專利名稱：腸道病毒口服基因疫苗及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸道病毒口服基因疫苗及其制備和應(yīng)用，具體為利用減毒傷寒沙門菌遞送的一種腸道病毒71型VPl基因疫苗和一種柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗及其制備和應(yīng)用，屬于腸道病毒口服基因疫苗的設(shè)計制造及免疫效果檢測的生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
手足口病嚴(yán)重危害人類尤其是兒童的健康和生命安全，其主要病原是腸道病毒71型(enterovirus 71,EV71)和柯薩奇病毒 A16 型(CoxsackievirusA16,CA16),目前尚無特效的預(yù)防和治療手段。DNA疫苗較傳統(tǒng)的減毒活病毒疫苗或者滅活病毒疫苗,省去了病毒篩選、培養(yǎng)、純化等步驟，僅需獲得抗原序列即可批量生產(chǎn)，大大縮短了疫苗生產(chǎn)周期并降低了成本。采用口服減毒傷寒沙門菌遞送DNA疫苗的方式，接種方便無痛苦，還省去了疫苗純 化的過程，進(jìn)一步降低了疫苗生產(chǎn)成本和縮短了疫苗生產(chǎn)周期。選擇合適的目的基因和載體體外連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，是研究DNA疫苗的關(guān)鍵基礎(chǔ)步驟。對所選目的基因的要求是能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的針對病原抗原的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。EV71和CA16的基因組只含一個大的開放讀碼框架(ORF)，編碼一個較長的多聚蛋白前體。前體蛋白由病毒編碼的蛋白酶切割產(chǎn)生成熟蛋白。該ORF依次分為PU P2和P3三個區(qū)，其中Pl區(qū)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白VPl到VP4，組成病毒衣殼，其中和抗原決定簇主要位于衣殼蛋白VPl上。因此以VPl基因為目的基因構(gòu)建DNA疫苗可獲得較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。減毒傷寒沙門菌是一種細(xì)胞內(nèi)生活菌，通過口服或者鼻黏膜接種后，刺激局部黏膜免疫的同時，大部分減毒傷寒沙門菌還可以穿透過黏膜上皮進(jìn)入肝、脾等器官并長期生存，直接將DNA疫苗遞送于抗原呈提細(xì)胞，提高疫苗利用率并長期穩(wěn)定地誘導(dǎo)系統(tǒng)免疫。重組減毒傷寒沙門菌作為疫苗遞送載體，具有制備簡便、無需佐劑、接種方便、生物利用率高、免疫原性強(qiáng)且持續(xù)時間長等優(yōu)點。本發(fā)明針對利用減毒傷寒沙門菌遞送DNA疫苗的諸多特性和優(yōu)點，采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和手段對其進(jìn)行了進(jìn)一步的研究和改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種腸道病毒VPl基因疫苗，以腸道病毒VPl基因為目的基因構(gòu)建的腸道病毒口服基因疫苗，如以腸道病毒71型(V-EV VPl)和柯薩奇病毒A16型(V-CA VP1)VP1基因為目的基因構(gòu)建的重組腸道病毒口服基因疫苗。本發(fā)明的第二個目的在于公開一種攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-EV VPl)和一種攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-CA VPl)。本發(fā)明的第三個目的在于提供一種攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌和一種攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌用于手足口等疾病的預(yù)防和治療。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用以下技術(shù)方案一種腸道病毒VPl基因疫苗，其特征在于其包括真核細(xì)胞表達(dá)載體VR1012上插入核苷酸序列的腸道病毒VPl基因。一種優(yōu)選的技術(shù)方案，其特征在于所述的腸道病毒VPl基因是腸道病毒71型VPl基因(V-EV VP1)。即一種腸道病毒71型VPl基因疫苗，其包括真核細(xì)胞表達(dá)載體VR1012上插入核苷酸序列的腸道病毒71型VPl基因。腸道病毒71型VPl基因的核苷酸序列，如序列表中序列I所示，該目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為VR1012。一種構(gòu)建腸道病毒71型VPl基因疫苗(V-EV VPl)的方法，其步驟如下首先以含有腸道病毒71型VPl基因的質(zhì)粒pT-EV71-3為模板，用PCR擴(kuò)增出腸道病毒71型VPl基因序列，連入T-Easy載體，再通過雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到腸道病毒71型VPl基因疫苗質(zhì)粒。一種優(yōu)選的技術(shù)方案，其特征在于所述的腸道病毒VPl基因是柯薩奇病毒A16型 VPl基因(V-CA VPl)。即一種柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗，其包括真核細(xì)胞表達(dá)載體VR1012上插入核苷酸序列的柯薩奇病毒A16型VPl基因。柯薩奇病毒A16型VPl基因的核苷酸序列，如序列表中序列3所示，該目的基因的真核細(xì)胞表達(dá)載體為VR1012。