專利名稱：：手足口ev71病毒單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及雜交瘤細胞系及其產(chǎn)生的單克隆抗體與應(yīng)用，特別是涉及針對手足口病病原體之一腸道病毒71的單克隆抗體和分泌該抗體的雜交瘤細胞系以及該抗體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：手足口病(Hand，foot,andmouthdisease,HFMD)是由腸道病毒引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，個別患者可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，其中柯薩奇病毒A16型(Coxsackieviruses16，CA16)和腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)最常見。腸道病毒71型簡稱EV71。1957年，新西蘭首次爆發(fā)大規(guī)模疫情并報道。1958年，首次分離出柯薩奇病毒。1959年，有了手足口病的命名。腸道病毒71型和柯薩奇病毒A16型均屬小RNA病毒科腸道病毒屬成員，其感染主要引起患者手足口病。通常情況下，EV71感染引起的手足口病在臨床癥狀等方面與CA16感染所引起的手足口病難以區(qū)別，但EV71感染除了引起HFMD以外，還能夠引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病。自1974年Schmidt等首次報道從美國加利福尼亞爆發(fā)表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀疾病的患者中分離到EV71以來，EV71已在世界范圍內(nèi)引起10多次爆發(fā)與流行。EV71的流行在亞太地區(qū)呈上升趨勢。兒童感染后易引起嚴重并發(fā)癥，病死率高，死亡速度快，造成了社會的不安定，快速而特異地診斷EV71感染，及早發(fā)出潛在暴發(fā)EV71相關(guān)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的警報，對指導(dǎo)公共衛(wèi)生部門的干預(yù)和臨床決策，控制EV71引起的疾病暴發(fā)流行是十分重要的。而CA16則很少會引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，因此，臨床對EV71的快速鑒別診斷需求極為迫切。目前在國內(nèi)尚未見到有效檢測EV71病毒單克隆抗體的報道，國外已有相關(guān)的抗體，但是，該抗體與CA16有交叉反應(yīng)，無法區(qū)分EV71和CA16并且該抗體不適于直接快速檢測病人樣品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供能與EV71專一結(jié)合的單克隆抗體以及產(chǎn)生該抗體的雜交瘤細胞系。本發(fā)明提供的單克隆抗體，其是以EV71病毒的VPl蛋白(NCBI上的登陸號NO.AF316321)為靶蛋白，設(shè)計合成多肽序列，與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原，通過所述免疫原制備獲得。具體地說是使用可以誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)并生成具有中和效應(yīng)抗體的多肽序列，偶聯(lián)至KLH作為免疫原免疫小鼠，采用雜交瘤技術(shù)經(jīng)過細胞融合并篩選得到能持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗EV71單克隆抗體的雜交瘤細胞株，由該細胞株分泌得到單克隆抗體。優(yōu)選地，上述多肽序列選自SP55=PESRESLAffQTATNPC；SP70:YPTFGEHKQEKDLEYC。由這兩個多肽序列與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原制備獲得的單克隆抗體能夠特異性地識別VPl蛋白的SP55序列或SP70序列，將這兩個單克隆抗體分別稱之為clone20D12和Clone22A12。clone20D12和Clone22A12具有良好的特異性，實驗表明，clone20D12和Clone22A12與CA16沒有交叉反應(yīng)，間接ELISA表明這兩個抗體具有較高的效價，因此可用于EV71的檢測。此外，由于clone20D12和Clone22A12識別VPl不同的抗原決定簇，因此，可以采用雙抗夾心法，利用這兩個單克隆抗體對VPl進行檢測。從而，本發(fā)明提供一種用于EV71檢測的試劑盒，其含有上述單克隆抗體，特別是同時含有clone20D12和Clone22A12，優(yōu)選以clone20A12(特異性地識別VPl蛋白的SP70序列的單克隆抗體)為包被抗體，以酶標(biāo)記的Clone22D12(異性地識別VPl蛋白的SP55序列)的單克隆抗體作為檢測抗體。