人腸道病毒71型c4亞型致死株sd095及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供保藏號為CGMCC?NO.6601的人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095及其應(yīng)用。通過常規(guī)病毒分離培養(yǎng)以及動物感染等一系列技術(shù)手段獲得了鼠適應(yīng)型致死株，并建立了基于病毒株SD095的動物致死模型。該致死毒株的獲得及動物致死模型的建立對于推動我國EV71病毒導(dǎo)致的重癥及死亡病例的臨床治療與研究具有重要的意義，對于進(jìn)一步推進(jìn)EV71的實(shí)驗(yàn)和臨床研究、流行病學(xué)研究以及新型疫苗開發(fā)與評價具有重要的價值。
【專利說明】人腸道病毒71型C4亞型致死株SD095及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于病毒學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地說，涉及人腸道病毒71型C4亞型致死株SD095及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]手足口病(Hand, foot and mouth diseases, HFMD)是一種全球范圍內(nèi)廣泛流行的糞口傳播的疾病，世界上大部分地區(qū)均有此病流行的報導(dǎo)。長期以來，輕度的手足口病在世界范圍內(nèi)周期性爆發(fā)。該病于1957年在新西蘭首次報道，1958年首次分離出柯薩奇病毒，1959年提出手足口病的名稱。1969年美國從中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的嬰兒糞便標(biāo)本中首次分離出腸道病毒71 (Enterovirus 71，EV71)。手足口病流行的間隔期為2_3年，早期的病原體以CoxA16型為主，后來EV71與CoxA16交替出現(xiàn)，成為手足口病的主要病原體。20世紀(jì)70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼爆發(fā)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主要臨床特征的EV71流行。1994年英國爆發(fā)了 Cox A16引起的手足口病。
[0003]20世紀(jì)90年代后期，EV71在亞太地區(qū)的流行呈逐年上升趨勢，由此引起的手足口病在東南亞地區(qū)廣泛流行，感染后常導(dǎo)致患者發(fā)生嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，死亡率較高。1997年馬來西亞爆發(fā)主要由EV71引起的手足口病，4-6月間共29例病人死亡。1998-2001年手足口病在新加坡大量流行。在我國，1981年上海首次報道HFMD ;此后，北京、河北、天津、福建、吉林、山東、湖北、青海和廣東等十幾個省市均有該病的報道。1983年天津爆發(fā)了Cox A16引起的手足口病，5-10月間發(fā)生了 7000余病例；經(jīng)過2年低水平散發(fā)后，1986年再次爆發(fā)。1995年武漢病毒研究所從手足口病病人中分離出EV71病毒，1998年深圳市衛(wèi)生防疫站從患者標(biāo)本中分離出EV71病毒。1998年臺灣爆發(fā)了大規(guī)模的EV71疫情，發(fā)病人數(shù)估計(jì)達(dá)150萬，其中重癥405例，死亡78例，大多為5歲以下的幼兒。我國2000年80，677人感染HFMD，重癥感染者291例，死亡41例；2001年出現(xiàn)389例重癥感染者，55人死亡。手足口病已經(jīng)越來越成為威脅國內(nèi)兒童健康的廣泛流行性疾病之一。2007年至今，該病在我國不斷流行；山東臨沂、青島和濟(jì)南、安徽阜陽等地均發(fā)生以EV71為主要病原體導(dǎo)致的手足口病的流行。
[0004]HFMD為自限性疾病，在嬰幼兒中傳播，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，個別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等致死性并發(fā)癥。EV71與Cox A16是導(dǎo)致HFMD的兩種最主要的病原體；其中EV71占HFMD重癥病例的90%左右，占死亡病例的80%左右。EV71屬于微小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，為單股正鏈RNA,含7000多個核苷酸，包括一個開放閱讀框，編碼VP1-VP4四個病毒結(jié)構(gòu)蛋白。VPl是主要的衣殼蛋白與病毒中和決定因子，具有最多的型特異性中和位點(diǎn)，負(fù)責(zé)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合，決定著病毒的抗原性，其基因序列與病毒血清型具有較高的相關(guān)性，根據(jù)VPl的全基因序列，將EV71分為A、B和C型3個基因型。