一種構(gòu)建柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗(V-CA VPl)的方法，其步驟如下首先以含有柯薩奇病毒A16型VPl基因的質(zhì)粒pT-CA16-TKl為模板，用PCR擴(kuò)增出柯薩奇病毒A16型VPl基因序列，連入T-Easy載體，再通過雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗質(zhì)粒。一種攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-EV VPl)，其穩(wěn)定攜帶腸道病毒71型VPl基因疫苗(V-EV VPl)。一種攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-EV VPl)的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將腸道病毒71型VPl基因疫苗(V-EV VPl)轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門菌SL7207，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶腸道病毒71型VPl基因疫苗質(zhì)粒的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-EV VPl)。一種攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-CA VPl)，其穩(wěn)定攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗(V-CA VPl)。一種攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-CA VPl)的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗(V-CA VPl)轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門菌SL7207，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗質(zhì)粒的重組減毒傷寒沙門菌(SL/V-CA VPl)。基于此，本發(fā)明人設(shè)計構(gòu)建了一種攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌和一種攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌，在治療和預(yù)防手足口等疾病的藥物中的應(yīng)用，將其用于手足口等疾病的預(yù)防和治療。DNA疫苗載體選用質(zhì)粒VR1012，為美國FDA已批準(zhǔn)用于人體基因治療的真核細(xì)胞表達(dá)載體，我國FDA近期也批準(zhǔn)其作為HIV DNA疫苗載體用于人體，其具有多克隆位點包括Pst I和BamH I等，含有CMV啟動子，卡那霉素抗性基因等。DNA疫苗遞送載體選擇減毒傷寒沙門菌SL7207，傷寒沙門菌株SL7207是aroA基因突變株，aroA編碼5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，該酶催化2，4- 二羥基苯甲酸鹽的分支酸途徑的中間反應(yīng)，產(chǎn)生芳香族氨基酸。而哺乳動物不具備該合成途徑，故細(xì)菌從宿主體內(nèi)獲得這些化合物的可能性極小，使得aroA突變株在體外培養(yǎng)時依賴上述化合物生長，但在宿主體內(nèi)只能有限生長繁殖從而得到減毒。應(yīng)用該類重組減毒傷寒沙門菌作為疫苗遞送載體，具有如下優(yōu)點①具有培養(yǎng)簡便、繁殖迅速等優(yōu)越性；②可口服或鼻飼接種，方法簡單無痛苦該疫苗株在體內(nèi)產(chǎn)生的靶抗原的傳送無需附加任何免疫佐劑；④將疫苗直接遞送于抗原呈提細(xì)胞，極大提高疫苗生物利用率；⑤該類菌株可較長時間定居于腸相關(guān)淋巴組織，持續(xù)表達(dá)外源抗原，增強(qiáng)免疫原性，并可產(chǎn)生強(qiáng)大的黏膜免疫反應(yīng)；⑥通過分子生物學(xué)技術(shù)便于構(gòu)建成多價疫苗，易被接種人群接受；⑦一次免疫后在相當(dāng)長時間內(nèi)有效免疫用疫苗無需在體外產(chǎn)生、分離、純化和鑒定對四環(huán)素敏感，如發(fā)生嚴(yán)重副作用可以用四環(huán)素控制。分別用VR1012(對照組)、V-EV VPl和V-CA VPl于0、7、21天肌注方式免疫BALB/C小鼠，同時分別用攜帶VR1012的重組減毒傷寒沙門菌SL/V(對照組)、SL/V-EV VPl和SL/V-CA VPl于0、7、21d灌胃方式免疫BALb/c小鼠。每次免疫前Id割尾取血分離血清行抗體效價測定，免疫結(jié)束后(第28d)取小鼠脾細(xì)胞用ELISpot方法檢測特異性細(xì)胞免疫功能，證實4種疫苗(V-EV VPUV-CA VPUSL/V-EV VPl和SL/V-CA VPl)均能引發(fā)特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)點是改良了基因疫苗接種方式，采用口服減毒傷寒沙門菌的方式遞送腸道病毒基因疫苗。實驗研究證實，SL/V-EV VPl組和SL/V-CA VPl組使小鼠脾淋巴細(xì)胞中Y干擾素產(chǎn)生細(xì)胞數(shù)增多與對應(yīng)的V-EV VPl組和V-CA VPl組相當(dāng)。上述結(jié)果表明我們構(gòu)建的攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌SL/V-EV VPl和攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌SL/V-CA VPl確實能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫和細(xì)胞免疫。以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。


