纖維連接蛋白抑制劑-四肽rgds在制備抗ev71病毒藥物的用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種纖維連接蛋白（FN）抑制劑?四肽RGDS的抗EV71病毒作用。本發(fā)明證實使用FN抑制劑RGDS處理人橫紋肌肉瘤細胞可以抑制EV71病毒的感染，進一步的研究表明FN抑制劑?四肽RGDS是通過阻斷病毒入侵到細胞的步驟達到抗EV71病毒的作用。此外，F(xiàn)N抑制劑?四肽RGDS可以阻斷EV71感染小鼠并改善其健康狀況，提高其存活率。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)四肽RGDS具有抵抗EV71病毒感染的活性。為預(yù)防或治療EV71感染提供潛在的策略。
【專利說明】
纖維連接蛋白抑制劑-四肽RGDS在制備抗EV71病毒藥物的 用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及四肽RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)的藥物新用途，具體 是其在制備抗EV71病毒藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 感染人類的腸道病毒71型(EV71)可以在全世界，尤其是亞洲太平洋地區(qū)，造成嬰 幼兒的手足口疾病的感染，有時候會引發(fā)神經(jīng)性的或者系統(tǒng)性的并發(fā)癥。EV71是基因組很 小的單股正鏈RNA病毒，大約7500個堿基。RNA基因組有一個開放閱讀框編碼一個多聚蛋白， 該蛋白可以切割為11個蛋白，其中包括:4個衣殼蛋白（VP1-4)和7個非結(jié)構(gòu)蛋白（2A-C、3A-D)。在這些病毒蛋白中，衣殼蛋白VPl在病毒的感染過程中影響病毒的毒力和嗜神經(jīng)性以及 病毒對細胞的入侵。
[0003] 纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N)是一個定位于細胞外基質(zhì)的廣泛分布的多結(jié)構(gòu) 域的大分子量糖蛋白。它的分子量大約230KD-250KD，除了在胞外基質(zhì)中，在血清中的含量 也很豐富。FN的結(jié)構(gòu)較為特殊，由三種模塊排列組合而成，分別是I型模塊，II型模塊和III 型模塊。在I型模塊和II型模塊之間有兩個分子內(nèi)的二硫鍵可以穩(wěn)定折疊的分子結(jié)構(gòu)。III 型模塊沒有二硫鍵連接，是由7個串聯(lián)的β折疊的結(jié)構(gòu)形成。FN的亞單位或者說結(jié)構(gòu)域介導(dǎo) 了FN的自組裝以及和膠原蛋白、整聯(lián)蛋白、肝素、FN以及其他的胞外基質(zhì)分子的配體結(jié)合過 程。兩個FN分子通過C末端的一對反向二硫鍵可以形成一個500KD的二聚體。通過可變剪切 可以產(chǎn)生多種亞型的FN分子。在嚙齒類動物和牛體內(nèi)，一個FN基因的轉(zhuǎn)錄本可編碼12個亞 型;在人體內(nèi)，F(xiàn)N基因轉(zhuǎn)錄本編碼20種亞型。通過在EIIIA/EDA和EIIIB/EDB之間的外顯子跳 讀以及V區(qū)/IIICS的外顯子細分，可以產(chǎn)生多種可變剪切。分泌的FN分子是二硫鍵連接的， 可溶的，不活躍的二聚體形式，一旦和a5bl或者其他整聯(lián)蛋白相互作用，F(xiàn)N分子就會被激 活。四肽RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)是FN細胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的最關(guān)鍵的組分，游離的四肽RGDS可 以作為FN的抑制劑阻斷FN結(jié)合到細胞表面的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供精-甘-天冬-絲氨酸四肽RGDS在制備抗腸道病毒71型藥物中 的應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明通過體外以及小鼠體內(nèi)實驗證明FN抑制劑-四肽RGDS具有抗EV71病毒作 用；以及FN抑制劑-四肽RGDS是通過阻斷病毒蛋白結(jié)合到細胞表面并與細胞受體結(jié)合而具 有抗EV71病毒的功效。
[0006] 具體采用以下技術(shù)方案：
