專利名稱：耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及食品微生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及到耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備及
純化鑒定。
背景技術(shù)：
耐熱菌，學(xué)名酸土環(huán)脂芽孢桿菌(AliyclcAacillua acidoterrestris)，是果汁生產(chǎn)中的常見危害菌，由于其耐熱耐酸特性，能夠經(jīng)受酸性果汁加工中的巴氏殺菌過程而存活，在產(chǎn)品貯藏期，當(dāng)處于休眠狀態(tài)的芽孢在適宜溫度條件下，就會(huì)迅速增殖引起果汁敗壞，嚴(yán)重影響果汁的質(zhì)量安全。因此，耐熱菌是濃縮果汁生產(chǎn)中最重要的目標(biāo)控制微生物之一。關(guān)于果汁中耐熱菌的檢測(cè)，目前主要分為以下三類傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法、基于遺傳物質(zhì)檢測(cè)的PCR法和基于免疫學(xué)的快速檢測(cè)方法。目前，生產(chǎn)企業(yè)多采用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測(cè)耐熱菌，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法最大的缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)，一般檢測(cè)周期為4 5天。PCR法具有快速、特異的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室條件以及操作人員要求高，步驟較繁鎖，推廣應(yīng)用有一定困難?；诿庖叻治鲈淼拿嘎?lián)免疫快速檢測(cè)技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、檢測(cè)設(shè)備及實(shí)驗(yàn)條件易達(dá)到等優(yōu)點(diǎn)，而建立該檢測(cè)方法的關(guān)鍵在于獲得高效價(jià)、高特異性的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、成本低廉的耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法。解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是它由下述步驟組成1、制備耐熱菌菌懸液將耐熱菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(A. acidoterrestris DSM 3922)轉(zhuǎn)接至250mL的402培養(yǎng)基， 置于45°C氣浴中振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，轉(zhuǎn)接至凱氏培養(yǎng)基，41°C培養(yǎng)M小時(shí)，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，3500 5000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用生理鹽水洗滌3次，向沉淀中加入無菌生理鹽水，稀釋成濃度為1. 4X IO8 4X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液。2、耐熱菌免疫SD大鼠將步驟1中制備的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為0. 5 1. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，免疫 63 91天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。3、飽和硫酸銨沉淀法分離抗體向步驟2制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗血清中加入無菌生理鹽水，逐滴加入pH值為8. 0的飽和硫酸銨水溶液，耐熱菌的鼠源多克隆抗血清與無菌生理鹽水、飽和硫酸銨水溶液的體積比為1 1 2，充分搖勻，4°C靜置12小時(shí)，12000 20000轉(zhuǎn)/分鐘離心20
3分鐘，棄去上清液，所得沉淀用生理鹽水溶解，裝入透析袋中透析除鹽。4、G蛋白親和層析純化抗體向透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體中加入0. lmol/L pH值為9. 0的Tris-HCl 緩沖液，調(diào)節(jié)耐熱菌的鼠源多克隆抗體的PH值至8. 0，用G蛋白親和層析柱分離，上樣量與柱體積之比為2 1，流速為ImL/分鐘，上樣完成后用0. lmol/L pH值為8. 0的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白至基線穩(wěn)定，用0. lmol/L pH值為3. 0的檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合的耐熱菌的鼠源多克隆抗體，分別收集雜蛋白和耐熱菌的鼠源多克隆抗體，收集的耐熱菌的鼠源多克隆抗體裝入透析袋中透析除檸檬酸根離子，透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體用平均分子量為6000的聚乙二醇濃縮至與上樣量體積相同。本發(fā)明的耐熱菌免疫SD大鼠步驟2中，優(yōu)選將步驟1中制備的濃度為2X109CFU/ mL的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，注射體積為ImL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行4次追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，免疫63天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。本發(fā)明制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價(jià)可達(dá)到12800，特異性良好，與常見食源性微生物無交叉反應(yīng)，經(jīng)電泳鑒定有較高純度。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，成本低，可用于建立耐熱菌免疫化學(xué)檢測(cè)方法。


