本發(fā)明屬于組織工程領(lǐng)域，具體涉及一種自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為黑色素細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：

白癜風(fēng)是一種常見的原發(fā)性局限或泛發(fā)的皮膚色素脫失性疾病，由皮膚的黑色素細(xì)胞功能消失引起，目前機(jī)制尚不清楚。其發(fā)病率約為1%。白癜風(fēng)患者可能在社會上遭到歧視，給患者帶來巨大的心理壓力，嚴(yán)重影響了患者的正常生活。

目前對于白癜風(fēng)的治療，多種多樣，例如藥物治療、光化學(xué)治療、紫外線治療、激光治療、外科皮膚移植治療、細(xì)胞移植治療等。但上述方法對局部小面積癥狀患者療效較好，而對于四肢、軀干等大面積癥狀則療效不理想。

新近開發(fā)出來的自體黑色素細(xì)胞培養(yǎng)移植是一種有效的治療方法，其通過外科手術(shù)獲得患者正常皮膚或毛囊組織，分出其中的黑色素細(xì)胞，體外大量培養(yǎng)，之后再移植至患處。其對于較大面積的皮損具有較好的療效。然而這種方法需要通過手術(shù)獲取患者正常組織的皮膚或毛囊，給患者增加了額外的痛苦，同時由于種子細(xì)胞的來源受限，自體表皮黑色素細(xì)胞培養(yǎng)移植也具有一定局限性。

另一方面，近年來，人脂肪組織間充質(zhì)干細(xì)胞（adscs）引起科學(xué)工作者廣泛的關(guān)注。其易于獲得，對正常組織無影響，產(chǎn)率高，易培養(yǎng)；具有多能性，可分化成各種組織細(xì)胞，在組織工程學(xué)中，常被用來作為種子細(xì)胞。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的產(chǎn)率低、不易培養(yǎng)的缺陷，提供一種自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為黑色素細(xì)胞的方法來解決上述問題。

本發(fā)明公開了一種自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為黑色素細(xì)胞的方法，具體步驟為：

一、黑色素細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備：

（1）、取第五代人表皮黑色素細(xì)胞株接種于含有30ml黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，接種密度為5×10³/ml；

（2）、觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，進(jìn)入快速生長期后，予以低劑量窄譜紫外線照射（nb-uvb）,強(qiáng)度為0.5j/cm²，時間為26-34s；

（3）、24h后收集上清，離心5min；

（4）、將上清用0.22μm孔徑濾膜過濾除菌，即制得黑素細(xì)胞條件培養(yǎng)基，4℃避光保存，備用；

二、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：

（5）、通過外科方式獲得脂肪組織；

（6）、用外科手術(shù)剪把脂肪組織剪碎成1mm³的小塊；

（7）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型膠原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培養(yǎng)基10ml，在37℃的條件下，消化55-65min；

（8）、吹打上述細(xì)胞懸液4-5次，在室溫條件下，以860×g的轉(zhuǎn)速，離心10min；

（9）、吸棄上層懸浮脂肪顆粒和成熟脂肪細(xì)胞，獲取底部細(xì)胞團(tuán)，采用pbs溶液重懸細(xì)胞，并用100μm孔徑濾膜過濾；

（10）、對細(xì)胞濾液計數(shù)，加入過量的1×bdimag?buffer，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清；

（11）、把cd31磁珠徹底渦旋均勻，然后每1×10⁷個細(xì)胞加50μlcd31磁珠，混合均勻后，在30℃的條件下孵育25-35min；

（12）、用bdimag?buffer把體系調(diào)整到1-8×10⁷個/ml細(xì)胞之后，迅速把標(biāo)記好的體系放到磁力架上孵育8-10分鐘；

（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液體上清，上清細(xì)胞為cd31-細(xì)胞，此時即為去除了內(nèi)皮細(xì)胞后，純化的脂肪干細(xì)胞；

（14）、在1500rpm條件下，將上清液離心2-8min，棄上清；

（15）、將上述細(xì)胞置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中，用10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2次；

