一種i-iv型登革熱病毒的通用檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種I-IV型登革熱病毒的通用檢測試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 登革病毒(Dengus virus，DENV)登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬中的一個(gè)血清型 亞群，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊等媒介昆蟲傳播，引起登革熱以及發(fā)病率和死亡率很 高的登革出血熱和登革休克綜合征。世界衛(wèi)生組織將感染了登革病毒患者的臨床癥狀分類 為登革熱(DF)、登革出血熱(DH)和登革休克綜合征(DSS)。感染患者表現(xiàn)出在持續(xù)高熱2-7 天，并伴有頭痛，全身乏力，惡心，嘔吐，肌肉痛和腹痛。近年來，由于全球氣候變暖、人口流 動(dòng)頻繁等因素，登革熱的爆發(fā)和流行范圍有逐年擴(kuò)大和愈演愈烈之勢，其在全球的發(fā)病率 提高了近30倍。在過去兩年中，在地處熱帶和亞熱帶地區(qū)的東南亞、美洲以及西太平洋地 區(qū)，超過100個(gè)國家的25億人受到登革病毒的威脅，在2009-2013年間每年全球登革熱、登革 出血熱的發(fā)病數(shù)均達(dá)3.9億。2015年，截止10月10日僅在中國云南省西雙版納州累計(jì)報(bào)告登 革熱病例超過398例。登革熱是過去50年間世界上最為嚴(yán)重的傳染病之一，已成為嚴(yán)重的全 球性公共衛(wèi)生問題，不僅嚴(yán)重危害人類的健康，還為國家和個(gè)人帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
[0003] 目前由于登革熱治療的特效藥物以及相關(guān)的預(yù)防疫苗還沒有上市。所以登革熱的 診斷對(duì)預(yù)防和治療登革熱起到了至關(guān)重要的作用。在常規(guī)診斷方法主要包括三種，（1)RT-PCR法:登革病毒檢測的方法常規(guī)用的是分離病毒后，通過RT-PCR來檢測；（2)登革病毒抗體 IgM和IgG抗體ELISA檢測法；（3)登革病毒NS1抗原的檢測法。在這三種檢測方法中，RT-PCR 法為最經(jīng)典的檢測方法，但是由于其操作時(shí)間長，成本也最高，所以不太適合臨床大量樣本 的處理和檢測。而第二種登革病毒抗體IgM和IgG抗體ELISA檢測法，雖然其具有特異性、敏 感性以及穩(wěn)定性較高的特點(diǎn)，但其只有在登革病毒感染5-7天后才能檢測出來。第三種NS1 抗原檢測法與第二種方法相比，能在最初感染的時(shí)候被檢測出來，對(duì)于登革熱的早發(fā)現(xiàn)、早 干預(yù)及早治療具有重要意義。而且NS1抗原的檢出濃度對(duì)于登革熱患者的預(yù)后具有重要的 指導(dǎo)意義。但目前的NS1抗原的ELISA檢測試劑盒中的包被抗體和檢測抗體，其來源大多都 為天然NS1抗體免疫后所得的抗體，由于登革病毒有四個(gè)型別，所以其抗體的制作過程會(huì)相 對(duì)復(fù)雜，成本也會(huì)相應(yīng)的有所提高。因此，制作操作簡單、早期檢測、快速準(zhǔn)確且成本低的新 型的登革病毒NS1抗原的ELISA檢測試劑盒對(duì)于普通人民有著重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1特異表位肽的I-IV型登革熱病毒的通用檢測試劑盒，通過檢測血清中登革病毒中的非 結(jié)構(gòu)蛋白NS1，可對(duì)早期感染登革熱的病人進(jìn)行早期診斷和最后的確診，還可以通過檢測非 結(jié)構(gòu)蛋白NS1的量來指導(dǎo)病人的病情。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0006] -種I-IV型登革熱病毒的通用檢測試劑盒，包括酶標(biāo)記板、陰性對(duì)照血清、陽性對(duì) 照重組蛋白、檢測抗體、顯色底物和終止液；
[0007] 所述酶標(biāo)記板上的包被抗體為DV14抗體，所述的DV14抗體的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；
[0008] 所述的陰性對(duì)照血清為沒有感染登革熱病毒的正常人的血清；
[0009] 所述的陽性對(duì)照重組蛋白包括四種型別的NS1重組蛋白；