[0007] FN抑制劑-四肽RGDS在細胞和分子水平上對EV71病毒感染有抑制作用，預(yù)示FN抑 制劑-四肽RGDS可以做為臨床抗病毒藥物而進一步研究開發(fā)。首先使用FN特異性的抑制劑-四肽RGDS預(yù)處理人橫紋肌肉瘤細胞，再感染EV71病毒，發(fā)現(xiàn)病毒的感染被極大程度的阻斷， 而且四肽RGDS是通過阻斷病毒蛋白結(jié)合到細胞表面并與細胞受體結(jié)合而具有抗EV71病毒 的功效;在小鼠體內(nèi)同時腹腔注射FN抑制劑-四肽RGDS和EV71病毒，然后檢測小鼠體內(nèi)病毒 感染的載量和小鼠的健康狀況以及存活率，發(fā)現(xiàn)FN抑制劑-RGDS對小鼠本身無明顯毒性，但 是可以抑制EV71對小鼠的感染并提高小鼠的健康狀況以及存活率。
[0008] 本發(fā)明揭示了四肽RGDS的一種新的生物學(xué)功能，能有效的抑制EV71病毒結(jié)合到細 胞表面及入侵并達到抗EV71病毒效果的機制；本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)FN抑制劑-RGDS對小鼠本身無 明顯毒性。為研制抗EV71病毒藥物提供了理論和事實基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0009] 圖I FN抑制劑-四肽RGDS可以抑制EV71感染人橫紋肌肉瘤細胞并在病毒的入侵步 驟發(fā)揮作用
[0010] A.對照組PBS和實驗組抑制劑對EV71感染人橫紋肌肉瘤細胞的影響(RNA水平）；
[0011 ] B.對照組PBS和實驗組抑制劑對EV71感染人橫紋肌肉瘤細胞的影響（蛋白水平）；
[0012] C.對照組PBS和實驗組抑制劑對細胞活性的影響的檢測；
[0013] D.不同時間點給藥(抑制劑處理)對EV71感染人橫紋肌肉瘤細胞的影響(胞內(nèi)病毒 RNA水平）；
[0014] E.不同時間點給藥(抑制劑處理)對EV71感染人橫紋肌肉瘤細胞的影響(胞外病毒 載量）；
[0015] 圖2 FN抑制劑-四肽RGDS可以抑制EV71感染小鼠并提高小鼠的健康狀況和存活率
[0016] A.對照組PBS和實驗組抑制劑（inhib i tor)對小鼠體重影響的檢測；
[0017] B.對照組PBS和實驗組抑制劑對EV71感染的小鼠體重影響的檢測；
[0018] C.對照組PBS和實驗組抑制劑對EV71感染的小鼠健康狀況影響的檢測；
[0019] D.對照組PBS和實驗組抑制劑對EV71感染的小鼠存活率影響的檢測；
[0020] E.對照組PBS和實驗組抑制劑對EV71感染的小鼠體內(nèi)腦干和骨骼肌中病毒載量影 響的檢測；
[0021 ] F.對照組PBS和實驗組抑制劑對EV71感染的小鼠體內(nèi)腦干和骨骼肌中病毒蛋白含 量影響的檢測；
【具體實施方式】
[0022]通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施 例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。
[0023]【實施例1】FN抑制劑-四肽RGDS抑制EV71病毒感染人橫紋肌肉瘤細胞并在病毒的 入侵階段發(fā)揮作用
[0024] 實驗材料
[0025] 1、細胞、病毒毒株
[0026]人橫紋肌肉瘤細胞系RD由中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)提供，由本實驗室保 存。EV71病毒由本實驗室從感染者體內(nèi)分離純化。
[0027] 2、生化試劑及試劑盒
[0028] MEM培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco-BRL ,Gaithersburg ,MD)購自武漢生命生物技術(shù)公 司，VPl抗體購自Abnova公司，F(xiàn)N抑制劑-四肽RGDS購自sigma公司。
[0029] 3、逆轉(zhuǎn)錄酶等
[0030] M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA抑制劑(RNas in)購自Promega公司
[0031] Trizol、dNTP和Oligo dT(18T)購自 Invitrogen公司
[0032] SYBR Green PCR Master Mix，購自ABI公司
[0033] 4、耗材及儀器
[0034] 細胞培養(yǎng)板、細胞培養(yǎng)皿和細胞培養(yǎng)瓶購自Corning公司
[0035] 4°C高速離心機、小型高速離心機、二氧化碳細胞培養(yǎng)箱和細胞操作臺購自Herus
[0036] 超純水系統(tǒng)購自mi Ilipore