圖I為EV71 VPl PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為CA16 VPl PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖3為pGEM-T Easy/EV71 VPl PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。圖4為pEASY-TlSimple/CA16 VPl PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。圖5為重組質(zhì)粒V-EV71 VPl酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。圖6為重組質(zhì)粒V-CA16 VPl酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。圖7為V-EV71 VPl轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后Western blot檢測結(jié)果。圖8為V-CA16 VPl轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后Western blot檢測結(jié)果。圖9為不同代次的重組減毒傷寒沙門菌SL/V-EV VP1，提取質(zhì)粒后回轉(zhuǎn)DH5 a，再次提取質(zhì)粒酶切結(jié)果。圖10為不同代次的重組減毒傷寒沙門菌SL/V-CA VP1，提取質(zhì)粒后回轉(zhuǎn)DH5 a，再次提取質(zhì)粒酶切結(jié)果。圖11 為 4 種疫苗(V-EV VPUV-CA VPUSL/V-EV VPl 和 SL/V-CA VPl) ELISpot ^測INF-Y分泌細(xì)胞數(shù)。具體實施例方式菌株、細(xì)胞、試劑及實驗器材
限制性核酸內(nèi)切酶Pst I、BamH I、EcoRV和Xba INEB公司
exTaq酶，T4 DNA連接酶寶生物公司
pGEM-T Easy 載體Promega 公司
pEASY-Tl Simple載體全式金公司
X-gal鼎國公司
IPTG鼎國公司
質(zhì)粒小量提取試劑盒博大泰克生物公司
DNA純化試劑盒Qiagen公司
DNA Marker (Trans 2K plus DNAmarker)全式金公司
質(zhì)粒大量提取試劑盒Qiagen公司
卡那霉素鼎國生物公司
感受態(tài)DH5a菌博大泰克生物公司
其余常用生化試劑(國產(chǎn)分析純)上海華美生物公司等
Vero細(xì)胞病毒研究室保存
DMEM北京天潤善達(dá)公司
轉(zhuǎn)染試齊丨J—LipofectinInvitrogin 公司6孔細(xì)胞培養(yǎng)板美國Becton Dickinson Labware公司
硝酸纖維膜PALL公司
4xSDS蛋白上樣液Promega公司
蛋白 Marker (Trans Blue Plus II protein marker)全式金公司
辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG鼎國生物公司
鼠單克隆抗EV71中國食品藥品檢定所
鼠單克隆抗CA71中國食品藥品檢定所
DAB顯色試劑盒北京中杉金橋生物公司SDS-PAGE 試劑15%分離膠(5ml)H2O1.0ml,40% 丙烯凝酰溶液1.875ml
2%亞甲雙0.22ml,IM Tris.Cl (Ph8.7)1.875ml
20%SDS25^1,10%過硫酸銨溶液300
TEMED7.5^15%積層膠(2. 5ml)
H2O1.69ml,40% 丙烯酰凝溶液0.337ml 2%亞甲雙0.175ml,IM Tris.Cl (Ph6.8) 0.312ml
20%SDS12.50,10% 過硫酸銨溶液12.50
TEMED6.250電泳緩沖液(5X)Tris 堿15. Ig,甘氨酸94g10% SDS50ml,H2O補(bǔ)至 1000ml免疫蛋白印跡轉(zhuǎn)移緩沖液Tris 堿5. 8g,甘氨酸2. 9gSDS0.37ml，甲醇200mlH2O補(bǔ)至 1000ml免疫蛋白印跡檢測試劑IOXTris 緩沖鹽(TBS) ILTris 堿24. 2gNaCl80g,H2O 加至 1L，鹽酸調(diào) PH 至 7. 6封閉緩沖液(150ml)H2O135ml，脫脂奶粉7. 5g10XTBS 15ml,100% Tween-20 0.15ml洗液(TBS/T)(200ml)10XTBS20ml,100% Tween-20200 U IH2O加至 200ml一抗稀釋緩沖液(20ml)IXTBS20ml,脫脂奶粉Ig100% Tween-20 20 U I細(xì)胞酶免疫組化試劑4%多聚甲醛(IxPBS 配制)，3%TritonX-100(IxPBS 配制)， 3%H202
/J、鼠淋巴細(xì)胞分離 液達(dá)科為公司
小鼠IFN-yELISpot檢測試劑盒達(dá)科為公司
Cytotox96非放射性細(xì)胞殺傷檢測試劑盒Promega公司
R-3無酚紅1640培養(yǎng)液北京天潤善達(dá)公司
P815細(xì)胞解放軍第三〇二醫(yī)院保存
其余常用生化試劑為國產(chǎn)分析純上海華美公司等主要儀器
MJMini PCR擴(kuò)增儀美國Bio-Rad公司
LG15-W高速微量離心機(jī)北京
低溫高速離心機(jī)日本HITACHI公司
PH儀Hanna公司
Gene-Pfxlser 和 Gene-Pfxlse-Controller美國 Bio-Rad 公司
DYY-III型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀北京六一儀器廠
THZ-C電熱恒溫?fù)u床江蘇太倉儀器廠
超凈工作臺北京哈東聯(lián)設(shè)備廠
SmartSpec Plus分光光度計美國Bio-Rad公司
C02恒溫孵箱德國Heraeus公司
BHC-1360IIA2型超凈工作臺北京哈東聯(lián)儀器公司
DYC型SDS — PAGE電泳及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)北京六一儀器廠
