本發(fā)明涉及昆蟲細胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

近年來，昆蟲細胞培養(yǎng)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于昆蟲生理學(xué)、昆蟲病理學(xué)、昆蟲毒理學(xué)、分子遺傳學(xué)、發(fā)育學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)等領(lǐng)域。自1962年grace建立按蠶蛾（anteraeaeucalypti）卵巢細胞系以來，特別是smith等創(chuàng)建了昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)（baculoviusexpressionvectorsystem,bevs）之后，使得昆蟲細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用得到了極大的擴展。目前，在全世界建立的所有昆蟲細胞系中,大部分來源于鱗翅目和雙翅目,其中而來源于鞘翅目昆蟲的細胞系僅占3%左右。鞘翅目昆蟲應(yīng)用廣泛，與人類生活生產(chǎn)息息相關(guān)，如用于中藥、食品、營養(yǎng)物質(zhì)及化學(xué)物質(zhì)的提取等方面，有著重要的經(jīng)濟價值。鞘翅目是昆蟲綱種類最多、分布最廣的第一大目，若建立更多來自鞘翅目的昆蟲細胞系，這將極大地推進對鞘翅目昆蟲相關(guān)生物學(xué)的研究及應(yīng)用。

黃粉蟲，又叫面包蟲，屬鞘翅目，擬步行蟲科，粉蟲甲屬。黃粉蟲是一類倉儲害蟲，但同時也是一種生理、遺傳學(xué)實驗材料。黃粉蟲具有抗病力強、耐寒性強、生長發(fā)育快等特點。與此同時，由于黃粉蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)含量豐富，不僅可以作為許多動物的活餌料，還可作為人類的食品和保健品。目前，有關(guān)黃粉蟲細胞的體外培養(yǎng)的僅限于脂肪體細胞，并無其他相關(guān)報道。因此，建立起一種黃粉蟲胚胎細胞的離體培養(yǎng)方法，使得黃粉蟲獲得更高的利用價值，這具有重要的社會和經(jīng)濟效益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡便、培養(yǎng)方便、細胞成活率高的黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法。

為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

⑴黃粉蟲蟲卵的收集：將黃粉蟲成蟲置于7~12目篩，篩底部鋪滿飼料，使飼料與篩底相接觸，在25℃~28℃條件下，避光產(chǎn)卵；次日，從飼料中16~20目篩篩取蟲卵，然后剔除蟲卵中雜質(zhì)；在25℃~28℃條件下，孵育3~7天，獲得孵育后黃粉蟲蟲卵；

⑵黃粉蟲蟲卵的滅菌：無菌條件下，將900~1100粒顆粒飽滿所述孵育后黃粉蟲蟲卵裹于雙層無菌紗布，先浸于質(zhì)量濃度為10%的naclo溶液中消毒6min~8min，然后浸于體積濃度為75%的酒精消毒5min~6min，接著用至終濃度為200u/ml雙抗和2.5μg/ml兩性霉素b的無菌水沖洗2~4次，再用grace’s昆蟲培養(yǎng)基漂洗1~4次，獲得無菌蟲卵；

⑶獲取黃粉蟲胚胎的組織和細胞：在無菌條件下，用鑷子將所述無菌蟲卵從紗布上挑至孔徑為100μm的細胞篩，并將該細胞篩置于培養(yǎng)皿中，加入8~10ml細胞培養(yǎng)液，用橡膠頭研碎卵粒，獲得細胞濾液；

⑷黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)：吸取2.5ml所述細胞濾液移入裝有2.5ml細胞培養(yǎng)液的t-25cm²培養(yǎng)瓶中，置于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔7~14d天更換60%~80%的細胞培養(yǎng)液，15~40天后即可得到貼壁生長的黃粉蟲胚胎細胞群；

⑸黃粉蟲胚胎細胞的傳代培養(yǎng)：棄去原代細胞培養(yǎng)液，在所述黃粉蟲胚胎細胞群中加入2ml質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋酶-edta消化液，室溫消化30min，倒掉消化液，加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，吹打分散細胞，獲得細胞懸液；將所述細胞懸液全部移入新t-25cm²培養(yǎng)瓶，再加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，放于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，7~10天后，細胞貼滿平底，即可進行下次傳代。

所述步驟⑴中飼料是指玉米粉與面粉按3：2的質(zhì)量比混合而成的混合物。

所述步驟⑶~所述步驟⑸中的細胞培養(yǎng)液是指將79mlgrace’s昆蟲培養(yǎng)基、1ml1萬個單位的雙抗、20ml胎牛血清，混合均勻而得。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明采用飼料與篩底相接處的方法篩取蟲卵和無菌紗布包裹消毒方法，降低了勞動強度，減少了試驗步驟，因此，操作簡便、方法易行。