此外本發(fā)明還提供一種檢測試紙卡，包括反應(yīng)膜、樣本墊、結(jié)合物釋放墊和吸水墊，所述反應(yīng)膜上具有包被有上述單克隆抗體的測試區(qū)，所述結(jié)合物釋放墊包被有膠體金標(biāo)記單克隆抗體或酶標(biāo)記單克隆抗體，并且檢測區(qū)包被的單克隆抗體與結(jié)合物釋放墊包被的單克隆抗體分別特異性地識別VPl蛋白的SP55序列或SP70序列。所述反應(yīng)膜通常是硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜，結(jié)合物釋放墊通常是玻璃纖維膜。本發(fā)明還提供產(chǎn)生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞。本發(fā)明提供的單克隆抗體與EV71病毒其他蛋白、CA16病毒以及其他抗原和病原體無交叉反應(yīng)，用于檢測具有高特異性、高敏感性的優(yōu)點，可以準(zhǔn)確檢測樣品中EV71病毒的水平，在臨床檢測中將會得到廣泛應(yīng)用。同時，本發(fā)明的抗體具有中和EV71病毒并阻斷其感染的特性，可用于針對患者、患病動物的治療和對易感人群與動物進行被動免疫，具有良好的應(yīng)用前景。圖1是抗體的SDS-PAGE電泳圖，其中M是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)，22A12和20D12分別為本發(fā)明獲得的兩個種單克隆抗體；圖2是抗體免疫印跡分析圖，其中M是蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(kDa)，l:22A12，2:20D12，3:陽性對照(heartbleedasprimaryantibodies)，4:NC陰性對照(5%milk-PBSasprimaryantibodies)。圖3是兩個克隆的亞型鑒定圖，其中clone20D12顯示IgGl信號最強，clone22A12顯示IgG2b信號最強，依據(jù)亞型鑒定試劑盒說明中結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，clone20D12的亞型為IgGl,clone22A12的亞型為IgG2b。圖4所示的是ELISA法靈敏度實驗的擬合曲線。圖5是試紙卡檢測情況，其中由上至下各樣品的濃度分別是50ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、5ng/ml、2ng/ml以及0.3ng/ml。具體實施方法以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實施例1、雜交瘤細胞系的建立一、實驗材料1、免疫原本例以EV71病毒的VPl蛋白作為靶蛋白，從中選取兩段多肽序列，序列如下SP55=PESRESLAffQTATNPC,SP70:YPTFGEHKQEKDLEYC，采用化學(xué)合成的方式制備這兩條多肽，純度要求大于90%。這兩條多肽分別與KLH偶聯(lián)制備成免疫原。2、培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)基購于Hyclone公司；HAT、HT選擇培養(yǎng)基、降植烷購于sigma公司。3、實驗動物Balb/c小鼠，8_12周齡，雌性，SPF級動物培養(yǎng)。4、其他材料福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑購于Sigma公司；PEG4000購于Fluka公司；HRP-山羊抗小鼠IgG抗體購于Jacksonlmmune公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純女口廣PFtο二、雜交瘤細胞系的建立1、動物免疫1)基礎(chǔ)免疫將抗原與福氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，分點皮下注射，每只Balb/c小鼠每次注射量為100μg。2)加強免疫加強免疫采用抗原與福氏不完全佐劑的乳化液。在進行細胞融合前3天，經(jīng)腹腔注射含150ug抗原的生理鹽水溶液。2、雜交瘤細胞的制備按常規(guī)方法收集小鼠的脾細胞與SP2/0細胞按101的比例以500g/L的PEG4000進行融合。用HAT培養(yǎng)液選擇培養(yǎng)，融合后1015天，取上清采用間接ELISA法篩選分泌抗EV71抗原的雜交瘤細胞株。對所得陽性克隆株采用有限稀釋法進行亞克隆。間接ELISA法的操作步驟如下用200μ1的SP55和SP70包板，用免疫小鼠血清12000作為陽性對照，無克隆生長的培養(yǎng)基上清和正常小鼠血清作為陰性對照，每孔加12000HRP-山羊抗小鼠IgG100μ1，最后測定450nmOD值。凡0D450值大于陰性對照2倍以上者，即可初步判定為陽性克隆。3、雜交瘤細胞系的建立重復(fù)步驟2，進行2次細胞融合，經(jīng)過4次亞克隆和間接ELISA篩選，得到5株分別針對SP55、2株針對SP70的，穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞系。