TS-I型脫色搖床江蘇海門其林貝爾公司
LD5-2A離心機(jī)北京通用離心機(jī)廠
C02恒溫孵箱德國Heraeus公司
超凈工作臺北京哈東聯(lián)
ELISpot酶聯(lián)斑點分析儀北京賽智創(chuàng)業(yè)公司實施例I.腸道病毒71型VPl基因疫苗的構(gòu)建I. PCR擴(kuò)增腸道病毒71型VPl基因以本中心保存的質(zhì)粒PT-EV71-10作為模板，分別以上游引物EVF 5 -CTGCAG IatgI GGAGATAGGGT-3’(Pst I)，下游弓丨物 EVR :5’ -GGATCC ^ta]AGGAGTAGTGA-3’ (BamH I)為引物，采用PCR方法擴(kuò)增模板I yl、引物(25 y M)各I yl、5mM dNTP 2u 1U0XPCR Buffer 5111、6叉丁&9酶0.5111、1120 39 y 1，擴(kuò)增條件為 94°C lmin，62°C和72°C 80sec 25個循環(huán)，72°C IOmin結(jié)束。如圖I所示，獲得PCR產(chǎn)物EV71 VPl基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小約891bp，符合預(yù)期長度，圖I為EV71 VPl PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，圖I左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為EV71 VPl基因片段。2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建(I)構(gòu)建 pGEM-T Easy/PCR 產(chǎn)物重組質(zhì)粒PCR 產(chǎn)物 3 iil，pGEM_T Easy 載體 Iyl，
2X Buffer 5 yl，T4DNA連接酶I yl，混勻后室溫(20°C _25°C，下述室溫均為此溫度)放置lh，4°C 過夜。(2) pGEM-T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5 a菌_60°C保存，取出后置冰浴中備用。上述連接產(chǎn)物共IOiil加入IOOiil感受態(tài)細(xì)菌中(同時設(shè)陽性及陰性對照)輕輕混勻，冰浴 30min，42°C熱激 30sec，冰浴 2min,加 LB 400u 1,37°C 250rpm 搖床 lh，取100 u I轉(zhuǎn)化菌涂于含氨芐青霉素(25 u g/ml)、X-gal和IPTG的固體LB培養(yǎng)板，待表面液體晾干后，將培養(yǎng)板倒置于37°C孵箱中培養(yǎng)過夜(12-18h)。
(3)pGEM-T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)?？寺『Y選及擴(kuò)增提取挑取培養(yǎng)板中陽性菌落，置于3ml含氨芐青霉素(25 u g/ml)的LB中，37°C 250rpm搖床過夜(12_18h)。取I. 5ml菌液提取質(zhì)粒，使用博大泰克B型小量質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?，按說明書操作，步驟如下①用干凈的I. 5ml離心管收集約I. 5ml菌液,室溫12，OOOrpm離心3min ;棄盡上清；②加入100 溶液I (含RNase A)，震蕩充分懸浮細(xì)菌；③加入150 ill溶液2，上下顛倒混勻，靜置Imin ；④加入150ii I溶液3,上下顛倒混勻，靜置5min,室溫12，OOOrpm離心5min ；⑤吸附柱置于2ml離心管中，吸附柱中加入420 Ul結(jié)合緩沖液，將步驟④取得的上清小心移入，混勻后室溫靜置Imin,室溫12，OOOrpm離心Imin,棄去液體；⑥加入700 U I漂洗液(已用乙醇稀釋)，室溫12，OOOrpm離心30sec，棄去液體；⑦重復(fù)步驟⑥；⑧空管室溫12，OOOrpm離心2min ；⑨取出吸附柱置于干凈的1.5ml離心管中，加入50iU EB溶液，室溫靜置l_2min ；⑩室溫12，OOOrpm離心Imin收取液體。(4)pGEM-T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切，回收目的片斷用M13、M13R引物測序pGEM-T Easy/PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒，確認(rèn)連接片斷為所需目的基因后，Pst I、BamH I雙酶切Pst I 2 u I+BamH I 2 u I+BSA I y 1+質(zhì)粒 30 y l+10XBufferl0 y 1+H20 55 iil，37°C水浴2h。如圖3所示，為pGEM-T Easy/EV71 VPl PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。pGEM-T Easy/EV71 VPl PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒，經(jīng)Pst I、BamH I雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析，左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為pGEM-T Easy/EV71VP IPCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切，上方條帶為載體pGEM-T Easy，2997bp，下方條帶為EV71VP1片斷，891bp。使用DNA純化試劑盒純化回收，步驟如下①酶切產(chǎn)物100 U I加入瓊脂糖凝膠加樣孔中。②電壓80V，電泳 15min。③紫外線燈下切膠，取酶切片斷，稱重。④加等量(mg/ml)MembraneBinding Solution, 6CTC水浴 lOmin。⑤加樣至吸附柱，室溫12000rpm離心2min,棄離心液。