圖1是純化前后耐熱菌鼠源多克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例11、制備耐熱菌菌懸液將耐熱菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(A. acidoterrestris DSM 3922)轉(zhuǎn)接至250mL的402培養(yǎng)基， 置于45°C氣浴中振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，轉(zhuǎn)接至凱氏培養(yǎng)基，41°C培養(yǎng)M小時(shí)，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，3500轉(zhuǎn) /分鐘離心30分鐘，棄去上清液，沉淀用生理鹽水洗滌3次，向沉淀中加入無菌生理鹽水，稀釋成濃度為2X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液。2、耐熱菌免疫SD大鼠將2mL耐熱菌菌懸液、2mL免疫佐劑混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為ImL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行4次追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，免疫63天摘除眼球采血， 制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。3、飽和硫酸銨沉淀法分離抗體取步驟2制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗血清2mL，加入2mL無菌生理鹽水，逐滴加入PH值為8.0的飽和硫酸銨水溶液4mL，耐熱菌的鼠源多克隆抗血清與無菌生理鹽水、飽和硫酸銨水溶液的體積比為1:1:2，充分搖勻，4°C靜置12小時(shí)，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，棄去上清液，所得沉淀用生理鹽水溶解，裝入透析袋中透析除鹽。4、G蛋白親和層析純化抗體向2mL透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體中加入0. lmol/L pH值為9.0的 Tris-HCl緩沖液，調(diào)節(jié)耐熱菌的鼠源多克隆抗體的pH值至8. 0，用體積為ImL的G蛋白親和層析柱分離，上樣量為2mL、流速為ImL/分鐘，上樣完成后用0. lmol/L pH值為8. 0的磷酸鹽緩沖液洗脫雜蛋白至基線穩(wěn)定，用0. lmol/L pH值為3. 0的檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合的耐熱菌的鼠源多克隆抗體，分別收集雜蛋白和耐熱菌的鼠源多克隆抗體，收集的耐熱菌的鼠源多克隆抗體裝入透析袋中透析除檸檬酸根離子，透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體用平均分子量為6000的聚乙二醇濃縮至2mL。實(shí)施例2在實(shí)施例1的制備耐熱菌菌懸液步驟1中，將沉淀用無菌生理鹽水稀釋成濃度為1. 4X 108CFU/mL的耐熱菌菌懸液；在耐熱菌免疫SD大鼠步驟2中，將2mL濃度為 1. 4 X 108CFU/mL的耐熱菌菌懸液與2mL免疫佐劑混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為1. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行5次追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，免疫77天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。其他步驟與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3在實(shí)施例1的制備耐熱菌菌懸液步驟1中，將沉淀用無菌生理鹽水稀釋成濃度為 4X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液；在耐熱菌免疫SD大鼠步驟2中，將2mL濃度為4X IO9CFU/ mL的耐熱菌菌懸液與2mL免疫佐劑混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為0. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行6次追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，免疫91天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。其他步驟與實(shí)施例1相同。為了確定本發(fā)明的最佳工藝條件，發(fā)明人進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)室研究試驗(yàn)，每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，各種試驗(yàn)情況如下試驗(yàn)材料與試劑耐熱菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(A. acidoterrestris DSM 3922)，購(gòu)自德國(guó)菌種保藏中心；大腸桿菌(Escherichia coli ATCC8739)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ATCC6633)、蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus ATCC 11778)、黑曲霉(Bacillus subtilis ATCC16404)及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC6538)，由陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗大鼠抗體(Jackson ImmunoResearch)進(jìn)口分裝；TMB(3，3’ 5,5'-四甲基聯(lián)苯胺)，由廣州沃凱化工廠提供；弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑，均購(gòu)自Sigma公司。試驗(yàn)儀器Hitrap Protain G HP由GE Healthcare生產(chǎn)；恒流泵由上海滬西分析儀器廠有限公司生產(chǎn)；電泳儀由北京君意東方電泳設(shè)備有限公司生產(chǎn)；垂直平板凝膠電泳槽由北京六一儀器廠生產(chǎn)；BX41-12P02奧林巴斯顯微鏡，由澤仕光電科技(上海)有限公司生產(chǎn)；UNICO WFJ2000型可見分光光度計(jì)，由上海龍尼柯儀器有限公司生產(chǎn)；U-3010型紫外可見分光光度計(jì)，由日本HITACHI公司生產(chǎn)；GSP-9080-MBE型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)，由上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)； Sff-CJ-IF型超凈操作臺(tái)，由蘇凈集團(tuán)安泰公司生產(chǎn)；HHW-21⑶-600型電熱恒溫水槽，由上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn)；XW-80A漩渦混合儀，由海門市其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)；KQ3200B型超聲波清洗機(jī)，由昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；TDL-4型離心機(jī)，由上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn)；伯樂680型酶標(biāo)儀，由美國(guó)伯樂公司生產(chǎn)；微孔板振蕩器，由杭州奧盛儀器有限公司生產(chǎn)；D25mm透析袋，由北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司；德國(guó)Eppendorf精密微量移液器(10 100 μ L，0. 