[0005]目前用于檢測EV71病毒的方法主要有RT-PCR法和熒光定量PCR法。上述方法特異性較好，但是靈敏度差，試驗(yàn)容易發(fā)生污染出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。同時病毒在傳播過程中存在一定核苷酸突變的幾率，因此引物設(shè)計(jì)是個問題。同時試驗(yàn)費(fèi)用高，需要許多大型儀器設(shè)備和熟練的技術(shù)人員，操作復(fù)雜，檢測時間長，不易在我國推廣使用。
[0006]疫苗作為疾病的有效預(yù)防手段，其有效性得到了世界公認(rèn)。EV71常見毒株均為非致死毒株，在體外只能開展血清學(xué)檢測，單一的檢測手段不能夠全面的評價疫苗效果，由非致死株作為抗原獲得的抗體疫苗的臨床效果不明顯，制備出的疫苗質(zhì)量相對較低。有研究報道(Chen等，2004)使用小鼠適應(yīng)性EV71通過口服、肌肉接種(1.m.)、腹腔接種(1.p.)和腦內(nèi)接種(1.e.)等方式感染七日齡小鼠可以模擬EV71感染人和猴所產(chǎn)生的急性麻痹(Chen等，2004; Wang等，2004 )。與母本病毒相比，小鼠適應(yīng)性HEV71感染小鼠時毒力更強(qiáng)，表現(xiàn)為產(chǎn)生更大的空斑和更快的病變速度。這種小鼠適應(yīng)性病毒株的潛在毒力經(jīng)檢定可能與5’非翻譯區(qū)(4個核苷酸的改變)，VP2衣殼蛋白(3個核苷酸和I個氨基酸發(fā)生了改變)和非結(jié)構(gòu)蛋白2C (8個核苷酸和4個氨基酸發(fā)生了改變)有關(guān)(Wang等，2004)。因此致死毒株篩選和致死動物模型的建立對于疫苗評價、傳統(tǒng)疫苗的改進(jìn)和新型疫苗的開發(fā)生產(chǎn)具有重要的意義。
[0007]檢測病毒抗原常采用ELISA法，該方法靈敏性度高和特異性好，在很多病毒檢測中發(fā)揮重要作用。EV71抗原ELISA檢測關(guān)鍵是有特異性好的抗EV71抗體，以保證檢測試劑的特異性，同時抗體需要有穩(wěn)定來源具有穩(wěn)定的細(xì)胞株，并且抗體需要高效價、高中和活性，以確保檢測的抗原為活性表位抗原。高質(zhì)量抗體的獲得需要有穩(wěn)定高效的病毒抗原作為基礎(chǔ)，因此C4亞型致死毒株的篩選鑒定對于制備EV71病毒抗體具有重要的意義，進(jìn)而對于EV71感染的早期發(fā)現(xiàn)，疾病監(jiān)控，病毒檢測，以及疫苗研制過程中病毒抗原表位的檢測奠定了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是提供人腸道病毒71型C4亞型致死株SD095及其應(yīng)用。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā) 明目的,本發(fā)明的人腸道病毒71型C4亞型(Human enterovirus 71type C4 subgenotype)致死病毒株SD095，于2009年分離自我國山東一例HFMD重癥患者體內(nèi)，并在細(xì)胞水平進(jìn)行接種傳代，然后濃縮純化獲得的具有高滴度、高致病性的人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株。該毒株現(xiàn)已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號CGMCC N0.6601，保藏日期2012年9月19日。
[0010]病毒經(jīng)濃縮純化后，對7日齡以下乳鼠進(jìn)行腹腔注射感染病毒，結(jié)果表明，在攻毒后，乳鼠出現(xiàn)不同程度的后肢麻痹，高滴度攻毒組小鼠在攻毒后出現(xiàn)明顯的麻痹和癱瘓現(xiàn)象，7-10天內(nèi)，乳鼠全部死亡。
[0011]本發(fā)明還提供人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095的基因組。
[0012]本發(fā)明還提供人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白(包括VP1-VP4)或非結(jié)構(gòu)蛋白。
[0013]本發(fā)明還提供編碼人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因。