4、應(yīng)用上述雜交瘤細胞系所得單抗的效價檢測1)細胞培養(yǎng)液上清效價測定間接ELISA法檢測上述雜交瘤細胞培養(yǎng)上清效價為150000-1100000。2)小鼠腹水效價測定間接ELISA法檢測上述雜交瘤細胞制備的腹水效價為1500000-11000000。5、雜交瘤細胞系的傳代培養(yǎng)將上述雜交瘤細胞系在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)進行培養(yǎng)、傳代，培養(yǎng)到10代后，雜交瘤細胞系仍然能夠生長良好、穩(wěn)定傳代，培養(yǎng)液上清效價仍然可以達到110000以上。以上結(jié)果表明，所得雜交瘤細胞系能夠穩(wěn)定傳代，可以持續(xù)、穩(wěn)定分泌抗EV71的單克隆抗體。獲得產(chǎn)生所需的單克隆抗體的雜交瘤細胞后，必須將一部分雜交瘤細胞保存，否則在連續(xù)傳代的過程中，可能產(chǎn)生突變或染色體的漂移以至喪失固有特性或丟失產(chǎn)生抗體的特性。另外在長期的培養(yǎng)過程中，難免不發(fā)生污染以至于毀滅。所以必須冷藏保存一部分。保存方法如下1.材料(1)細胞取對數(shù)生長期的細胞。(2)10%二甲基亞砜保護液(二甲基亞砜能損壞濾器，而又被高壓所破壞，所以不能過濾或高壓消毒。其本身就是毒品，無菌)含10%二甲基亞砜、20%滅活胎牛血清，70%RPMI-1640液。(3)20%FCS-1640培養(yǎng)液含青霉素100U/ml，鏈霉素100μg/ml。(4)滅菌的2ml安瓶等2.操作方法(1)去掉細胞培養(yǎng)瓶中的舊的培養(yǎng)液，加入10%FCS-1640液，使細胞懸浮。(3)lOOOr/min離心lOmin，去上清。細胞沉淀用10%二甲基亞砜保護液制成懸液，使成1.0X107細胞/ml。(3)取樣，臺盼蘭染色，計數(shù)活細胞，應(yīng)在95%以上。(4)用注射器將細胞分裝安瓶，每瓶0.5ml1.0ml，熔封安瓶。(5)放4°C2h。(6)放液氮罐氣態(tài)部分(_70°C)15h。(7)轉(zhuǎn)入液氮部分。實施例2抗EV71的單克隆抗體的制備一抗體制備選擇成年BALB/c小鼠，腹腔接種降植烷，每只小鼠0.5ml。7-10天后腹腔接種第16代雜交瘤細胞，每只小鼠IX106-2XIO6個。間隔5天后，待腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可用9號針頭采集腹水。將腹水離心(13000r/min30分鐘)，除去細胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用ProteinGS印haroseCL-4B進行純化，上柱液為20mM的PBS緩沖液，柱層析洗脫液為pH2.7,20mM的甘氨酸緩沖液，得到抗EV71病毒的單克隆抗體(將由SP55序列產(chǎn)生的單克隆抗體稱之為clone20D12由SP70序列產(chǎn)生的單克隆抗體稱之為Clone22A12)。二抗體的鑒定1、抗體純度鑒定SDS-PAGE電泳鑒定，純度在95%以上。2、抗體類及亞類鑒定采用間接ELISA法，使用抗小鼠各種Ig亞型的抗體鑒定上述雜交瘤細胞產(chǎn)生的抗體的Ig亞型，結(jié)果顯示，SP55組中的5個抗體均為(IgGl)，SP70組的2個抗體屬于(IgG2b)(圖三)。3、抗體免疫印跡檢測常規(guī)WesternBlot檢測方法檢測這兩株抗體的特異性，使用100μg滅活病毒進行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用純化的抗體進行WesternBlot雜交檢測。結(jié)果顯示，上述方法制得的單克隆抗體均能特異性識別EV71病毒。4、克隆20D12和克隆22A12的可變區(qū)序列測定將兩個克隆的細胞提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用可變區(qū)通用引物進行高保真PCR擴增，將PCR產(chǎn)物片段插入到T載體內(nèi)進行DNA序列測定，并將獲得的序列翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。clone20D12和clone22A12的抗體的可變區(qū)氨基酸序列clone20D12的氨基酸序列為輕鏈如SEQIDNo.1所示，重鏈如SEQIDNo.2所示。clone22A12的氨基酸序列為輕鏈如SEQIDNo.3所示，重鏈如SEQIDNo.4所示。將該序列進行比對后未顯示有相同序列，說明所獲得的序列為兩個克隆各自特異的序列。實施例3應(yīng)用純化抗體制備EV71病毒檢測試劑一、ELISA雙抗體夾心法應(yīng)用clone20D12和Clone22A12抗體做配對實驗，確定以clone22A12為包被抗體，用HRP標(biāo)記Clone20D12作為檢測抗體，確定了ELISA檢測方法，試劑盒檢測靈敏度可達Ing/mL(圖4)。采用改良過碘酸鈉法標(biāo)記抗體。