（16）、細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，加入pbs液，在1500rpm條件下離心2-8min，棄上清，再加入pbs液，在1500rpm條件下離心2-8min，棄上清；

（17）、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（18）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用高糖dmem培養(yǎng)基洗3次；

（19）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

三、黑色素細(xì)胞定向分化

（20）、第4代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以5×10⁴/ml密度接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶；

（21）、細(xì)胞生長至80%融合度后，吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，加入等體積的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于37℃，5%的co2溫箱進(jìn)行培養(yǎng)；

（22）、細(xì)胞生長至90%融合度時，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)基終止消化；

（23）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗3次；

（24）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)；

（25）、培養(yǎng)至第6周，予以低劑量nb-uvb照射，強(qiáng)度為0.5j/cm²，時間為30s，每周一次，至第10周為止，即可。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的人表皮黑色素細(xì)胞株和黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基均購自上海拜沃生物公司。

作為優(yōu)選，所述的步驟（3）中，離心速度為1500rpm。

作為優(yōu)選，所述的步驟（5）中，所述的脂肪組織的體積為20cm³。

作為優(yōu)選，所述的步驟（15）中，所述的dmem培養(yǎng)基中含10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸慶大霉素。

作為優(yōu)選，所述的步驟（21）中，所述的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為m254，含10%（v/v）fbs、10%（v/v）黑素細(xì)胞條件培養(yǎng)基、5ng/mlwnt-3a、0.05μm地塞米松、1×胰島素鐵硒傳遞蛋白、1mg/mlla-bsa（亞油酸-牛血清白蛋白）、10^-4m抗壞血酸、100nmet-3（內(nèi)皮素-3）、50ng/mlscf（干細(xì)胞因子）、20pmct(霍亂毒素)、50nmtpa(佛波醇酯)、4ng/mlbfgf（堿性成纖維細(xì)胞生長因子），以及40u/ml硫酸慶大霉素。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

1、選取自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞的來源，來源廣泛，不受限制；

2、本發(fā)明通過bdimag?系統(tǒng)獲得高純度的adscs細(xì)胞；

3、本發(fā)明應(yīng)用黑色素細(xì)胞條件培養(yǎng)基，其中含有大量的黑色素細(xì)胞分泌物，可作為誘導(dǎo)因子，

4、誘導(dǎo)過程中，采用窄譜紫外線低劑量照射培養(yǎng)細(xì)胞，促進(jìn)黑色素細(xì)胞成熟，提高了adscs向黑色素細(xì)胞分化率。

具體實(shí)施方式

下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

本發(fā)明公開了一種自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為黑色素細(xì)胞的方法，具體步驟為：

一、黑色素細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備：

（1）、取第五代人表皮黑色素細(xì)胞株接種于含有30ml黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，接種密度為5×10³/ml；

（2）、觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，進(jìn)入快速生長期后，予以低劑量窄譜紫外線照射（nb-uvb）,強(qiáng)度為0.5j/cm²，時間為26-34s；

（3）、24h后收集上清，離心5min；

（4）、將上清用0.22μm孔徑濾膜過濾除菌，即制得黑素細(xì)胞條件培養(yǎng)基，4℃避光保存，備用；

二、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：

（5）、通過外科方式獲得脂肪組織；

（6）、用外科手術(shù)剪把脂肪組織剪碎成1mm³的小塊；

（7）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型膠原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培養(yǎng)基10ml，在37℃的條件下，消化55-65min；

（8）、吹打上述細(xì)胞懸液4-5次，在室溫條件下，以860×g的轉(zhuǎn)速，離心10min；

（9）、吸棄上層懸浮脂肪顆粒和成熟脂肪細(xì)胞，獲取底部細(xì)胞團(tuán)，采用pbs溶液重懸細(xì)胞，并用100μm孔徑濾膜過濾；

（10）、對細(xì)胞濾液計數(shù)，加入過量的1×bdimag?buffer，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清；