[0014]本發(fā)明還提供含有編碼人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因的載體。[0015]本發(fā)明還提供含有編碼人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白或非結(jié)構(gòu)蛋白的基因的宿主細(xì)胞。
[0016]本發(fā)明還提供人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095、其產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白(包括VP1-VP4)或非結(jié)構(gòu)蛋白、以及它們的編碼基因、含有這些編碼基因的載體和含有這些編碼基因的宿主細(xì)胞在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型病毒感染的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明還提供人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095的cDNA感染性克隆，其是通過反向遺傳操作獲得的人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095的cDNA感染性克隆。
[0018]本發(fā)明還提供含有人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095的cDNA感染性克隆的宿主細(xì)胞。
[0019]本發(fā)明還提供制備人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095的拯救病毒的方法:首先對人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095進(jìn)行全基因組測序，根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計(jì)用于構(gòu)建cDNA克隆的引物和酶切位點(diǎn)，通過引物在基因組cDNA的5’端引入T7啟動子，在其3’ 端引入polyA尾，然后以人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095的基因組為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，得到全長cDNA克隆，酶切線性化后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，用體外轉(zhuǎn)錄出的RNA轉(zhuǎn)染vero細(xì)胞,從而獲得拯救病毒。
[0020]前述人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095的cDNA感染性克隆在制備抗EV71病毒藥物及疫苗中的應(yīng)用。
[0021]本發(fā)明還提供一種用于預(yù)防或治療腸道病毒71型病毒感染的疫苗，其包括以所述病毒株SD095為免疫原制備的抗體。
[0022]本發(fā)明還提供以人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095為免疫原制備的抗體。
[0023]本發(fā)明還提供前述抗體在制備用于檢測腸道病毒71型病毒感染的診斷試劑及試劑盒中的應(yīng)用。
[0024]本發(fā)明還提供含有前述抗體的用于檢測腸道病毒71型病毒感染的診斷試劑及含有該診斷試劑的試劑盒。
[0025]本發(fā)明還提供人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095在評價腸道病毒71型疫苗的安全性、有效性以及保護(hù)力方面的應(yīng)用。
[0026]本發(fā)明進(jìn)一步提供根據(jù)人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095建立的腸道病毒71型動物致死模型。例如，取感染病毒7天后BALB/c乳鼠骨骼肌，加維持液后研磨，離心收集病毒，測定病毒滴度。將收集得到的病毒再次感染對7日齡以下乳鼠，通過反復(fù)試驗(yàn)，建立一個穩(wěn)定的小鼠致死模型。
[0027]本發(fā)明還提供前述動物致死模型在腸道病毒71型流行病學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究中的應(yīng)用。
[0028]本發(fā)明還提供前述動物致死模型在評價腸道病毒71型疫苗質(zhì)量中的應(yīng)用，從而建立一個規(guī)范的EV71型疫苗質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)。