⑥加700 U I Membrane Wash Solution, 12000rpm 離心 lmin,棄離心液。⑦加500 u I Membrane Wash Solution, 14000rpm 離心 3min,棄離心液。⑧加無菌去離子水50 ii l，12000rpm離心lmin，洗脫目的片段DNA。(5)構(gòu)建重組質(zhì)粒 V-EV71 VPl Pst I、BamH I雙酶切載體VR1012，按照步驟(4)回收約5000bp的載體片段。連接回收的酶切目的片段和酶切載體片段了40嫩連接酶1111，10\8肛€虹1111，酶切片斷+酶切載體共8 Ul (根據(jù)電泳結(jié)果評估載體與酶切片斷濃度，按片斷載體 3 I比例加樣)。連接產(chǎn)物10 iil，按前述方法轉(zhuǎn)染感受態(tài)DH5 a菌，涂于含卡那霉素的半固體LB培養(yǎng)板上，37°C孵育12-18h后挑取陽性菌落，加入3ml含卡那霉素的液體LB37°C培養(yǎng)12_18h。按前述方法提取質(zhì)粒，如圖5所示，為重組質(zhì)粒V-EV71 VPl酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖。載體VR1012插入基因片段為EV71 VP1，經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶Pst I、BamH I雙切后，瓊脂糖凝膠電泳分析確認(rèn)酶切片斷大小為4913bp和891bp，證實連接片斷為所需目的基因，左 側(cè)為DNA Marker ;右側(cè)為重組質(zhì)粒V-EV71 VPl酶切，上方條帶為載體VR1012，下方條帶為EV71 VPl片斷。電泳分析確認(rèn)酶切大小正確后測序，其核酸及氨基酸序列結(jié)果與模板序列完全一致。插入片段EV71 VPl的核苷酸和氨基酸序列見序列表中序列1、2。保存測序正確的質(zhì)粒V-EV71VP1和對應(yīng)的菌液。3 重組質(zhì)粒V-EV71 VPl的大量提取使用QIAGEN公司大量提取質(zhì)粒試劑盒(mega kit)提取重組質(zhì)粒,步驟如下(I)將測序正確的質(zhì)粒所對應(yīng)的菌液Iml轉(zhuǎn)入含卡那霉素(50 ii g/ml)的LB培養(yǎng)液 500ml 中，37°C搖床 300rpm 搖振 12_16h ；(3) 6000 Xg 4°C離心 15min 收獲細(xì)菌；(4)加Buffer P150ml充分重懸細(xì)菌，加入Buffer P2 50ml，顛倒4-6下混勻，室溫放置5min,再加Buffer P350ml,顛倒4_6下混勻，冰浴30min ；(5) 20000 Xg以上4°C離心30min，上清移入干凈離心管，再20000 X g以上4°C離心15min,將上清依靠重力過柱(吸附柱Buffer QBT 35ml預(yù)處理)；(6) Buffer Qff 200ml 過柱，漂洗；(7) Buffer QF 35ml 過柱，洗脫 DNA ；(8)加入24. 5ml異丙醇，混勻，立刻以上4°C離心30min ；(9)加入7ml 70%乙醇，混懸后15000Xg室溫離心lOmin，小心棄去上清；(10)加500 u I去離子水溶解DNA，精密分光光度儀測濃度及260/280nm比值。實施例2.柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗的構(gòu)建I. PCR擴(kuò)增腸道病毒71型VPl基因以本中心保存的質(zhì)粒pT-CA16-TAKl作為模板，分別以上游引物上游引物CAF :5’_GATATCATGGGGGATCCTATT-3，(EcoRV)，下游引物 CAR :5’ -TCTAGATCACAACGTTGTTATC-3，(Xba1)為引物，采用？0 方法擴(kuò)增模板1111、引物(2511]\0各1111、51111 dNTP 2u 1U0XPCRBuffer l、exTaq 酶 0. 1、H20 39 y 1，擴(kuò)增條件為 94°C lmin，62°C和 72°C 80sec 25 個循環(huán)，72°C IOmin結(jié)束。如圖2所示，獲得PCR產(chǎn)物CA16 VPl基因片段，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小約891bp，符合預(yù)期長度，圖2為CA16 VPl PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖，圖2左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為CA16 VPl基因片段。
2.重組質(zhì)粒的構(gòu)建參考實施例I的方法，PCR產(chǎn)物連接pEASY-TlSimple載體，轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，使用EcoRV、Xba I雙酶切，結(jié)果如圖4pEASY-TlSimple/CA16 VPl PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析圖所示pEASY-TlSimple/CA16 VPl PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒，經(jīng)EcoRV、XbaI酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析。左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為pEASY-TlSimple/CA16 VPl PCR產(chǎn)物重組質(zhì)粒酶切，上方條帶為載體pEASY-TlSimple，3829bp，下方條帶為CA16 VPl片斷，891bp0按照前述方法，膠回收CA16 VPl片斷和VR1012載體經(jīng)EcoRV、Xba I酶切后的載體片段，連接這兩個片段，轉(zhuǎn)化擴(kuò)增后提取質(zhì)粒進(jìn)行EcoRV、Xba I雙酶切，結(jié)果如圖6所示重組質(zhì)粒V-CA16 VPl經(jīng)EcoRV、Xba I雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳分析。