可分泌抗ev71病毒蛋白vp1單克隆抗體的雜交瘤細胞、單克隆抗體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫檢測領(lǐng)域，尤其是涉及一種可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗 體的雜交瘤細胞、單克隆抗體及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 手足口?。℉ind-f 〇〇 t-mouth di sease，HFMD)是一種主要由腸道病毒71型 (Enterovirus71，EV71)或柯薩奇病毒 16型(Coxsackievirus A16，Cox A16)感染導(dǎo)致的流 行性疾病，兩種病毒常相伴造成手足口病的暴發(fā)流行，每次流行中兩種病毒所占比例有所 不同。感染后臨床表現(xiàn)多樣，從隱形感染、普通手足口病到中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染等重癥，部分 重癥患者病情進展較快，甚至死亡。患者主要為學(xué)齡前兒童，尤以3歲以下兒童發(fā)病率高。與 其他腸道病毒引起的手足口病相比，由EV71感染引起的疾病發(fā)生重癥感染的比例相對較 高。腸道病毒EV71的臨床診斷主要依據(jù)三個方面:一是臨床表現(xiàn)，而是血清學(xué)證據(jù)，三是病 原學(xué)證據(jù)。由于腸道病毒EV71型感染臨床表現(xiàn)多，因此腸道病毒EV71的血清學(xué)檢測和病原 學(xué)檢測時目前最主要的依據(jù)。EV71感染后可在咽部會分泌物、糞便和皮疹的皰液中排出病 毒。病原學(xué)檢測方法中，病毒分離是最早用于EV71病毒的檢測診斷的方法，這種方法具有較 高的特異性，但由于計數(shù)操作難度大、周期長、不適合臨床使用。RT-PCR技術(shù)用于檢測病毒 RNA，具有快速、簡便的優(yōu)點，而且還有很高的靈敏度和特異性。但其靈敏度一方面依賴于患 者攜帶的病毒與所用引物的匹配性，另一方面也受到擴增片段的高級結(jié)構(gòu)的很大影響。另 外，RT-PCR本身對于操作環(huán)境及操作人員的要求較高，并且價格昂貴，因此難以在廣大基層 單位中使用。結(jié)合以上方面，血清學(xué)檢測顯得較為簡便，節(jié)約時間，且易操作。
[0003] 腸道病毒71型(EV71)基因組含有大約7.5kb的單鏈正股RNA，包括5'端非編碼區(qū)、 3'端非編碼區(qū)和由P1，P2，P3所組成的多蛋白。共編碼11種蛋白，其中4個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、 ￥?2、￥卩3、￥卩4,7個非結(jié)構(gòu)蛋白2厶、28、2(：、3厶、38、3(：、30。其中￥?1、￥?2、￥?3暴露于病毒外殼的 表面，為EV71主要的抗原變異位置;VP4包埋在病毒外殼的內(nèi)側(cè)與內(nèi)部的RNA結(jié)合，其功能類 似病毒外殼的錨，用以穩(wěn)定病毒蛋白的結(jié)構(gòu)。非結(jié)構(gòu)蛋白2A為分裂初期先驅(qū)蛋白質(zhì)，也與終 止宿主細胞合成其本身所需蛋白有關(guān);3C蛋白則參與大部分的蛋白裂解反應(yīng);3D為RNA聚合 酶，在病毒RNA復(fù)制時主導(dǎo)轉(zhuǎn)錄及復(fù)制反應(yīng)；2B、2C、3A、3B等四種蛋白則與病毒RNA復(fù)制有 關(guān)。由于中和抗原表位多集中于VP1，故VP1是EV71病毒的主要中和決定因子，因此VP1蛋白 可被認為是最適合來建立檢測方法的抗原。
[0004] 在血清中和試驗中，EV71和Cox A16-般難以區(qū)分，病毒變異、樣本中存在多個交 叉同源性的病毒等因素均可能影響抗原分型。傳統(tǒng)的HRP標記多克隆兔抗血清抗體建立的 雙抗體夾心法也無法準確的檢測EV71病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，有必要提供一種與其他病毒無交叉、可以準確的檢測EV71病毒檢測試劑 盒，以及可應(yīng)用在該EV71病毒檢測試劑盒中的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜 交瘤細胞、單克隆抗體及應(yīng)用。
[0006] -種可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜交瘤細胞，保藏號為CCTCC No: C2015225〇
[0007] 上述的雜交瘤細胞在制備EV71病毒檢測試劑或EV71病毒檢測設(shè)備中的應(yīng)用。
[0008]在一個實施例中，所述抗EV71病毒蛋白VP1的單克隆抗體記為7P1-7。
[0009] -種可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜交瘤細胞，保藏號為CCTCC No: C2015226〇
[0010] 上述的抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體在制備EV71病毒檢測試劑或檢測設(shè)備中的 應(yīng)用。
[0011]在一個實施例中，所述抗EV71病毒蛋白VP1的單克隆抗體記為7P1-11。
[0012] 一種EV71病毒檢測試紙，其特征在于，包括上述的7P1-7和上述的7P1-11。
[0013] 在一個實施例中，包括支撐薄片、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測線 及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標墊、所述硝酸纖維素膜及所述吸收墊從所述支撐薄片的一 端向另一端依次設(shè)置在所述支撐薄片上，所述樣品墊與所述金標墊部分重疊，所述金標墊 與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜與所述吸收墊部分重疊，所述檢測線及 所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測線設(shè)在靠近所述金標墊的一端，所述質(zhì) 控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標墊上涂覆有7P1-7包附膠體金顆粒形成的膠體 金標記的單克隆抗體，所述檢測線為7P1-11，所述質(zhì)控線為羊抗鼠 IgG抗體。