[0037] 熒光定量 PCR 系統(tǒng) LightCycler480II 購自 Roche
[0038] RNA提取所使用的RNase free的各種型號槍頭和EP管購自Eppendorf
[0039] 常規(guī)PCR儀購自東勝創(chuàng)新 [0040] 超聲破碎儀購自Fisher公司
[0041]凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀及Western轉(zhuǎn)膜儀購自北京君意東方公司 [0042] Western掃描系統(tǒng)購自日本富士公司 [0043]實驗方法
[0044] 1、哺乳動物細胞(貼壁)的培養(yǎng)
[0045] 細胞復(fù)蘇
[0046] 1)預(yù)先準備好37°C_38°C溫水，從液氮罐中取出需要復(fù)蘇的細胞，用眼科手術(shù)鑷子 固定，迅速置于水中，保證凍存管完全浸沒與水中，使其均勻受熱，直到凍存管內(nèi)的細胞完 全融化；
[0047] 2)用酒精消毒凍存管；
[0048] 3)用吸管預(yù)先吸取5ml細胞培養(yǎng)基于T25細胞培養(yǎng)瓶中，再用新的吸管將融化的細 胞轉(zhuǎn)移到細胞瓶中并輕輕吹打一遍；
[0049] 4)蓋好細胞瓶蓋，將細胞瓶放置于細胞培養(yǎng)箱中，37°C，5%C02靜置培養(yǎng)；
[0050] 5)約6-8小時后(取決于不同的細胞），更換信息培養(yǎng)基以消除細胞凍存液中存留 的DMSO對細胞生長的影響。
[0051 ]細胞的傳代和凍存
[0052] 1)當細胞長滿T25細胞瓶后，用吸管吸取培養(yǎng)基并棄去；
[0053] 2)加入IOml的PBS，輕柔洗滌細胞后用吸管吸取并棄去；
[0054] 3)用吸管吸取1-1.5ml胰酶，使其覆蓋住細胞瓶底部，將細胞瓶放入37°C，5 %⑶2 細胞培養(yǎng)箱靜止3_5min(消化時間的長短取決于細胞種類）；
[0055] 4)顯微鏡觀察，貼壁細胞變圓并且全部從細胞瓶壁脫離；
[0056] 5)在細胞操作臺內(nèi)，用吸管吸取約4ml培養(yǎng)基，加入細胞瓶內(nèi)，輕柔的吹打，以吹散 細胞和中和胰酶的消化效果；
[0057] 6)用吸管吸取吹勻的細胞懸液(體積約1/3-2/3)到另一新的細胞瓶，再補加5ml的 培養(yǎng)基，放置于細胞培養(yǎng)箱中，37 °C，5 % CO2的環(huán)境下繼續(xù)靜置培養(yǎng)。
[0058] 2、EV71 感染 RD 細胞
[0059] EV71感染RD前，將含有胎牛血清的完全培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，EV71感染的劑 量為2M0I，感染或處理9h后，收集細胞和培養(yǎng)上清進行下一步實驗。
[0060] 3、逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測目的基因 mRNA的表達水平
[0061] 1)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下
[0063] 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 cC Ih，75Γ IOmin
[0064] 2)Real_time 反應(yīng)體系
[0065]①目的基因的檢測引物和內(nèi)參引物
[0066] VPl:5，-AACGCACGTCATCTGGGATT-3，（ sense)，
[0067] 5，-GTCCAATCGGTGACTGCTCA-3,（antisense)
[0068] GAPDH:5，-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3，（ sense)
[0069] 5，-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3,（antisense)
[0070] ②反應(yīng)體系
[0072]③反應(yīng)程序：
L 〇〇74j 4、Western檢測蛍臼表達水平
[0075] 蛋白制樣（以6孔細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞為例）
[0076] 1)貼壁細胞棄去培養(yǎng)基貼壁細胞棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌一次，再加入一定 量的PBS，細胞刮輕柔刮動細胞生長面，收集細胞；