（11）、把cd31磁珠徹底渦旋均勻，然后每1×10⁷個細(xì)胞加50μlcd31磁珠，混合均勻后，在30℃的條件下孵育25-35min；

（12）、用bdimag?buffer把體系調(diào)整到1-8×10⁷個/ml細(xì)胞之后，迅速把標(biāo)記好的體系放到磁力架上孵育8-10分鐘；

（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液體上清，上清細(xì)胞為cd31-細(xì)胞，此時即為去除了內(nèi)皮細(xì)胞后，純化的脂肪干細(xì)胞；

（14）、在1500rpm條件下，將上清液離心2-8min，棄上清；

（15）、將上述細(xì)胞置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中，用10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2次；

（16）、細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，加入pbs液，在1500rpm條件下離心2-8min，棄上清，再加入pbs液，在1500rpm條件下離心2-8min，棄上清；

（17）、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（18）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用高糖dmem培養(yǎng)基洗3次；

（19）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

三、黑色素細(xì)胞定向分化

（20）、第4代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以5×10⁴/ml密度接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶；

（21）、細(xì)胞生長至80%融合度后，吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，加入等體積的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于37℃，5%的co2溫箱進(jìn)行培養(yǎng)；

（22）、細(xì)胞生長至90%融合度時，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2-3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)基終止消化；

（23）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗3次；

（24）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)；

（25）、培養(yǎng)至第6周，予以低劑量nb-uvb照射，強(qiáng)度為0.5j/cm²，時間為30s，每周一次，至第10周為止，即可。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的人表皮黑色素細(xì)胞株和黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基均購自上海拜沃生物公司。

作為優(yōu)選，所述的步驟（3）中，離心速度為1500rpm。

作為優(yōu)選，所述的步驟（5）中，所述的脂肪組織的體積為20cm³。

作為優(yōu)選，所述的步驟（15）中，所述的dmem培養(yǎng)基中含10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸慶大霉素。

作為優(yōu)選，所述的步驟（21）中，所述的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為m254，含10%（v/v）fbs、10%（v/v）黑素細(xì)胞條件培養(yǎng)基、5ng/mlwnt-3a、0.05μm地塞米松、1×胰島素鐵硒傳遞蛋白、1mg/mlla-bsa（亞油酸-牛血清白蛋白）、10^-4m抗壞血酸、100nmet-3（內(nèi)皮素-3）、50ng/mlscf（干細(xì)胞因子）、20pmct(霍亂毒素)、50nmtpa(佛波醇酯)、4ng/mlbfgf（堿性成纖維細(xì)胞生長因子），以及40u/ml硫酸慶大霉素。

實(shí)施例1

本發(fā)明公開了一種自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為黑色素細(xì)胞的方法，具體步驟為：

一、黑色素細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備：

（1）、取第五代人表皮黑色素細(xì)胞株接種于含有30ml黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，接種密度為5×10³/ml；

（2）、觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，進(jìn)入快速生長期后，予以低劑量窄譜紫外線照射（nb-uvb）,強(qiáng)度為0.5j/cm²，時間為30s；

（3）、24h后收集上清，離心5min；

（4）、將上清用0.22μm孔徑濾膜過濾除菌，即制得黑素細(xì)胞條件培養(yǎng)基，4℃避光保存，備用；

二、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：

（5）、通過外科方式獲得脂肪組織；

（6）、用外科手術(shù)剪把脂肪組織剪碎成1mm³的小塊；

（7）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型膠原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培養(yǎng)基10ml，在37℃的條件下，消化60min；

（8）、吹打上述細(xì)胞懸液4次，在室溫條件下，以860×g的轉(zhuǎn)速，離心10min；

（9）、吸棄上層懸浮脂肪顆粒和成熟脂肪細(xì)胞，獲取底部細(xì)胞團(tuán)，采用pbs溶液重懸細(xì)胞，并用100μm孔徑濾膜過濾；

（10）、對細(xì)胞濾液計數(shù)，加入過量的1×bdimag?buffer，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清；

