抗手足口病病毒雞卵黃抗體的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗手足口病病毒雞卵黃抗體，同時(shí)公開了其制備方法，通過(guò)制備手足口病病毒復(fù)合免疫抗原、免疫產(chǎn)蛋母雞，獲得免疫雞蛋、從免疫雞蛋蛋黃液提取抗手足口病病毒雞卵黃抗體粗品，并對(duì)粗品進(jìn)行超濾純化、除菌過(guò)濾、超低溫噴霧干燥處理后，制得抗手足口病病毒雞卵黃抗體。該產(chǎn)品成本低、產(chǎn)量高、具有高特異性，可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。本發(fā)明還提供了所述的抗手足口病病毒雞卵黃抗體在各種消毒噴霧劑、濕巾、免洗洗手液及免疫檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】抗手足口病病毒雞卵黃抗體的制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物免疫學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種抗手足口病病毒雞卵黃抗體的制備方法及應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]手足口病(Hand-foot-mouth disease, HFMD)又名發(fā)瘆性水皰口腔炎，是由一組腸道病毒引起的常見傳染病，臨床表現(xiàn)以發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皰瘆為主要臨床特征的一種急性傳染病。該病全年均可發(fā)病，多發(fā)于夏秋季，以糞口傳播途徑為主，也可通過(guò)接觸或呼吸道傳染。手足口病的易感人群基本是五歲以下兒童，并容易引起重癥和死亡，嚴(yán)重威脅兒童健康。2008年我國(guó)首次將手足口病納入法定傳染病。自2008年安徽阜陽(yáng)暴發(fā)手足口病疫情以來(lái)，手足口病已引起全國(guó)范圍內(nèi)的流行。
[0003]引起手足口病的病原主要是隸屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬的腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組(CA)的4、5、7、9、10、16型。其中，EV71和CA16是手足口病的主要致病病毒，歷年全世界出現(xiàn)的手足口病大爆發(fā)都是EV71感染和CA16感染交替或合并引起。
[0004]研宄發(fā)現(xiàn)手足口病病人可以通過(guò)呼吸道分泌物、皰瘆液和糞便排泄病毒，而且經(jīng)呼吸道和腸道排毒的最長(zhǎng)時(shí)間分別達(dá)4周和6周，而且該病主要侵犯5歲以下的兒童，兒童個(gè)人衛(wèi)生行為難以控制，隔離也比較困難，這給手足口病的預(yù)防帶來(lái)了困難，所以研制預(yù)防用產(chǎn)品和疫苗是防控手足口病的重要手段。
[0005]體外用的特異性預(yù)防性產(chǎn)品應(yīng)成為預(yù)防手足口病的首選，特別是手足口病主要通過(guò)呼吸道、接觸和糞口途徑傳播，研制一種能夠特異地在體外抑制EV71和CA16病毒活性和感染性的抗體產(chǎn)品將能有效阻斷病毒的傳播，對(duì)于防止和減少手足口病的發(fā)生具有重大意義，同時(shí)也具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0006]雞卵黃抗體具有安全方便、簡(jiǎn)單易得、產(chǎn)率高、成本低、特異性強(qiáng)、不與IgG發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)；且性能穩(wěn)定，活性保持良好等優(yōu)點(diǎn)，正成為醫(yī)藥領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。因此抗手足口病病毒雞卵黃抗體的研制對(duì)手足口病的預(yù)防具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是針對(duì)上述手足口病病毒感染難以預(yù)防和治療的問(wèn)題，提供一種安全、有效的主動(dòng)性預(yù)防手足口病的抗手足口病病毒雞卵黃抗體。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述抗手足口病病毒雞卵黃抗體的制備方法。