1 10 μ L，30 300 μ L)。1、確定免疫體積分別將濃度為2Χ 1010CFU/mL,8X 109CFU/mL,4X 109CFU/mL,2X 109CFU/mL, 1.4 X 108CFU/mL的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑等體積混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，注射體積分別為0. ImL/只、0. 25mL/只、0. 5mL/只、 1. OmL/只、1. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行4次追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，每次免疫1周后眼眶采血。采用ELISA法測(cè)定效價(jià)，具體測(cè)定方法如下(1)將耐熱菌標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)接至250mL的402培養(yǎng)基，置于45°C氣浴中振蕩培養(yǎng) 8小時(shí)，轉(zhuǎn)接至凱氏培養(yǎng)基，41°C培養(yǎng)M小時(shí)，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，離心分離，棄去上清液，沉淀用 0. 05mol/L pH值為9. 6的碳酸緩沖液稀釋成濃度為107CFU/mL的耐熱菌菌懸液，向酶標(biāo)板孔內(nèi)加耐熱菌菌懸液，每孔加入100 μ L，置于烘箱中60°C包被2小時(shí)，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗酶標(biāo)板3次，每次5分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。(2)向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入200μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂乳，置于恒溫箱中37°C 保溫封閉2小時(shí)，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗酶標(biāo)板3次，每次5分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。(3)將待測(cè)抗體以 1 100、1 200、1 400、1 800、1 1600、1 3200、 1 6400、1 12800、1 25600、1 51200、1 102400、1 204800 梯度稀釋，每個(gè)樣品按照以上稀釋度各加入酶標(biāo)板的一行，同時(shí)設(shè)定陰性對(duì)照和空白對(duì)照，陰性對(duì)照為正常的大鼠血清，空白對(duì)照為0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，37°C孵育1小時(shí)，保證抗體與包被抗原充分反應(yīng)，甩干酶標(biāo)板，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的0. 01mol/L pH值為 7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗酶標(biāo)板3次，每次5分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干。(4)將辣根過氧化物酶標(biāo)山羊抗大鼠抗體1 3000稀釋，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入 100μ L，37°C孵育1小時(shí)，甩干酶標(biāo)板，用吐溫-20的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 05%的0. 01mol/L pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液沖洗酶標(biāo)板3次，每次5分鐘，輕輕甩盡，在紗布上倒扣輕輕拍干，向酶標(biāo)板孔內(nèi)每孔加入100 μ L底物工作液，在恒溫箱中37°C反應(yīng)20分鐘，加入50 μ L 2mol/ L的硫酸溶液，終止反應(yīng)。上述的底物工作液的配制方法為稱取7. 16g Na2HPO4加蒸餾水定容至IOOmL, 配制成物質(zhì)的量濃度為0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液；稱取2. Ig檸檬酸加蒸餾水定容至IOOmL,配制成物質(zhì)的量濃度為0. lmol/L的檸檬酸溶液；取25. 7mL物質(zhì)的量濃度為 0. 2mol/L的磷酸鹽緩沖溶液和24. 3mL物質(zhì)的量濃度為0. lmol/L的檸檬酸溶液，加蒸餾水定容至IOOmL,搖勻，配制成底物緩沖液；將0. Ig 3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺用IOOmL無水乙醇溶解，加入IOOmL底物緩沖液中，再加入400 μ L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的H2A溶液，搖勻，配制成底物工作液，底物工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。(5)用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)為450nm下測(cè)定樣品孔、陰性對(duì)照孔、空白對(duì)照孔的OD值，按下式計(jì)算P/N值P/N =(樣品孔OD值-空白對(duì)照孔OD值)/(陰性對(duì)照孔OD值-空白對(duì)照孔OD 值)式中2. 1檢出結(jié)果判定為陽(yáng)性，表明抗體效價(jià)大于或等于該孔的稀釋度，在同一行陽(yáng)性結(jié)果中對(duì)應(yīng)的最大稀釋度即為該抗體效價(jià)，P/N < 2. 1檢測(cè)結(jié)果判定為陰性，表明抗體效價(jià)小于或等于該孔的稀釋度。試驗(yàn)結(jié)果見表1。表1免疫體積的選擇