[0029]另一方面，本發(fā)明提供一種利用母源抗體途徑對乳鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)的方法:通過接種疫苗后再受孕的方式，使新生小鼠獲得保護(hù)性母傳抗體，再進(jìn)行病毒攻擊，可作為評價疫苗保護(hù)效果的一種方法。[0030]本發(fā)明提供的EV71病毒C4亞型致死毒株SD095以及致死動物模型的建立對于推動我國EV71病毒所致的重癥與死亡病例的治療與研究有重要意義，對進(jìn)一步推進(jìn)EV71的臨床、流行病學(xué)研究以及被動治療具有極其重要的價值，對于EV71病毒的結(jié)構(gòu)研究、致病機(jī)理研究以及其他基礎(chǔ)研究具有重要作用。
[0031]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0032]1、本發(fā)明的EV71病毒C4亞型致死株通過在VeiO細(xì)胞上傳代，可以收獲較高滴度和純度的病毒液。
[0033]2、本發(fā)明的EV71病毒C4亞型致死株通過腹腔接種(1.P.)的方式感染七日齡小鼠可以模擬EV71感染人和猴所產(chǎn)生的急性麻痹(Chen等，2004;Wang等，2004)。與母本病毒相比，小鼠適應(yīng)性EV71感染小鼠時毒力更強(qiáng)，表現(xiàn)為產(chǎn)生更大的空斑和更快的病變速 度。
[0034]3、本發(fā)明的EV71病毒C4亞型致死毒株SD095對7日齡以內(nèi)乳鼠具有明顯的致死效應(yīng)。
[0035]4、本發(fā)明的EV71病毒C4亞型致死毒株SD095可以對母嬰途徑獲得抗體的7日齡以下乳鼠進(jìn)行攻毒保護(hù)。
[0036]5、本發(fā)明的EV71病毒C4亞型致死毒株SD095經(jīng)過感染小鼠獲得小鼠適應(yīng)株。
[0037]6、本發(fā)明的EV71病毒C4亞型致死毒株SD095感染7日齡以下BALB/c乳鼠建立動物致死模型。
[0038]7、本發(fā)明的基于EV71病毒C4亞型致死毒株SD095建立的動物致死模型對于研究EV71發(fā)病機(jī)理、EV71疫苗評價和新型高效疫苗開發(fā)具有重要意義。
【具體實(shí)施方式】
[0039]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0040]實(shí)施例1人腸道病毒71型C4亞型致死病毒株SD095的獲得
[0041]I毒株樣本采集:在全國HFMD集中爆發(fā)地區(qū)采集毒株樣本，按照《手足口病預(yù)防控制指南(2008年版)》規(guī)定的程序無菌取得糞便或者咽拭子標(biāo)本，將標(biāo)本浸泡于生理鹽水中，置-20°C冰箱凍存。
[0042]表1 C4基因型EV71毒株樣本信息
[0043]
【權(quán)利要求】
1.人腸道病毒71 型 C4 亞型(Human enterovirus 71type C4subgenotype)致死病毒株 SD095，其保藏號為 CGMCC N0.6601。
2.權(quán)利要求1所述病毒株SD095在制備預(yù)防或治療腸道病毒71型病毒感染的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
3.一種用于預(yù)防或治療腸道病毒71型病毒感染的疫苗，其包括以權(quán)利要求1所述病毒株SD095為免疫原制備的抗體。
4.以權(quán)利要求1所述的病毒株SD095為免疫原制備的抗體。
5.權(quán)利要求4所述抗體在制備用于檢測腸道病毒71型病毒感染的診斷試劑及試劑盒中的應(yīng)用。
6.含有權(quán)利要求4所述抗體的用于檢測腸道病毒71型病毒感染的診斷試劑及含有該診斷試劑的試劑盒。
7.權(quán)利要求1所述病毒株SD095在評價腸道病毒71型疫苗的安全性、有效性以及保護(hù)力方面的應(yīng)用。`
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述病毒株SD095建立的腸道病毒71型動物致死模型。
9.權(quán)利要求8所述動物致死模型在腸道病毒71型流行病學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求8所述動物致死模型在評價腸道病毒71型疫苗質(zhì)量中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N33/569GK103834617SQ201210472854
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月20日
【發(fā)明者】薛晨寶, 郝超, 陰彥輝, 王琳, 高強(qiáng) 申請人:北京科興生物制品有限公司