)抗血清的純化；5)多克隆抗體的免疫組化染色。本發(fā)明具有特異性好、純度高的特點(diǎn)，可與甲狀腺細(xì)胞的TPO蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，可用于免疫組化等試驗(yàn)的要求。
文檔編號(hào)C07K1/22GK102532322SQ20111044977
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者彭靜, 徐寧迎, 李艷玲, 王穎 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)