（11）、把cd31磁珠徹底渦旋均勻，然后每1×10⁷個細(xì)胞加50μlcd31磁珠，混合均勻后，在30℃的條件下孵育30min；

（12）、用bdimag?buffer把體系調(diào)整到1-8×10⁷個/ml細(xì)胞之后，迅速把標(biāo)記好的體系放到磁力架上孵育10分鐘；

（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液體上清，上清細(xì)胞為cd31-細(xì)胞，此時即為去除了內(nèi)皮細(xì)胞后，純化的脂肪干細(xì)胞；

（14）、在1500rpm條件下，將上清液離心5min，棄上清；

（15）、將上述細(xì)胞置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中，用10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2次；

（16）、細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，加入pbs液，在1500rpm條件下離心5min，棄上清，再加入pbs液，在1500rpm條件下離心5min，棄上清；

（17）、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（18）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用高糖dmem培養(yǎng)基洗3次；

（19）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

三、黑色素細(xì)胞定向分化

（20）、第4代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以5×10⁴/ml密度接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶；

（21）、細(xì)胞生長至80%融合度后，吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，加入等體積的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于37℃，5%的co2溫箱進(jìn)行培養(yǎng)；

（22）、細(xì)胞生長至90%融合度時，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)基終止消化；

（23）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗3次；

（24）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)；

（25）、培養(yǎng)至第6周，予以低劑量nb-uvb照射，強(qiáng)度為0.5j/cm²，時間為30s，每周一次，至第10周為止，即可。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的人表皮黑色素細(xì)胞株和黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基均購自上海拜沃生物公司。

作為優(yōu)選，所述的步驟（3）中，離心速度為1500rpm。

作為優(yōu)選，所述的步驟（5）中，所述的脂肪組織的體積為20cm³。

作為優(yōu)選，所述的步驟（15）中，所述的dmem培養(yǎng)基中含10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸慶大霉素。

作為優(yōu)選，所述的步驟（21）中，所述的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為m254，含10%（v/v）fbs、10%（v/v）黑素細(xì)胞條件培養(yǎng)基、5ng/mlwnt-3a、0.05μm地塞米松、1×胰島素鐵硒傳遞蛋白、1mg/mlla-bsa（亞油酸-牛血清白蛋白）、10^-4m抗壞血酸、100nmet-3（內(nèi)皮素-3）、50ng/mlscf（干細(xì)胞因子）、20pmct(霍亂毒素)、50nmtpa(佛波醇酯)、4ng/mlbfgf（堿性成纖維細(xì)胞生長因子），以及40u/ml硫酸慶大霉素。

實(shí)施例2

本發(fā)明公開了一種自體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化為黑色素細(xì)胞的方法，具體步驟為：

一、黑色素細(xì)胞條件培養(yǎng)基制備：

（1）、取第五代人表皮黑色素細(xì)胞株接種于含有30ml黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基的t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶，接種密度為5×10³/ml；

（2）、觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，進(jìn)入快速生長期后，予以低劑量窄譜紫外線照射（nb-uvb）,強(qiáng)度為0.5j/cm²，時間為32s；