2、本發(fā)明采用黃粉蟲胚胎組織作為原料，細胞分化程度較低，增殖能力強，重復(fù)性好且細胞成活率高。經(jīng)測試，細胞成活率高于90%。

3、本發(fā)明建立了黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法，培養(yǎng)效果良好，是對鞘翅目昆蟲細胞培養(yǎng)的重要補充。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明。

圖1為本發(fā)明的挑選干凈的黃粉蟲蟲卵。

圖2為本發(fā)明孵化3天蟲卵培養(yǎng)25天后胚胎細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖。

圖3為本發(fā)明孵化4天蟲卵培養(yǎng)35天后胚胎細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖。

圖4為本發(fā)明孵化7天蟲卵培養(yǎng)7天后胚胎細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖。

圖5為本發(fā)明孵化7天蟲卵培養(yǎng)15天后胚胎細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖。

圖6為本發(fā)明孵化7天蟲卵傳代胚胎細胞的培養(yǎng)形態(tài)圖。

具體實施方式

實施例1一種黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

⑴黃粉蟲蟲卵的收集：將黃粉蟲成蟲置于10目篩，篩底部鋪滿飼料，使飼料與篩底相接觸，在25℃~28℃條件下，避光產(chǎn)卵；次日，從飼料中18目篩篩取蟲卵，然后剔除蟲卵中雜質(zhì)；在25℃~28℃條件下，孵育3天，獲得孵育后黃粉蟲蟲卵，如圖1。

其中：飼料是指玉米粉與面粉按3：2的質(zhì)量比（kg/kg）混合而成的混合物。

⑵黃粉蟲蟲卵的滅菌：無菌條件下，將1000粒顆粒飽滿孵育后黃粉蟲蟲卵裹于雙層無菌紗布，先浸于質(zhì)量濃度為10%的naclo溶液中消毒6min，然后浸于體積濃度為75%的酒精消毒5min，接著用至終濃度為200u/ml雙抗和2.5μg/ml兩性霉素b的無菌水沖洗3次，再用grace’s昆蟲培養(yǎng)基漂洗1次，獲得無菌蟲卵。

其中：雙抗、兩性霉素b分別購置于索萊寶生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。

⑶獲取黃粉蟲胚胎的組織和細胞：在無菌條件下，用鑷子將無菌蟲卵從紗布上挑至孔徑為100μm的細胞篩，并將該細胞篩置于培養(yǎng)皿（35mm）中，加入8ml細胞培養(yǎng)液，用橡膠頭研碎卵粒，獲得細胞濾液。

其中：細胞培養(yǎng)液是指將79mlgrace’s昆蟲培養(yǎng)基、1ml1萬個單位的雙抗、20ml胎牛血清，混合均勻而得。

⑷黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)：吸取2.5ml細胞濾液移入裝有2.5ml細胞培養(yǎng)液的t-25cm²培養(yǎng)瓶中，置于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔7d天更換60%~80%的細胞培養(yǎng)液，25天后即可得到貼壁生長的黃粉蟲胚胎細胞群，如圖2。經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，細胞活率大于90%。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

⑸黃粉蟲胚胎細胞的傳代培養(yǎng)：棄去原代細胞培養(yǎng)液，在黃粉蟲胚胎細胞群中加入2ml質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋酶-edta消化液，室溫消化30min，倒掉消化液，加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，吹打分散細胞，獲得細胞懸液；將所述細胞懸液全部移入新t-25cm²培養(yǎng)瓶，再加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，放于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，10天后，細胞貼滿平底，即可進行下次傳代，如圖6所示。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

實施例2一種黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

⑴黃粉蟲蟲卵的收集：將黃粉蟲成蟲置于10目篩，篩底部鋪滿飼料，使飼料與篩底相接觸，在25℃~28℃條件下，避光產(chǎn)卵；次日，從飼料中18目篩篩取蟲卵，然后剔除蟲卵中雜質(zhì)；在25℃~28℃條件下，孵育4天，獲得孵育后黃粉蟲蟲卵。

其中：飼料是指玉米粉與面粉按3：2的質(zhì)量比（kg/kg）混合而成的混合物。

⑵黃粉蟲蟲卵的滅菌：無菌條件下，將1000粒顆粒飽滿孵育后黃粉蟲蟲卵裹于雙層無菌紗布，先浸于質(zhì)量濃度為10%的naclo溶液中消毒6min，然后浸于體積濃度為75%的酒精消毒5min，接著用至終濃度為200u/ml雙抗和2.5μg/ml兩性霉素b的無菌水沖洗3次，再用grace’s昆蟲培養(yǎng)基漂洗1次，獲得無菌蟲卵。