左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為重組質(zhì)粒V-CA16 VPl酶切，上方條帶為載體VR1012，約5000bp，下方條帶為CA16 VPl片斷，891bp。電泳分析確認(rèn)酶切大小正確后測序，其核酸及氨基酸序列結(jié)果與模板序列完全一致。插入片段CA16VP1的核苷酸和氨基酸序列見序列表中序列3、4。保存測序正確的質(zhì)粒V-CA16 VPl和對應(yīng)的菌液。大量提取質(zhì)粒V-CA16 VPl0實施例3腸道病毒71型VPl基因疫苗和柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗的真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染I.真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞復(fù)蘇，2次傳代后以IO5細(xì)胞/孔的濃度加入I塊六孔培養(yǎng)板，用質(zhì)粒V-EV71 VPUV-CA16 VPl各轉(zhuǎn)染2孔，另2孔作空白對照，嚴(yán)格按轉(zhuǎn)染試劑說明書操作(I)無菌條件下2 U g質(zhì)粒溶于100 U I無血清及抗生素的MEM中；2 ill轉(zhuǎn)染試劑 Lipofectin溶于100 U I無血清及抗生素的MEM中，室溫靜置30_45min。將質(zhì)粒復(fù)合物滴加到轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物中，邊滴加邊混勻，室溫放置15-20min。(2)棄去6孔板里的培養(yǎng)基，并使用2ml無血清及抗生素的MEM洗I次，棄去培養(yǎng)基。(3)向質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物中加入0. 8ml無血清及抗生素的MEM，混勻后滴加到六孔板對應(yīng)的孔中。(4) 370C CO2孵箱中培養(yǎng)4h后，使用2ml含抗生素和血清的MEM置換原有的培養(yǎng)基，繼續(xù)37 °C CO2孵箱中培養(yǎng)至滿48h。(5)培養(yǎng)液移入透析袋中，用PEG20000濃縮至原體積的1/50。細(xì)胞至于冰上，力口少量PBS后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，IOOOXg離心3min后棄上清，加PBS200 混懸細(xì)胞，凍融3次后取上清(細(xì)胞裂解液)。2.免疫印跡檢測(Western blot)收集細(xì)胞細(xì)胞至于冰上，加少量PBS后用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，IOOOXg離心3min后棄上清，加PBS 200 u I混懸細(xì)胞，凍融3次后取上清(細(xì)胞裂解液)。制作聚丙烯酰胺凝膠，細(xì)胞凍融上清液20 ill加4X蛋白上樣液6 iil，煮沸5min。加樣，20 u I/孔，電壓80V電泳8h。取I張硝酸纖維膜，剪成與聚丙烯酰胺凝膠等大，去離子水浸透，放于凝膠上，兩側(cè)各放與聚丙烯酰胺凝膠等大的6層3_濾紙，加轉(zhuǎn)膜液潤濕，趕出氣泡。置于電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中，電流24mA轉(zhuǎn)移lh。轉(zhuǎn)膜后取出硝酸纖維膜，用25ml TBS室溫洗漆硝酸纖維膜5min。用TBS/T 15ml洗漆5minX3次。20ml脫脂奶搖床80rpm室溫封閉lh，TBST IOml沖洗4次。分別加鼠單克隆抗體(V-EV71 VPl使用鼠抗EV71，V-CA16 VPl使用鼠抗CA16)稀釋液IOml (I 1000，一抗稀釋緩沖液稀釋)，搖床50rpm 4°C過夜，TBSTIOml洗滌5minX3次。將膜放入IOml含HRP-結(jié)合的羊抗鼠IgG 二抗(I 2000)的封閉緩沖液中室溫輕輕晃動lh。 用TBS/T15ml洗滌5minX3次。取6mg 3'、3' -二胺基聯(lián)苯胺鹽酸鹽和30H202溶解于IOml PBST，配置成生色底物混合液(這一生色底物混合液應(yīng)在15min內(nèi)使用)。用生色底物混合液浸泡膜，于室溫避光平緩搖動5min。顯色拍照留下記錄。V-EV71 VPUV-CA16 VPl轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后表達(dá)蛋白免疫印記檢測結(jié)果，如圖7、圖8所示，陽性條帶位于34KDa。圖7為V-EV71 VPl轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后Western blot檢測結(jié)果，左側(cè)為蛋白Marker，右側(cè)為重組質(zhì)粒V-EV71 VPl轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后表達(dá)的EV71 VPl蛋白。圖8為V-CA16 VPl轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后Western blot檢測結(jié)果，左側(cè)為蛋白Marker，右側(cè)為重組質(zhì)粒V-CA16 VPl轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后表達(dá)的CA16VP1蛋白。本實施例將構(gòu)建好的V-EV71 VPl、V-CA16 VPl質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，體外培養(yǎng)48h后采用Western blot法檢測細(xì)胞裂解液,結(jié)果二者均成功表達(dá)各自的目的蛋白。