[0010] 所述的四種型別的NS1重組蛋白的制備方法均是將登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增 后，與PMD19T載體連接，連接產(chǎn)物與pET30a經(jīng)BamHI和Notl雙酶切后，膠回收，T4DNA連接酶 連接回收產(chǎn)物，然后再轉(zhuǎn)到大腸桿菌BL-21中，通過表達(dá)純化，得到相應(yīng)型別的NS1重組蛋 白；
[0011] 所述的登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株包括I-IV型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株；
[0012] 所述的檢測抗體為連接了生物素的DV11抗體，所述的DV11抗體的氨基酸序列如 SEQ ID No.2；
[0013] 所述的顯色底物包括酶標(biāo)親和素抗體和TMB顯色液;所述的酶標(biāo)親和素抗體為HRP 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗；
[0014] 所述的終止液為2M的硫酸。
[0015]進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的DV14抗體的制備方法為:將如SEQ ID No. 1的氨基酸序列 編碼的多肽DV14與牛血清蛋白連接后免疫小鼠所得的單克隆抗體。
[0016]進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的DV14抗體的制備方法為:將多肽DV14與牛血清蛋白連接 后，得到DV14-BSA抗原；
[0017]用生理鹽水將DV14-BSA稀釋并與弗氏完全佐劑乳化，至乳化液中DV14-BSA的濃度 為lyg/μL，然后將乳化液于小鼠皮下多點(diǎn)注射，選用6-8周齡雌性Balb/c小鼠，以每只小鼠 免疫1〇〇μ1的的乳化液來免疫，每只小鼠免疫的抗原量為l〇〇yg;然后分別在第21天、第35 天、第49天后用相同的辦法進(jìn)行第二次、第三次以及第四次免疫;經(jīng)四次免疫過后，取小鼠 脾細(xì)胞，按1:4(v/v)的比例將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞進(jìn)行混合，總體積20ml，混合前骨 髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞的密度均調(diào)節(jié)為1〇 7個(gè)/ml，850rpm離心5min，棄掉上清，然后在37°C水浴 中于1分鐘內(nèi)邊搖邊滴加 lml的50%(v/v)PEG-1400的GKN溶液，滴加完后于2分鐘內(nèi)再加入 20ml預(yù)熱至37°C的1640培養(yǎng)基以終止融合，1000r/min離心，去上清，用60ml含10% (v/v)胎 牛血清的1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并每孔100μ1加入預(yù)先加好飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板中，于37°C、 5%C0 2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后，把含10% (v/v)胎牛血清的1640培養(yǎng)基換成含有HAT的選擇培 養(yǎng)基，同樣條件下培養(yǎng)，每隔2天換一次新的HAT選擇培養(yǎng)基，待細(xì)胞長至39-41 %的時(shí)候，把 含有HAT的選擇培養(yǎng)基換成含有HT的培養(yǎng)基，通過有限稀釋法得到了DV14單克隆細(xì)胞株；
[0018] 選取6-8周齡的BALB/c小鼠提前一周用石蠟油來致敏小鼠，注射2ml的106個(gè)/ml的 DV14單克隆細(xì)胞株來制備腹水，最后采用Millpore公司Montage Antibody purification kit試劑盒來純化腹水，得到包被抗體DV14。
[0019] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述酶標(biāo)記板的制備方法是:將所述的包被抗體DV14用包被緩 沖液稀釋到2.5μg/ml后，按100μ1/孔包被到酶標(biāo)記板的微孔內(nèi)，在4°C條件下，將酶標(biāo)記板 置于濕盒中反應(yīng)24小時(shí)后，用TOST洗板，每孔TOST用量為0.25ml，在4°C下，按每孔200μ1放 入3%(m/v)的脫脂奶粉封閉酶標(biāo)記板，封閉24小時(shí)后，棄除多余的封閉液，置4°C保存，即得 到酶標(biāo)記板；
[0020] 所述的包被緩沖液的口11為9.6，每10001111包被緩沖液中含如2(：03 1.598、 NaHC032.93g；
[0021] 所述的PBST為含有0.05% (v/v)吐溫20的磷酸緩沖液；