疫時(shí)間/天免疫體積07213549630. ImL/只--1:1001:4001:4001:4000. 25mL/K-1:1001:2001:4001:8001:8000. 5mL/只-1:2001:8001:32001:64001128001. OraL/只-1:4001:16001:32001:64001:128001. 5mL/只-1:2001:4001:8001:6400112800由表1可知，大鼠免疫前耐熱菌的鼠源多克隆抗血清效價(jià)低于ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)的最低稀釋度1 100，表明其為陰性血清。免疫體積不同的個(gè)體血清的效價(jià)都有不同程度的上升；隨著免疫次數(shù)的增加，耐熱菌的鼠源多克隆抗體的效價(jià)逐漸上升。免疫體積為 0. ImL/只和0.25mL/只時(shí)，耐熱菌的鼠源多克隆抗體的效價(jià)分別為1 400和1 800 ；免疫體積為0. 5mL/只、1. OmL/只和1. 5mL/只時(shí)，五次免疫后，大鼠耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價(jià)均達(dá)到1 12800?？紤]到免疫過程對(duì)SD大鼠的影響，每次的免疫量不宜大于1.5mL/ 只，因此本發(fā)明確定免疫體積為0. 5 1. 5mL/只。2、確定免疫SD大鼠次數(shù)將2mL濃度為2 X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液與2mL免疫佐劑混合均勻，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，免疫原體積為1. OmL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行6次追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，每次免疫1周后眼眶采血，采用ELISA法測(cè)定效價(jià)，結(jié)果見表2。表2耐熱菌的鼠源多克隆抗體免疫過程中效價(jià)變化
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由表2可知，大鼠免疫前耐熱菌的鼠源多克隆抗血清效價(jià)低于ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)的最低稀釋度1 100，表明其為陰性血清。初次免疫后不同個(gè)體血清的效價(jià)有不同程度的上升；隨著免疫次數(shù)的增加，耐熱菌的鼠源多克隆抗體的效價(jià)逐漸上升。前三次追加免疫后，耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價(jià)有較快增長(zhǎng)。五次免疫后，4/5的免疫大鼠多克隆抗體效價(jià)達(dá)到1 12800，但第六次和第七次免疫后，多克隆抗體效價(jià)不再上升。因此，本發(fā)明選
權(quán)利要求
1.耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法，其特征在于它由下述步驟組成(1)制備耐熱菌菌懸液將耐熱菌標(biāo)準(zhǔn)菌株轉(zhuǎn)接至250mL的402培養(yǎng)基，置于45°C氣浴中振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，轉(zhuǎn)接至凱氏培養(yǎng)基，41°C培養(yǎng)M小時(shí)，用無菌生理鹽水沖洗凱氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)的耐熱菌，將沖洗下的耐熱菌移至無菌三角錐瓶中充分混勻，離心分離，棄去上清液，沉淀用生理鹽水洗滌，向沉淀中加入無菌生理鹽水，稀釋成濃度為1. 4X IO8 4X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液；(2)耐熱菌免疫SD大鼠將步驟(1)中制備的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化， 通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，注射體積為0. 5 1. 5mL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，免疫63 91天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清；(3)飽和硫酸銨沉淀法分離抗體向步驟(2)制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗血清中加入無菌生理鹽水，逐滴加入pH值為 8. 0的飽和硫酸銨水溶液，耐熱菌的鼠源多克隆抗血清與無菌生理鹽水、飽、和硫酸銨水溶液的體積比為1 1 2，充分搖勻，4°C靜置12小時(shí)，離心分離，棄去上清液，所得沉淀用生理鹽水溶解，裝入透析袋中透析；(4)G蛋白親和層析純化抗體向透析后的耐熱菌的鼠源多克隆抗體中加入0. lmol/L pH值為9. 0的Tris-HCl緩沖液，調(diào)節(jié)耐熱菌的鼠源多克隆抗體的PH值至8. 0，用G蛋白親和層析柱分離，上樣量與柱體積之比為2 1，流速為ImL/分鐘，上樣完成后用0. lmol/L pH值為8. 0的磷酸鹽緩沖液洗脫至基線穩(wěn)定，用0. lmol/L pH值為3. 0的檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合的耐熱菌的鼠源多克隆抗體，收集耐熱菌的鼠源多克隆抗體，裝入透析袋中透析，用平均分子量為6000的聚乙二醇濃縮至與上樣量體積相同。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法，其特征在于在耐熱菌免疫SD大鼠步驟O)中，將步驟(1)中制備的濃度為2X 109CFU/mL的耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠， 注射體積為ImL/只，首次免疫采用弗氏完全佐劑，然后用弗氏不完全佐劑進(jìn)行4次追加免疫，每次免疫的時(shí)間間隔為兩周，免疫63天摘除眼球采血，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清。
全文摘要
一種耐熱菌的鼠源多克隆抗體的制備方法，將耐熱菌標(biāo)準(zhǔn)菌株通過培養(yǎng)基培養(yǎng)，制成1.4×108～4×109CFU/mL的耐熱菌菌懸液，然后將耐熱菌菌懸液與免疫佐劑按等體積混合，超聲振蕩至充分乳化，通過背部肌肉多點(diǎn)注射免疫雄性SD大鼠，免疫63～91天摘除眼球采血，制成耐熱菌的鼠源多克隆抗血清，再采用飽和硫酸銨沉淀法和G蛋白親和層析對(duì)耐熱菌的鼠源多克隆抗血清分別進(jìn)行分離、純化，制備成耐熱菌的鼠源多克隆抗體。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，成本低，所制備的耐熱菌的鼠源多克隆抗體效價(jià)可達(dá)到12800，特異性良好，與常見食源性微生物無交叉反應(yīng)，經(jīng)電泳鑒定有較高純度，可用于建立耐熱菌免疫化學(xué)檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C07K1/22GK102432682SQ20111042771
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者夏凱, 李建科 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)