其中：雙抗、兩性霉素b分別購置于索萊寶生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。

⑶獲取黃粉蟲胚胎的組織和細胞：在無菌條件下，用鑷子將無菌蟲卵從紗布上挑至孔徑為100μm的細胞篩，并將該細胞篩置于培養(yǎng)皿（35mm）中，加入8ml細胞培養(yǎng)液，用橡膠頭研碎卵粒，獲得細胞濾液。

其中：細胞培養(yǎng)液同實施例1。

⑷黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)：吸取2.5ml細胞濾液移入裝有2.5ml細胞培養(yǎng)液的t-25cm²培養(yǎng)瓶中，置于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔7d天更換60%~80%的細胞培養(yǎng)液，35天后即可得到貼壁生長的黃粉蟲胚胎細胞群，如圖3。經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，細胞活率大于90%。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

⑸黃粉蟲胚胎細胞的傳代培養(yǎng)：棄去原代細胞培養(yǎng)液，在黃粉蟲胚胎細胞群中加入2ml質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋酶-edta消化液，室溫消化30min，倒掉消化液，加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，吹打分散細胞，獲得細胞懸液；將所述細胞懸液全部移入新t-25cm²培養(yǎng)瓶，再加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，放于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，10天后，細胞貼滿平底，即可進行下次傳代。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

實施例3一種黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

⑴黃粉蟲蟲卵的收集：將黃粉蟲成蟲置于10目篩，篩底部鋪滿飼料，使飼料與篩底相接觸，在25℃~28℃條件下，避光產(chǎn)卵；次日，從飼料中18目篩篩取蟲卵，然后剔除蟲卵中雜質(zhì)；在25℃~28℃條件下，孵育7天，獲得孵育后黃粉蟲蟲卵。

其中：飼料是指玉米粉與面粉按3：2的質(zhì)量比（kg/kg）混合而成的混合物。

⑵黃粉蟲蟲卵的滅菌：無菌條件下，將900粒顆粒飽滿孵育后黃粉蟲蟲卵裹于雙層無菌紗布，先浸于質(zhì)量濃度為10%的naclo溶液中消毒6min，然后浸于體積濃度為75%的酒精消毒5min，接著用至終濃度為200u/ml雙抗和2.5μg/ml兩性霉素b的無菌水沖洗3次，再用grace’s昆蟲培養(yǎng)基漂洗1次，獲得無菌蟲卵。

其中：雙抗、兩性霉素b分別購置于索萊寶生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。

⑶獲取黃粉蟲胚胎的組織和細胞：在無菌條件下，用鑷子將無菌蟲卵從紗布上挑至孔徑為100μm的細胞篩，并將該細胞篩置于培養(yǎng)皿（35mm）中，加入8ml細胞培養(yǎng)液，用橡膠頭研碎卵粒，獲得細胞濾液。

其中：細胞培養(yǎng)液同實施例1。

⑷黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)：吸取2.5ml細胞濾液移入裝有2.5ml細胞培養(yǎng)液的t-25cm²培養(yǎng)瓶中，置于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔7d天更換60%~80%的細胞培養(yǎng)液，第7天后，大量細胞團塊貼壁，并在其周圍遷移出大量貼壁細胞，如圖4；15天后即可得到貼壁生長的黃粉蟲胚胎細胞群，如圖5。經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，細胞活率大于90%。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

⑸黃粉蟲胚胎細胞的傳代培養(yǎng)：棄去原代細胞培養(yǎng)液，在黃粉蟲胚胎細胞群中加入2ml質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋酶-edta消化液，室溫消化30min，倒掉消化液，加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，吹打分散細胞，獲得細胞懸液；將所述細胞懸液全部移入新t-25cm²培養(yǎng)瓶，再加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，放于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，8天后，細胞貼滿平底，即可進行下次傳代。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

實施例4一種黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

⑴黃粉蟲蟲卵的收集：將黃粉蟲成蟲置于7目篩，篩底部鋪滿飼料，使飼料與篩底相接觸，在25℃~28℃條件下，避光產(chǎn)卵；次日，從飼料中16目篩篩取蟲卵，然后剔除蟲卵中雜質(zhì)；在25℃~28℃條件下，孵育5天，獲得孵育后黃粉蟲蟲卵。