表IELISA法檢測EV71的檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>檢測方法包被抗體clone22A12用pH9.60.05mol/L的碳酸鹽緩沖溶液稀釋成10μg/mL,在酶標(biāo)板的每孔加100μL，4°C下包被過夜，傾去包被液，用PBST洗滌3次，拍干，然后在每孔中加入200μL1%的明膠，放入37°C恒溫箱中封閉2小時后，用PBST洗滌3次，拍干后干燥保存。用辣根過氧化物酶標(biāo)記clone20D12的抗體，得20D12-HRP并保存。向酶標(biāo)板中分別加入EV71梯度稀釋液100μL/孔，37°C孵育1小時，再加入20D12-HRP(14000稀釋)10(^17，371孵育1小時，加入顯色劑A、B各50μL/孔進行顯色，37°C溫育IOmin,加入終止液50μL/孔，進行讀數(shù)。其中顯色劑A液配方為每IOOOmL水中加入過氧化脲lg，10.3g檸檬酸，35.8gNa2HPO4·12H20,吐溫-20100μL，ρΗ5；B液配方為每IOOOmL蒸餾水中加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)700mg(40mLDMS0溶解)，10.3g檸檬酸，pH2.4。試劑盒特異性試驗稀釋液、正常人血清、正常人唾液均呈陰性，對CA16無交叉反應(yīng)。二、檢測試紙卡的開發(fā)應(yīng)用兩株單克隆抗體進行進行金標(biāo)，確定了試紙卡快速檢測方法，檢測靈敏度可達0.3ng/mL(EV71)(圖5)。具體方法將純化的EV71病毒抗體與兔抗鼠二抗分別固定在硝酸纖維素膜及玻璃纖維素膜上，組成EV71病毒免疫膠體金雙抗體夾心法檢測試紙卡。其中加樣孔下設(shè)有濾過墊，反應(yīng)區(qū)包被有純化的EV71病毒抗體膠體金偶聯(lián)標(biāo)記物，檢測線包被有純化的EV71病毒抗體，質(zhì)控線包被有兔抗鼠免疫球蛋白，質(zhì)控線側(cè)貼有吸水墊。檢測時，取待檢樣品一滴，滴在該試紙卡的加樣品孔中，根據(jù)檢測線和質(zhì)控線是否出現(xiàn)色帶來確定樣品內(nèi)是否存在達標(biāo)的EV71病毒。序列表<110>京天成生物技術(shù)(北京)有限公司<120>手足口EV71病毒單克隆抗體及其應(yīng)用<130>KHP09113525.6<150>200810224463·0<151>2008-10-15<160>6<170>PatentInversion3.5<210>1<211>105<212>PRT<213>單克隆抗體雜交瘤細胞<400>1AspValGlnMetThrGlnSerProAlalieMetSerAlaPheProGly151015GluLysValThrMetThrCysSerAlaSerSerSerValAsnTyrMet202530HisTrpTyrGlnGlnLysSerGlyThrSerProLysArgCyslieTyr354045AspThrSerThrLeuAlaSerGlyValProAlaArgPheSerGlySer505560GlySerGlyThrSerTyrSerLeuThrlieSerSerMetGluAlaGlu65707580AspAlaAlaThrTyrTyrCysGlnGlnTrpSerSerAsnProProThr859095PheGlyGlyGlyThrLysLeuGlulie100105<210>2<211>115<212>PRT<213>單克隆抗體雜交瘤細胞<400>2ValLysLeuGlnGluSerGlyGlyGlyLeuValGlnProGlyGlySer151015LeuLysLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheProPheSerSerTyrGly202530MetSerTrpValArgGlnThrProAspLysArgLeuGluLeuValAla354045ThrlieAsnThrAsnGlyGlyLyslieTyrTyrProAspSerValLys505560GlyArgPheThrlieSerArgAspAsnAlaLysAsnThrLeuTyrLeu65707580GlnMetThrSerLeuLysSerGluAspThrAlaMetTyrTyrCysAla859095ArgAspHisSerGlyPheAlaTyrTrpGlyGlnGlyThrThrValThr100105110ValSerSer115<210>3<211>111<212>PRT<213>單克隆抗體雜交瘤細胞<400>3AsplieGluMetThrGlnThrProLeuSerLeuProValSerLeuGly151015AspGlnAlaSerlieSerCysArgSerSerGlnAsnlieValHisArg202530AsnGlyAsnThrTyrLeuGluTrpTyrLeuGlnLysProGlyGlnSer354045ProLysLeuLeulieTyrLysValSerAsnArgValSerGlyValPro505560AspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie65707580SerArgValGluAlaGluAspLeuGlyValTyrTyrCysPheGlnGly859095SerHisValProPheThrPheGlySerGlyThrLysLeuGlulie100105110<210>4<211>117<212>PRT<213>單克隆抗體雜交瘤細胞<400>4ValThrLeuGlnGluSerGlyAlaGluLeuValArgProGlyAlaLeu151015ValLysLeuSerCysLysAlaSerGlyPheAsnlieLysAspHisTyr202530MetHisTrpValArgGlnArgProGluGlnGlyLeuGluTrplieGly354045ArglieAspProGluAsnGlyLysThrlieTyrAspProLysPheGln505560GlyLysAlaThrlieThrSerAspThrSerSerAsnThrAlaTyrLeu65707580GlnLeuSerSerLeuThrSerGluAspThrAlaValTyrTyrCysAla859095ArgThrSerTyrTyrSerAspPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThr100105110ValThrValSerSer115<210>5<211>16<212>PRT<213>人工序列<400>5ProGluSerArgGluSerLeuAlaTrpGlnThrAlaThrAsnProCys151015<210>6<211>16.<212>PRT<213>人工序列<400>6TyrProThrPheGlyGluHisLysGlnGluLysAspLeuGluTyrCys15101權(quán)利要求一種單克隆抗體，其是以EV71病毒的VP1蛋白為靶蛋白，設(shè)計合成多肽序列，與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原，通過所述免疫原制備獲得。2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征在于，所述多肽序列選自SP55=PESRESLAffQTATNPC；SP70:YPTFGEHKQEKDLEYC。3.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述載體蛋白為KLH。4.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體特異性地識別VPl蛋白的SP55序列或SP70序列。5.如權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其特征在于，所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示；或所述單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示，重鏈如可變區(qū)的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。6.產(chǎn)生權(quán)利要求15任一項所述單克隆抗體的雜交瘤細胞。7.含有權(quán)利要求15任一項所述單克隆抗體的檢測試劑盒。8.如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其為ELISA檢測試劑盒，其以特異性地識別VPl蛋白的SP70序列的單克隆抗體為包被抗體，以酶標(biāo)記的異性地識別VPl蛋白的SP55序列的單克隆抗體作為檢測抗體。9.一種檢測試紙卡，包括反應(yīng)膜、樣本墊、結(jié)合物釋放墊和吸水墊，其特征在于所述反應(yīng)膜上具有包被有權(quán)利要求15任一項所述單克隆抗體的測試區(qū)，所述結(jié)合物釋放墊包被有膠體金標(biāo)記單克隆抗體或酶標(biāo)記單克隆抗體，并且檢測區(qū)包被的單克隆抗體與結(jié)合物釋放墊包被的單克隆抗體分別特異性地識別VPl蛋白的SP55序列或SP70序列。10.權(quán)利要求15任一項所述的單克隆抗體、權(quán)利要求7或8所述的檢測試劑盒或權(quán)利要求9所述檢測試紙卡在檢測EV71病毒中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供了手足口EV71病毒的一種單克隆抗體，其是以EV71病毒的VP1蛋白為靶蛋白，設(shè)計合成多肽序列，與載體蛋白偶聯(lián)作為免疫原，通過所述免疫原制備獲得。本發(fā)明提供的單克隆抗體與EV71病毒其他蛋白、CA16病毒以及其他抗原和病原體無交叉反應(yīng)，用于檢測具有高特異性、高敏感性的優(yōu)點，可以準(zhǔn)確檢測樣品中EV71病毒的水平，在臨床檢測中將會得到廣泛應(yīng)用。文檔編號G01N33/577GK101812129SQ20091018080公開日2010年8月25日申請日期2009年10月15日優(yōu)先權(quán)日2009年10月15日發(fā)明者付非,孫樂,孫哲,毛春明,王曉慶,馬樹君申請人:京天成生物技術(shù)(北京)有限公司