通過本實施例，驗證了 V-EV71 VPU V-CA16 VPl在真核細(xì)胞能夠成功表達(dá)預(yù)期蛋白，為進(jìn)一步免疫動物，了解該疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫的能力打下了基礎(chǔ)。實施例4.分別攜帶V-EV71 VPU V-CA16 VPl的重組減毒傷寒沙門菌的構(gòu)建和穩(wěn)定性實驗I.電感受態(tài)減毒傷寒沙門菌的制備(I)使用I. 5ml培養(yǎng)物(靜止期)接種250ml無抗生素的液體LB，37°C培養(yǎng)至菌液 0D600 = 0. 6。(2)冰浴30min，2500Xg、4°C離心15min，使用冰預(yù)冷的水重懸沉淀。(3)再次離心后，小心棄去上清，使用0. 4倍體積的冰預(yù)冷的水重懸沉淀。(4)再次離心，使用0. 02倍體積的冰預(yù)冷的10%甘油重懸沉淀。(5)最后一次離心，然后用0. 002倍體積的冰預(yù)冷10%甘油重懸。(6)按每管40ul分裝，并使用液氮凍結(jié)，_80°C保存。2.電感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化(I)感受態(tài)細(xì)胞在冰上溶解，加入Iug重組質(zhì)粒V-EV71 VPl (或V-CA16 VP1)，輕輕混合后轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中。(2)使用 Gene-Pulser 和Gene-Puls-Controller 進(jìn)行轉(zhuǎn)化。設(shè)置為25 uF, 2. 5KV,200 Q。(3)電擊后，立即加入400ul預(yù)熱至室溫的LB培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)lh。(4)取IOOul菌液涂布于含硫酸卡那霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)16_18h。3.重組減毒傷寒沙門菌的鑒定挑取單克隆菌落轉(zhuǎn)接于3ml含硫酸卡那霉素的液體LB，37°C搖床培養(yǎng)8_10h后，以菌液為模板行PCR鑒定，SL/V-EV VPl以EVF、EVR為引物，SL/V-CA VPl以CVF、CVR為引物，反應(yīng)條件同實驗例I中的VPl基因PCR擴(kuò)增。PCR鑒定正確的菌液送Invitrogen公司測序，同時提取質(zhì)粒回轉(zhuǎn)DH5 a后再次培養(yǎng)提取質(zhì)粒行酶切鑒定。SL/V-EV VPU SL/V-CAVPl測序結(jié)果與各自原始模板的核苷酸序列和氨基酸序列完全一致。
4.重組減毒傷寒沙門菌的體外穩(wěn)定性實驗重組減毒傷寒沙門菌SL/VR-EV VPU SL/VR-EV VPl分別接種于LB培養(yǎng)基，每隔12h轉(zhuǎn)種新鮮培養(yǎng)基一次，連續(xù)傳代10d，再涂布含硫酸卡那霉素的平板，觀察其生長特性。分別在第Id、第5d和第IOd隨機(jī)挑取20個單菌落，接種LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒，回轉(zhuǎn)DH5a抽提質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，以觀察質(zhì)粒在體外培養(yǎng)基上傳代的穩(wěn)定性。酶切大小符合預(yù)期。結(jié)果如圖9、圖10所示圖9為不同代次的重組減毒傷寒沙門菌SL/V-EV VP1，提取質(zhì)粒后回轉(zhuǎn)DH5 a，再次提取質(zhì)粒酶切結(jié)果。左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為第Id、第5d和第IOd重組減毒傷寒沙門菌SL/V-EV VP1，提取質(zhì)粒后回轉(zhuǎn)DH5a，再次提取質(zhì)粒經(jīng)Pst I.BamHI雙酶切后結(jié)果，上方條帶為載體VR1012，約5000bp，下方條帶為EV71 VPl片斷，891bp。圖10為不同代次的重組減毒傷寒沙門菌SL/V-CA VP1，提取質(zhì)粒后回轉(zhuǎn)DH5 a，再次提取質(zhì)粒酶切結(jié)果。左側(cè)為DNA Marker，右側(cè)為第Id、第5d和第IOd重組減毒傷寒沙門 菌SL/V-CA VP1，提取質(zhì)粒后回轉(zhuǎn)DH5a，再次提取質(zhì)粒經(jīng)EcoRV、Xba I雙酶切后結(jié)果，上方條帶為載體VR1012，約5000bp，下方條帶為CA16 VPl片斷，891bp。減毒沙門菌作為口服疫苗，能在宿主體內(nèi)存活較長時間、連續(xù)表達(dá)重組抗原并持續(xù)刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，其穩(wěn)定性極為重要。通過本實施例，我們成功構(gòu)建了能夠分別穩(wěn)定攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌SL/V-EV VPl和穩(wěn)定攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌SL/V-CA VPl。實施例5.通過減毒傷寒沙門菌遞送的腸道病毒71型VPl基因疫苗的免疫效果研究I.免疫動物18只雌性6 8周齡Balb/c小鼠，18 25克，SPF級。隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為VR1012空載體免疫對照組、V-EV VPl免疫組和SL/V-EV VPl免疫組。VR1012和V-EV VPl免疫組使用質(zhì)粒IOOii g(2ii g/yl)脛骨前肌肌注，SL/V-EV VPl免疫組使用SL/V-EV VPl灌胃，重組菌使用5%碳酸氫鈉重懸，I X IO9CFU/只，體積lOOul，各組于0、7、21d各免疫I次，每次免疫前I天割尾取血IOOii I,分離血清。