[0022]所述的3%(m/v)的脫脂奶粉為以PBST為溶劑，以脫脂奶粉為溶質(zhì)配成的溶液。 [0023]進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的陽性對(duì)照NS1重組蛋白的制備方法為：
[0024]①將登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到NS1全基因；
[0025] ②將NS 1全基因與pMD 19T載體連接，制備PMD19T-NS1質(zhì)粒；
[0026] ③將pMD19T-NSl質(zhì)粒以及空表達(dá)載體pET30a同時(shí)采用BamHI和Notl進(jìn)行雙酶切， 膠回收NS1目的片段與雙酶切后的表達(dá)載體pET30a質(zhì)粒片段，然后采用T4DNA連接酶將膠回 收的NS1目的片段與表達(dá)載體pET30a質(zhì)粒片段進(jìn)行連接，得到pET30a-NSl質(zhì)粒；
[0027]④將pET30a-NSl質(zhì)粒到大腸桿菌BL-21中，然后通過表達(dá)純化，得到NS1重組蛋白； [0028] 所述的登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株為I型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株DVIAg.st、Π 型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株DV2 16681、ΙΠ 型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株DV3H87和IV型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株DV4H241;
[0029]所述的RT-PCR擴(kuò)增時(shí)，I型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株DVIAg. st的擴(kuò)增引物為：
[0030] F：5'-GGATCCGACTCGGGATGTGTAATCAACT-3'(SEQ ID No.3)；
[0031] R：5'-GCGGCCGCTGCAGAGACCATTGACTTAACTAGG-3'(SEQ ID No.4)
[0032] Π 型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株DV2 16681的擴(kuò)增引物為：
[0033] F：5'-GGATCCGATAGTGGTTGCGTTGTGAGCTGG-3'(SEQ ID No.5)；
[0034] R：5'-GCGGCCGCAGCTGTGACCAAGGAGTTGACC-3'(SEQ ID No.6)；
[0035] ΙΠ 型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株DV3H87的擴(kuò)增引物為：
[0036] F：5'-GGATCCGACATGGGGTGTGTCATAAACT-3'(SEQ ID No.7)；
[0037] R：5'-GCGGCCGCCGCTGAGACTAAAGACTTTACCATG-3'(SEQ ID No.8)；
[0038] IV型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株DV4H241的擴(kuò)增引物為：
[0039] F：5'-GGATCCGACATGGGTTGTGTGGCGTCATGGA-3'(SEQ ID No.9)；
[0040] R:5'-GCGGCCGCGGCCGTCACCTGTGATTTGACCA-3'（SEQ ID No.10)。
[0041] 進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的檢測抗體的制備方法為將生物素與DV11抗體連接所得的 抗體，即為檢測抗體；
[0042]檢測抗體在進(jìn)行檢測時(shí)，將檢測抗體（lyg/yl)與溶劑按照體積比為1:3000進(jìn)行配 制后進(jìn)行檢測，該溶劑為PBS;
[0043]而所用的顯色底物中的酶標(biāo)親和素抗體在使用時(shí)，將酶標(biāo)親和素抗體（lyg/yl)與 溶劑按照體積比為1:2000進(jìn)行配制后進(jìn)行檢測，該溶劑為包被緩沖液；
[0044]所述的DV11抗體的制備方法是將如SEQ ID如.2的氨基酸序列編碼的多肽0￥11與 牛血清蛋白連接后免疫小鼠所得的單克隆抗體。
[0045]進(jìn)一步，優(yōu)選的是所述的DV11抗體的制備方法是:將多肽DV11與牛血清蛋白連接 后，