[0077] 2)4°C，2000rpm離心10min，收集細胞，棄去PBS上清；
[0078] 3)加入60-80μ1已預(yù)先加好蛋白酶抑制劑Cocktail和終濃度為0.5mM DTT，預(yù)冷的 細胞裂解液，用移液槍吹打，重懸細胞；
[0079] 4)超聲破碎儀調(diào)至3檔，冰上超聲，每次3_5s，重復(fù)3次；
[0080] 5)4°C，12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移至另一新的EP管，即得到細胞總蛋白；
[0081] 6)測定樣品蛋白濃度；
[0082] 7)按實驗設(shè)計的上樣量分裝，加入loading buffer，煮沸樣品5min制樣 [0083] SDS-PAGE分離蛋白和轉(zhuǎn)膜曝光
[0084]①SDS-PAGE膠上樣，Tris-gly緩沖液系統(tǒng)電泳分離蛋白，90V進濃縮膠，IIOV進分 離膠，以預(yù)染的蛋白質(zhì)marker為指示；
[0085]②將SDS-PAGE膠從電泳系統(tǒng)中取下，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡，同時將相應(yīng)大小的NC 膜也浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡；
[0086]③按轉(zhuǎn)膜墊、三層濾紙、NC膜、SDS-PAGE膠、三層濾紙、轉(zhuǎn)膜墊的三明治模型制備轉(zhuǎn) 膜芯體系，放入轉(zhuǎn)膜槽，負極對SDS-PAGE膠，正極對NC膜，并且NC膜和SDS-PAGE膠的接觸面 事先做好標記；
[0087]④4°C，70V恒壓轉(zhuǎn)膜2h，轉(zhuǎn)膜結(jié)束，撤下NC膜，用圓珠筆根據(jù)預(yù)染的蛋白質(zhì)marker 的位置，劃定標識，用麗春紅預(yù)染，粗略判斷目的蛋白是否轉(zhuǎn)膜成功 [0088]⑤PBS洗去麗春紅，5 %的脫脂牛奶室溫封閉1-2h，PBS洗去脫脂牛奶，用PBS根據(jù)說 明書的介紹稀釋一抗，室溫孵育Ih;
[0089]⑥TBS-T洗膜緩沖液，搖床洗膜5次，每次5min，用PBS根據(jù)說明書的介紹稀釋二抗， 室溫孵育30min;
[0090]⑦TBS-T洗膜緩沖液，搖床洗膜5次，每次IOmin，濾紙吸管膜上的洗膜緩沖液，按比 例加入曝光底物，暗處孵育5min;
[0091]⑧Western掃描系統(tǒng)采集信號分析。
[0092] 5、EV71拷貝數(shù)快速檢測方法(Real time PCR)
[0093] 1)質(zhì)粒濃度與拷貝數(shù)換算
[0094]①在分光光度計上，取2yL質(zhì)粒溶液測定其濃度，重復(fù)幾次，要求測得濃度值穩(wěn)定， 初步估計質(zhì)粒純度以及是否有蛋白質(zhì)污染的狀況。
[0095] ②配制瓊脂糖凝膠，檢測質(zhì)粒純度及條帶亮度。
[0096] ③根據(jù)以下公式將濃度換算為質(zhì)?？截悢?shù)： r ^ amounl χ 6.022 x 10''
[0097] 拷貝數(shù)=--- lcnglh x I χ 10) χ650
[0098] amount:0D值（ng/yL);
[0099] length:質(zhì)粒DNA喊基對數(shù)目（bp)。
[0100] 2)標準品制備
[0101]將上述已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒用滅菌去離子水進行稀釋，如稀釋到lX101()C〇pieS/yL， 然后再進行倍比稀釋，濃度依次為 IO9，IO8，IO7，IO6，IO6，IO 5，IO4，IO3，IO2，IO1CopiesAiL t3 以 此作為測定EV71拷貝數(shù)的標準品。
[0102] 3)Real-time PCR
[0103] ①反應(yīng)體系：
[0105]②VPl檢測片段引物：
[0106] VPl:5，-AACGCACGTCATCTGGGATT-3，（ sense)，
[0107] 5，-GTCCAATCGGTGACTGCTCA-3,（antisense)
[0108] ③反應(yīng)程序：
[0110] 實驗結(jié)果和討論