首次免疫28d后處死小鼠,取脾制單細(xì)胞懸液。2小鼠體液和細(xì)胞免疫檢測首次免疫28天后采血處死小鼠，取脾制單細(xì)胞懸液。脾臟淋巴細(xì)胞分離及準(zhǔn)備摘眼球放血處死小鼠后，每組小鼠70%乙醇浸泡消毒后，沿腹部正中線剪開腹腔，無菌取脾臟，置于小鼠淋巴細(xì)胞分離液平皿中，于400目尼龍網(wǎng)上研磨成單細(xì)胞懸液，移至離心管中，加入500ul 1640培養(yǎng)液封閉頁面，2500 Xg離心20min分離脾臟淋巴細(xì)胞，并用無酚紅1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為107/ml。(I)ELISA檢測血清IgG效價0d及免疫后7、21、28d小鼠割尾采血，分離血清，ELISA方法檢測抗體效價，將純化的VPl重組蛋白包被96孔酶聯(lián)板(0. 25ug/孔)，I % TSTA封閉，加入100倍稀釋的血清，依次對倍稀釋，再加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗IgG(l 2000)，測定血清中的IgG抗體水平，第28d抗體效價最高。VPl蛋白疫苗免疫小鼠血清IgG抗體效價測定結(jié)果如表I所示。表I. V-EV VPl、SL/V-EV VPl免疫小鼠血清IgG抗體效價測定
權(quán)利要求
1.一種腸道病毒VPl基因疫苗，其特征在于其包括真核細(xì)胞表達(dá)載體VR1012上插入核苷酸序列的腸道病毒VPl基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腸道病毒VPl基因疫苗，其特征在于所述的腸道病毒VPl基因是腸道病毒71型VPl基因。
3.一種構(gòu)建腸道病毒71型VPl基因疫苗的方法，其步驟如下首先以含有腸道病毒.71型VPl基因的質(zhì)粒PT-EV71-3為模板，用PCR擴(kuò)增出腸道病毒71型VPl基因序列，連入T-Easy載體，再通過雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到腸道病毒71型VPl基因疫苗質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的腸道病毒VPl基因疫苗，其特征在于所述的腸道病毒VPl基因是柯薩奇病毒A16型VPl基因。
5.一種構(gòu)建柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗的方法，其步驟如下首先以含有柯薩奇病毒A16型VPl基因的質(zhì)粒pT-CA16-TKl為模板，用PCR擴(kuò)增出柯薩奇病毒A16型VPl基因序列，連入T-Easy載體，再通過雙酶切及再連接將目的基因連入真核表達(dá)載體VR1012，克隆篩選得到柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗質(zhì)粒。
6.一種攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌，其特征在于其穩(wěn)定攜帶腸道病毒71型VPl基因疫苗。
7.權(quán)利要求6所述的攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將腸道病毒71型VPl基因疫苗轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門菌SL7207，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶腸道病毒71型VPl基因疫苗質(zhì)粒的重組減毒傷寒沙門菌。
8.一種攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌，其特征在于其穩(wěn)定攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗。
9.權(quán)利要求8所述的攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌的構(gòu)建方法，其步驟如下使用電轉(zhuǎn)化儀，將權(quán)利要求3所述的柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗轉(zhuǎn)化至減毒傷寒沙門菌SL7207，克隆篩選得到穩(wěn)定攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因疫苗質(zhì)粒的重組減毒傷寒沙門菌。
10.一種攜帶腸道病毒71型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌和一種攜帶柯薩奇病毒A16型VPl基因的重組減毒傷寒沙門菌，在治療和預(yù)防手足口疾病的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腸道病毒口服基因疫苗及其制備和應(yīng)用，具體為利用減毒傷寒沙門菌遞送的一種腸道病毒口服基因疫苗及其應(yīng)用。首先分別以腸道病毒71型VP1基因和柯薩奇病毒A16型VP1基因為目的基因，使用真核表達(dá)載體，分別構(gòu)建腸道病毒71型VP1基因和柯薩奇病毒A16型VP1基因質(zhì)粒，然后采用電轉(zhuǎn)化的方法，分別轉(zhuǎn)化減毒傷寒沙門菌SL7207，得到分別攜帶腸道病毒71型VP1基因和柯薩奇病毒A16型VP1基因的重組減毒傷寒沙門菌。這兩種重組減毒傷寒沙門菌能有效誘導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫，可用于手足口等疾病的預(yù)防和治療。
文檔編號A61K48/00GK102727908SQ20111022196
公開日2012年10月17日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月11日
發(fā)明者侯俊, 劉澤, 柴艷濤, 沈宏輝, 王志杰, 白冰珂, 羅聲棟, 胡燕, 貌盼勇, 高蓉 申請人:中國人民解放軍第三〇二醫(yī)院, 北京綠竹生物制藥有限公司