[0009]本發(fā)明還有一個(gè)目的是利用抗手足口病病毒雞卵黃抗體，可以制成各種預(yù)防手足口病的制劑，包括各種消毒噴霧劑、濕巾、免洗洗手液等，以及在制備免疫檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:制備EV71和CA16病毒，確定其TCID50值，稀釋后等比例混合、乳化制成手足口病病毒復(fù)合免疫抗原；用該抗原注射免疫產(chǎn)蛋母雞，獲得免疫雞蛋；將獲得的免疫雞蛋消毒、去除蛋清及蛋黃膜，留取蛋黃部分，通過(guò)水稀釋法提取、離心分離獲得水溶性組分，并用聚乙二醇6000或硅藻土提取獲得抗手足口病病毒雞卵黃抗體粗品；將粗品用純化水溶解后，進(jìn)彳丁超濾純化，截留相對(duì)分子量30KD~150KD濾液；將超濾截留液進(jìn)行除菌過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)超低溫噴霧干燥，制得抗手足口病病毒雞卵黃抗體成品，4°C保存。并進(jìn)行純度、活性檢測(cè)。

【具體實(shí)施方式】
[0011]下面的實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。
[0012]實(shí)施方式一:抗手足口病病毒雞卵黃抗體的制備。
[0013](I)手足口病病毒的制備:分別將EV71和CA16病毒株接種到生長(zhǎng)至單層的橫紋肌肉瘤細(xì)胞RD細(xì)胞中，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變CPE++++時(shí)收獲，-20 0C凍融3次，離心分離，加入PBS稀釋純化后病毒液，確定EV71和CA16的TCID50值，56°C高溫滅活30min，4°C保存。
[0014](2)手足口病病毒復(fù)合免疫抗原的制備:根據(jù)TCID50值，將上述EV71和CA16病毒分別用0.01mol/L磷酸鹽緩沖液PBS (pH=7.2)進(jìn)行稀釋，取等量稀釋好的EV71和CA16病毒進(jìn)行等比例混合，并與弗氏完全佐劑按照1:1 (V/V)充分乳化后制得免疫抗原。
[0015](3)用手足口病病毒復(fù)合免疫抗原免疫產(chǎn)蛋母雞:取健康適齡的產(chǎn)蛋母雞，在雞雙翅軸骨頭下的臂三角肌、背部等位置用乳化好的復(fù)合免疫抗原進(jìn)行肌肉、皮下多點(diǎn)注射，以使蛋雞產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)；首次免疫采用弗氏完全佐劑，其余采用弗氏不完全佐劑；首次免疫前收集未免疫雞蛋作為陰性對(duì)照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次，每次免疫劑量為0.2~lml/只，共免疫4~6次；用ELISA跟蹤檢測(cè)免疫雞蛋中抗手足口病病毒雞卵黃抗體的效價(jià)，收集高效價(jià)免疫雞蛋(1:1024)，將每日收集的免疫雞蛋編號(hào)，4°C下保存。
[0016](4)抗手足口病病毒雞卵黃抗體的提取和純化。
[0017]SI將獲得的免疫雞蛋用0.1%新潔爾滅消毒，純化水沖洗干凈，敲破，去除蛋清及蛋黃膜，留取蛋黃部分，測(cè)定所收集的蛋黃體積，水稀釋法提取:按比例1:6~12比例加入純化水，用lmol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH為5.2-5.6，4°C條件下靜置過(guò)夜，6000~10000r/min離心，取上清液，測(cè)定所收集上清液的體積。
[0018]S2在SI步驟制得的上清液中稍慢速度攪拌下加入PEG6000或者硅藻土，充分?jǐn)嚢韬?，置于高速冷凍離心機(jī)中，在10°c下以6000~10000r/min r/min，離心，傾去上清液，沉淀部分即為抗手足口病病毒雞卵黃抗體粗品。
[0019]S3用純化水溶解S2步驟制得的粗品至上清液初體積，用超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，超濾截留相對(duì)分子量為30KD~150KD濾液，將超濾截留液進(jìn)行除菌過(guò)濾，即可制得抗手足口病病毒雞卵黃抗體純品。
[0020]S4抗手足口病病毒雞卵黃抗體純品進(jìn)行超低溫噴霧干燥，即制得抗手足口病病毒雞卵黃抗體，4°C保存。
[0021]實(shí)施方式二:抗手足口病病毒雞卵黃抗體的純度檢測(cè)。