[0111] 用FN抑制劑-四肽RGDS(5μg/ml，下同）或者對照I3BS預(yù)處理RD細胞6小時，然后感染 EV71病毒，9小時后檢測病毒感染情況，發(fā)現(xiàn)不論是胞內(nèi)的EV71RNA水平或者病毒VPl的蛋白 水平，實驗組抑制劑處理的含量都顯著低于對照組PBS處理的，這說明FN抑制劑-四肽RGDS 可以抑制EV71病毒感染RD細胞（圖IA，1B)。然后還檢測了抑制劑對細胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)和 對照組PBS相比，實驗組抑制劑對細胞無明顯毒性（圖1C)。在不同的時間點使用抑制劑處理 RD細胞，然后感染EV71病毒，檢測抑制劑在不同時間點對病毒感染的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在病毒 感染前或者感染早期（3H及以前)使用抑制劑處理對EV71感染RD有顯著的抑制作用，而病毒 感染中后期處理卻幾乎沒有顯著的抑制作用（圖1D，1E)，這說明FN抑制劑-四肽RGDS對EV71 病毒感染的抑制作用是在病毒早起的入侵階段發(fā)揮作用的。
[0112] 【實施例2】FN抑制劑-四肽RGDS抑制EV71病毒感染小鼠并改善小鼠的健康狀況，提 高小鼠的存活率
[0113] 實驗材料
[0114] I、SPF級BALB/c小鼠購自上海斯萊克公司
[0115] 2、EV71小鼠適應(yīng)株病毒由武漢大學(xué)潘茲書老師饋贈
[0116] 3、其他使用的試劑，儀器等均和前面所述相同 [0117]實驗方法
[0118] 1、EV71感染初生小鼠（1日齡）；
[0119] 1)準備好合適滴度的EV71小鼠適應(yīng)株病毒；
[0120] 2)配置好FN抑制劑-四肽RGDS(5mg/kg小鼠體重）；
[0121] 3)將對照PBS或者EV71小鼠適應(yīng)株病毒和抑制劑通過腹腔注射進入小鼠體內(nèi)；
[0122] 4)每天觀察小鼠健康狀況，進行臨床得分評判并稱量小鼠體重作好記錄；
[0123] 5)每天觀察小鼠存活狀況，并做好記錄；
[0124] 6)在EV71感染后第八天處死小鼠并分析其腦干和骨骼肌中EV71拷貝數(shù)和病毒VPl 蛋白含量；
[0125 ]小鼠臨床得分標準：
[0126] 〇 健康
[0127] 1皮毛褶皺，駝背
[0128] 2肌無力，行動遲緩
[0129] 3-后肢癱瘓
[0130] 4雙后肢癱瘓
[0131] 5垂死或者死亡
[0132] 實驗結(jié)果和討論
[0133] 通過前面的實驗我們已經(jīng)證明，在體外實驗中，F(xiàn)N抑制劑-四肽RGDS可以有效抑制 EV71病毒感染細胞，那么在體內(nèi)是否存在相似的效果呢?首先，我們驗證了 FN抑制劑-四肽 RGDS對小鼠健康狀況和體重的影響，我們發(fā)現(xiàn)和對照組I3BS處理相比，F(xiàn)N抑制劑處理后，小 鼠的健康狀況和體重沒有任何顯著性的差異（圖2A)，這說明FN抑制劑對小鼠沒有毒性。接 下來，我們檢測了FN抑制劑處理對小鼠感染EV71后體重變化以及臨床指標的影響，發(fā)現(xiàn)FN 抑制劑可以顯著恢復(fù)EV71病毒感染導(dǎo)致的小鼠體重的降低并改善小鼠的健康狀況（圖2B， 2CKEV71感染會導(dǎo)致小鼠死亡，而用FN抑制劑處理過的小鼠，其死亡率顯著下降（圖2D)，這 說明FN抑制劑可以有效降低EV71感染的小鼠的死亡率。不僅如此，在小鼠感染期，我們檢測 了FN抑制劑對小鼠體內(nèi)病毒載量的影響，發(fā)現(xiàn)FN抑制劑處理的小鼠體內(nèi)腦干和骨骼肌的病 毒含量顯著低于PBS對照組處理的（圖2E，2F )，這說明FN抑制劑可以有效降低EV71感染小 ￡3
[0134] 綜合這部分的實驗，我們可以得出EV71病毒感染小鼠可以被FN抑制劑阻斷并提高 小鼠的健康狀況和存活率。這可能為后續(xù)研究FN抑制劑-四肽RGDS在治療EV71病毒感染方 向上提供了基礎(chǔ)和如提。
[0135] 至此，我們確定FN抑制劑-四肽RGDS可有效、高效地抑制EV71病毒的感染，揭示了 尚未被發(fā)現(xiàn)的FN抑制劑-四肽RGDS的新生物學(xué)功能，能在體內(nèi)體外都達到抗EV71病毒感染 的效果，這一新發(fā)現(xiàn)為研制抗病毒藥物提供了理論和事實基礎(chǔ)。
【主權(quán)項】
1. 精-甘-天冬-絲氨酸四肽RGDS在制備抗腸道病毒71型藥物中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述精-甘-天冬-絲氨酸四肽RGDS用于抑制 腸道病毒71結(jié)合到細胞表面及入侵。
【文檔編號】A61K38/07GK105963675SQ201610327037
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】朱應(yīng), 任盛, 佘應(yīng)龍
【申請人】武漢大學(xué)