[0014] 一種EV71病毒檢測試劑盒，包括上述的EV71病毒檢測試紙。
[0015] 上述雜交瘤細胞的分泌產(chǎn)量高，分泌得到的抗EV71病毒蛋白VP1的單克隆抗體具 有高親和力、高特異性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用在制備EV71病毒導(dǎo)致的手足口病診斷的檢測領(lǐng) 域，如檢測試劑或檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域等。
[0016] 上述雜交瘤細胞的分泌產(chǎn)量高，分泌得到的抗EV71病毒蛋白VP1的單克隆抗體具 有高敏感性、高特異性等優(yōu)點，可廣泛應(yīng)用在制備手足口病早期分型診斷的檢測領(lǐng)域，如檢 測試劑或檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域等，可以實現(xiàn)準確、快速地檢測出EV71病毒，而與柯薩奇病毒 (Cox A16)、普通腸道病毒無交叉，有利于對EV71病毒作出早期分型診斷，且在特異性、靈敏 度等方面較之傳統(tǒng)的檢測方法具有顯著的優(yōu)勢，可以應(yīng)用于EV71病毒早期檢測。
【附圖說明】
[0017] 圖1為一實施方式的EV71病毒檢測試紙的正面示意圖；
[0018]圖2為圖1中EV71病毒檢測試紙的縱截面示意圖；
[0019]圖3為一實施方式的EV71病毒檢測試劑盒的示意圖。
【具體實施方式】
[0020] 下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜交 瘤細胞、單克隆抗體及應(yīng)用作進一步詳細的說明。
[0021] 一實施方式的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜交瘤細胞于2015年12 月17日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏號為 CCTCC No:C2015225，分類命名：雜交瘤細胞株7P1-7。該雜交瘤細胞可分泌出抗EV71病毒蛋 白VP1單克隆抗體的單克隆抗體，記為7Ρ1-7,7Ρ1-7可以作為檢測抗體。7P1-7可以應(yīng)用于 EV71病毒檢測試劑或EV71病毒檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域中。
[0022]另一實施方式的可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜交瘤細胞于2015年12 月17日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏號為 CCTCC No: C2015226，分類命名：雜交瘤細胞株7P1-11。該雜交瘤細胞也可分泌出抗EV71病 毒蛋白VP1單克隆抗體的單克隆抗體，記為7P1-11，7P1-11可以作為捕獲抗體。7P1-11可以 應(yīng)用于EV71病毒檢測試劑或EV71病毒檢測設(shè)備的制備領(lǐng)域中。
[0023] -實施方式的EV71病毒檢測試劑盒包括殼體、EV71病毒檢測試紙和其他檢測試 劑。
[0024] 如圖1和圖2所示，本實施方式的EV71病毒檢測試紙100包括支撐薄片110、樣品墊 120、金標墊130、硝酸纖維素膜140、吸收墊150、檢測線160及質(zhì)控線170。樣品墊120、金標墊 130、硝酸纖維素膜140及吸收墊150從支撐薄片110的一端向另一端依次設(shè)置在支撐薄片 110上。樣品墊120與金標墊130部分重疊，金標墊130與硝酸纖維素膜140部分重疊，硝酸纖 維素膜140與吸收墊150部分重疊。檢測線160及質(zhì)控線170設(shè)在硝酸纖維素膜140上，且檢測 線160設(shè)在靠近金標墊130的一端，質(zhì)控線170設(shè)在靠近吸收墊150的一端。支撐薄片110采用 不吸水的材料制作。樣品墊120用于樣品點樣。金標墊130上涂覆有7P1-7包附膠體金顆粒形 成的膠體金標記的7P1-7。檢測線160為7P1-11。質(zhì)控線170為羊抗鼠 IgG抗體。
[0025]本實施方式中，7P1-7作為檢測抗體，7P1-11為捕獲抗體。在其他的實施方式中，也 可以選擇7P1-11作為檢測抗體，7P1-7為捕獲抗體。
[0026] 如圖3所示，EV71病毒檢測試紙100可置于檢測試劑盒的殼體200內(nèi)。殼體200上開 設(shè)有加樣孔210及觀察窗220。加樣孔210對應(yīng)樣品墊120的位置。檢測線160及質(zhì)控線170裸 露于觀察窗220中，方便觀察。
[0027]其他檢測試劑可以根據(jù)需要直接在實驗室制備。
[0028]上述EV71病毒檢測試劑盒利用雙抗體夾心法來檢測被檢材料中的是否含有VP1蛋 白。檢測時，VP1蛋白先和膠體金標記的7P1-7結(jié)合形成VP1-膠體金標記的7P1-7復(fù)合物，由 于毛細管作用，VP1-膠體金標記的7P1-7復(fù)合物沿硝酸纖維素膜140向前泳動，到達檢測線 160時，VP1-膠體金標記的7P1-7復(fù)合物會與7P1-11結(jié)合，形成7P1-11-VP1-膠體金標記的 7P1-11的復(fù)合物，從而富集在檢測線160上，形成紅色沉淀線。未結(jié)合VP1蛋白的膠體金標記 的7P1-11則通過檢測線160,被羊抗鼠 IgG抗體捕獲，富集在質(zhì)控線170上，形成紅色沉淀線。 當檢測線160與質(zhì)控線170上同時有紅色沉淀線時判為陽性結(jié)果。