（3）、24h后收集上清，離心5min；

（4）、將上清用0.22μm孔徑濾膜過濾除菌，即制得黑素細(xì)胞條件培養(yǎng)基，4℃避光保存，備用；

二、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：

（5）、通過外科方式獲得脂肪組織；

（6）、用外科手術(shù)剪把脂肪組織剪碎成1mm³的小塊；

（7）、用含有0.01%（m/v）ⅰ型膠原酶和0.05%（m/v）中性蛋白酶的高糖dmem培養(yǎng)基10ml，在37℃的條件下，消化57min；

（8）、吹打上述細(xì)胞懸液4次，在室溫條件下，以860×g的轉(zhuǎn)速，離心10min；

（9）、吸棄上層懸浮脂肪顆粒和成熟脂肪細(xì)胞，獲取底部細(xì)胞團(tuán)，采用pbs溶液重懸細(xì)胞，并用100μm孔徑濾膜過濾；

（10）、對細(xì)胞濾液計數(shù)，加入過量的1×bdimag?buffer，在1500rpm的條件下，離心5min，棄上清；

（11）、把cd31磁珠徹底渦旋均勻，然后每1×10⁷個細(xì)胞加50μlcd31磁珠，混合均勻后，在30℃的條件下孵育28min；

（12）、用bdimag?buffer把體系調(diào)整到7×10⁷個/ml細(xì)胞之后，迅速把標(biāo)記好的體系放到磁力架上孵育9分鐘；

（13）、吸出磁力架上的流式管里面的液體上清，上清細(xì)胞為cd31-細(xì)胞，此時即為去除了內(nèi)皮細(xì)胞后，純化的脂肪干細(xì)胞；

（14）、在1500rpm條件下，將上清液離心6min，棄上清；

（15）、將上述細(xì)胞置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中，用10mldmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每周換液2次；

（16）、細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上后，吸干培養(yǎng)液，加入pbs液，在1500rpm條件下離心3min，棄上清，再加入pbs液，在1500rpm條件下離心3min，棄上清；

（17）、向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱2min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml高糖dmem培養(yǎng)基終止消化；

（18）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用高糖dmem培養(yǎng)基洗3次；

（19）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用含有10%（v/v）fbs，40u/ml硫酸慶大霉素的dmem培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；

三、黑色素細(xì)胞定向分化

（20）、第4代脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，以5×10⁴/ml密度接種于t75細(xì)胞培養(yǎng)瓶；

（21）、細(xì)胞生長至80%融合度后，吸干細(xì)胞培養(yǎng)液，加入等體積的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于37℃，5%的co2溫箱進(jìn)行培養(yǎng)；

（22）、細(xì)胞生長至90%融合度時，吸干培養(yǎng)液，用pbs液輕洗細(xì)胞，向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入胰蛋白酶-edta溶液，直至覆蓋所有細(xì)胞為止，然后置于37℃，5%的co2溫箱3min后，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞回縮，細(xì)胞間隙增大，再向培養(yǎng)瓶里加入10ml黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)基終止消化；

（23）、用吸管反復(fù)吹打瓶底，使細(xì)胞脫落，再將細(xì)胞懸液在1200rpm條件下，離心7min，采用黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基洗3次；

（24）、將細(xì)胞按1:3比例分瓶傳代，并用黑色素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)；

（25）、培養(yǎng)至第6周，予以低劑量nb-uvb照射，強(qiáng)度為0.5j/cm²，時間為30s，每周一次，至第10周為止，即可。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中，所述的人表皮黑色素細(xì)胞株和黑素細(xì)胞完全培養(yǎng)基均購自上海拜沃生物公司。

作為優(yōu)選，所述的步驟（3）中，離心速度為1500rpm。

作為優(yōu)選，所述的步驟（5）中，所述的脂肪組織的體積為20cm³。

作為優(yōu)選，所述的步驟（15）中，所述的dmem培養(yǎng)基中含10%（v/v）fbs和40u/ml硫酸慶大霉素。

作為優(yōu)選，所述的步驟（21）中，所述的黑素細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為m254，含10%（v/v）fbs、10%（v/v）黑素細(xì)胞條件培養(yǎng)基、5ng/mlwnt-3a、0.05μm地塞米松、1×胰島素鐵硒傳遞蛋白、1mg/mlla-bsa（亞油酸-牛血清白蛋白）、10^-4m抗壞血酸、100nmet-3（內(nèi)皮素-3）、50ng/mlscf（干細(xì)胞因子）、20pmct(霍亂毒素)、50nmtpa(佛波醇酯)、4ng/mlbfgf（堿性成纖維細(xì)胞生長因子），以及40u/ml硫酸慶大霉素。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。