[0022]采用醋酸纖維膜電泳分離并測(cè)定抗流感病毒雞卵黃抗體純度，醋酸纖維膜電泳是以醋酸纖維膜為支持物的電泳方法。醋酸纖維膜由二乙酸纖維素制成，它具有均一泡沫樣的結(jié)構(gòu)，厚度僅120微米，有強(qiáng)滲透性，對(duì)分子移動(dòng)無(wú)阻力，作為區(qū)帶電泳的支持物進(jìn)行蛋白電泳有簡(jiǎn)便、快速，樣品用量少，應(yīng)用范圍廣，分離清晰，沒(méi)有吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、糖蛋白、同工酶的分離和鑒定。檢測(cè)結(jié)果表明:純度彡 40% ο
[0023]實(shí)施方式三:抗手足口病病毒雞卵黃抗體的ELISA效價(jià)活性檢測(cè)。
[0024]采用“ELISA法”(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))檢測(cè)本發(fā)明的工藝制取的抗流感病毒雞卵黃抗體的ELISA效價(jià)。檢測(cè)結(jié)果表明，效價(jià)達(dá)到了 1:1280。
[0025]實(shí)施方式四:抗手足口病病毒雞卵黃抗體的應(yīng)用。
[0026]利用抗手足口病病毒雞卵黃抗體，可以制成各種預(yù)防手足口病的制劑，包括各種消毒噴霧劑、濕巾、免洗洗手液等；在制備免疫檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，具體包括:免疫電泳、ELISA、免疫沉淀、免疫印跡、抗體芯片、時(shí)間分辨熒光免疫分析和免疫細(xì)胞學(xué)等一系列免疫診斷技術(shù)，用以檢測(cè)相應(yīng)的手足口病抗原。
【權(quán)利要求】
1.一種抗手足口病病毒雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (O手足口病病毒復(fù)合免疫抗原的制備: 制備出EV71和CA16病毒，確定其TCID50值，進(jìn)行病毒滅活；根據(jù)TCID50值，將EV71和CA16病毒分別用0.0lmol/L磷酸鹽緩沖液PBS (pH=7.2)進(jìn)行稀釋，取等量稀釋好的EV71和CA16病毒進(jìn)行等比例混合，并與弗氏完全佐劑按照1:1 (V/V)充分乳化后制得免疫抗原； (2)用制得的手足口病病毒復(fù)合免疫抗原對(duì)產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行免疫，獲得免疫雞蛋: 取健康適齡的產(chǎn)蛋母雞，在雙翅軸骨頭下的臂三角肌、背部等位置用乳化好的復(fù)合免疫抗原進(jìn)行肌肉、皮下多點(diǎn)注射，以使蛋雞產(chǎn)生更好的免疫反應(yīng)；首次免疫采用弗氏完全佐劑，其余采用弗氏不完全佐劑；首次免疫前收集未免疫雞蛋作為陰性對(duì)照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次，每次免疫劑量為0.2~lml/只，共免疫4~6次；用ELISA跟蹤檢測(cè)免疫雞蛋中抗手足口病病毒雞卵黃抗體的效價(jià)，收集高效價(jià)免疫雞蛋(1:1024)，將每日收集的免疫雞蛋編號(hào)，4°C下保存； (3)提取、純化:將獲得的免疫雞蛋消毒、去除蛋清及蛋黃膜，留取蛋黃部分，通過(guò)水稀釋法提取、離心分離獲得水溶性組分，并用聚乙二醇6000或硅藻土提取獲得抗手足口病病毒雞卵黃抗體粗品；將粗品用純化水溶解后，進(jìn)行超濾純化，截留相對(duì)分子量30KD~150KD濾液；將超濾截留液進(jìn)行除菌過(guò)濾，再經(jīng)過(guò)超低溫噴霧干燥，制得抗手足口病病毒雞卵黃抗體成品，4°C保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法制備得到的抗手足口病病毒雞卵黃抗體的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于制備成各種預(yù)防手足口病的制劑，包括各種消毒噴霧劑、濕巾、免洗洗手液等，以及在制備免疫檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/02GK104497138SQ201410739799
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】盧曉露, 陳文彪 申請(qǐng)人:廣東京豪醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司