其中：飼料是指玉米粉與面粉按3：2的質(zhì)量比（kg/kg）混合而成的混合物。

⑵黃粉蟲蟲卵的滅菌：無菌條件下，將900粒顆粒飽滿孵育后黃粉蟲蟲卵裹于雙層無菌紗布，先浸于質(zhì)量濃度為10%的naclo溶液中消毒8min，然后浸于體積濃度為75%的酒精消毒6min，接著用至終濃度為200u/ml雙抗和2.5μg/ml兩性霉素b的無菌水沖洗2次，再用grace’s昆蟲培養(yǎng)基漂洗4次，獲得無菌蟲卵。

其中：雙抗、兩性霉素b分別購置于索萊寶生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。

⑶獲取黃粉蟲胚胎的組織和細胞：在無菌條件下，用鑷子將無菌蟲卵從紗布上挑至孔徑為100μm的細胞篩，并將該細胞篩置于培養(yǎng)皿（35mm）中，加入10ml細胞培養(yǎng)液，用橡膠頭研碎卵粒，獲得細胞濾液。

其中：細胞培養(yǎng)液同實施例1。

⑷黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)：吸取2.5ml細胞濾液移入裝有2.5ml細胞培養(yǎng)液的t-25cm²培養(yǎng)瓶中，置于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔14d天更換60%~80%的細胞培養(yǎng)液，40天后即可得到貼壁生長的黃粉蟲胚胎細胞群。經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，細胞活率大于90%。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

⑸黃粉蟲胚胎細胞的傳代培養(yǎng)：棄去原代細胞培養(yǎng)液，在黃粉蟲胚胎細胞群中加入2ml質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋酶-edta消化液，室溫消化30min，倒掉消化液，加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，吹打分散細胞，獲得細胞懸液；將所述細胞懸液全部移入新t-25cm²培養(yǎng)瓶，再加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，放于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，7天后，細胞貼滿平底，即可進行下次傳代。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

實施例5一種黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

⑴黃粉蟲蟲卵的收集：將黃粉蟲成蟲置于12目篩，篩底部鋪滿飼料，使飼料與篩底相接觸，在25℃~28℃條件下，避光產(chǎn)卵；次日，從飼料中20目篩篩取蟲卵，然后剔除蟲卵中雜質(zhì)；在25℃~28℃條件下，孵育6天，獲得孵育后黃粉蟲蟲卵。

其中：飼料是指玉米粉與面粉按3：2的質(zhì)量比（kg/kg）混合而成的混合物。

⑵黃粉蟲蟲卵的滅菌：無菌條件下，將1100粒顆粒飽滿孵育后黃粉蟲蟲卵裹于雙層無菌紗布，先浸于質(zhì)量濃度為10%的naclo溶液中消毒7min，然后浸于體積濃度為75%的酒精消毒5.5min，接著用至終濃度為200u/ml雙抗和2.5μg/ml兩性霉素b的無菌水沖洗4次，再用grace’s昆蟲培養(yǎng)基漂洗3次，獲得無菌蟲卵。

其中：雙抗、兩性霉素b分別購置于索萊寶生物科技有限公司、生工生物工程（上海）股份有限公司。

⑶獲取黃粉蟲胚胎的組織和細胞：在無菌條件下，用鑷子將無菌蟲卵從紗布上挑至孔徑為100μm的細胞篩，并將該細胞篩置于培養(yǎng)皿（35mm）中，加入9ml細胞培養(yǎng)液，用橡膠頭研碎卵粒，獲得細胞濾液。

其中：細胞培養(yǎng)液同實施例1。

⑷黃粉蟲胚胎細胞的原代培養(yǎng)：吸取2.5ml細胞濾液移入裝有2.5ml細胞培養(yǎng)液的t-25cm²培養(yǎng)瓶中，置于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，每隔10d天更換60%~80%的細胞培養(yǎng)液，20天后即可得到貼壁生長的黃粉蟲胚胎細胞群。經(jīng)臺盼藍染色計數(shù)，細胞活率大于90%。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

⑸黃粉蟲胚胎細胞的傳代培養(yǎng)：棄去原代細胞培養(yǎng)液，在黃粉蟲胚胎細胞群中加入2ml質(zhì)量濃度為0.25%的胰蛋酶-edta消化液，室溫消化30min，倒掉消化液，加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，吹打分散細胞，獲得細胞懸液；將所述細胞懸液全部移入新t-25cm²培養(yǎng)瓶，再加入2.5ml細胞培養(yǎng)液，放于28℃普通培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，9天后，細胞貼滿平底，即可進行下次傳代。

其中細胞培養(yǎng)液同步驟⑶。

上述實施例1~5中g(shù)race’s昆蟲培養(yǎng)基購自于gibco公司。