Ev71 3c蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種EV71 3C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腸道病毒71型（enterovirus71，EV71)是手足口病的主要致病原之一。臨床上 多表現(xiàn)為輕微癥狀：發(fā)熱、手足口部的皰疹、皰疹性咽峽炎。而嚴(yán)重者則引起神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā) 癥如無(wú)菌性腦膜腦炎、脊髓炎、神經(jīng)源性的肺水腫等。嚴(yán)重者有生命危險(xiǎn)。臨床上治療EV71 感染主要是對(duì)癥治療，目前尚無(wú)特異抗病毒藥物，尋找和發(fā)現(xiàn)抗EV71病毒藥物是目前面臨 的中藥課題。
[0003] 尋找抗EV71藥物目前主要有2大途徑：1 :在已知病毒蛋白功能域的基礎(chǔ)上進(jìn)行 針對(duì)性設(shè)計(jì)；2:在中草藥、海洋生物、陸地微生物等自然界中萃取、尋找。后者往往是新結(jié) 構(gòu)、新機(jī)制抗病毒藥物的重要來(lái)源，對(duì)于抗病毒藥物的研究具有重要意義，但是，這些自然 資源中獲得的化合物的抗病毒作用靶點(diǎn)卻常常存在難度。因此，尋找靶點(diǎn)并開發(fā)一套合適 的檢測(cè)方法是急需解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明以3C蛋白為抗病毒作用靶點(diǎn)，開發(fā)了一套檢測(cè)試劑盒 及檢測(cè)方法，其目的是檢測(cè)待檢測(cè)化合物是否可抑制3C蛋白，進(jìn)而判斷其是否可抑制EV71 病毒，是否可以作為抗EV71病毒的藥物進(jìn)行研究應(yīng)用。
[0005] 3C蛋白是手足口病病原EV71的蛋白酶，其酶活性直接影響病毒復(fù)制效率和致病 毒力（WengK.F. ,LiM.L. ,HungC.T.etal.Enterovirus7I3Cproteasecleavesa noveltargetCstF-64andihibitscellularpolyadenylation[J]?PLOSPathog，2009， 5(9) :el000593.)。本研究以該蛋白酶測(cè)活方法為基礎(chǔ)，建立了 3C蛋白酶活性的成套試劑， 用于檢測(cè)藥物靶點(diǎn)。如果藥物可以抑制3C蛋白酶的活性，則提示該藥物的作用靶點(diǎn)是EV71 的3C蛋白酶的酶活中心（His41，Glu71和Cysl47催化三聯(lián)體）。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種EV71 3C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反應(yīng) 緩沖液，所述3C蛋白的序列如下（如SEQIDNO. 1所示）：
[0008] GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVN LELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPV⑶WQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQ CGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQo
[0009]所述多肽底物為DabcyI-EALFQGPPKFE-Edans，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示， N端連接Dabcyl基團(tuán)，C端連接Edans基團(tuán)。
[0010] 所述酶解反應(yīng)緩沖液為反應(yīng)buffer液，其包括如下組分：25mMTriS-HCKpH 8. 0)，200mMNaCl〇
[0011] -種EV71 3C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)方法，如下：將待檢測(cè)化合物、3C蛋白加入到酶 解反應(yīng)緩沖液中，然后加入多肽底物，混勻，反應(yīng)30min后，在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，檢測(cè)其在 490nm處的熒光強(qiáng)度；若檢測(cè)不到熒光，則表明該待檢測(cè)化合物能抑制3C蛋白，具有抗EV71 病毒能力，可作為抗EV71病毒的藥物進(jìn)行進(jìn)一步的研究應(yīng)用；若能夠檢測(cè)到熒光，則表明 該待檢測(cè)化合物不能抑制3C蛋白。
[0012] 進(jìn)一步地，檢測(cè)方法如下：多肽底物在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，獲得其在490nm處的熒 光強(qiáng)度值A(chǔ)(表示未降解時(shí)的熒光強(qiáng)度）。將3C蛋白多肽底物加入到反應(yīng)buffer液后，混 勻反應(yīng)30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，獲得其在490nm處的熒光強(qiáng)度 值B(經(jīng)降解后的熒光強(qiáng)度）。在上述反應(yīng)體系中加入一定濃度的待檢測(cè)化合物，并重復(fù)以 上步驟操作，獲得化合物存在時(shí)的熒光強(qiáng)度C，通過(guò)比較A，B，C三值大小，確定化合物對(duì)3C 蛋白酶的酶活性的影響（C的數(shù)值在A、B之間，C的數(shù)值越小，說(shuō)明待檢測(cè)化合物對(duì)3C蛋白 酶的酶活性的抑制越明顯，C的數(shù)值越大，說(shuō)明待檢測(cè)化合物對(duì)3C蛋白酶的酶活性的抑制 越弱）。
[0013] 本發(fā)明的原理為：該成套檢測(cè)試劑主要由3C蛋白及熒光多肽底物組成。3C蛋白對(duì) 底物進(jìn)行酶解后，由于底物兩端的基團(tuán)分離，熒光淬滅消失，反應(yīng)產(chǎn)物激發(fā)出熒光信號(hào)。通 過(guò)比較野生組與對(duì)照組的熒光發(fā)射曲線差異，判斷化合物是否影響了 3C蛋白酶對(duì)底物的 降解活性，進(jìn)而篩選對(duì)抗EV71 3C蛋白酶的靶標(biāo)化合物，后續(xù)還可通過(guò)計(jì)算3C的米氏常數(shù) Km值及催化效率Kcat值，定量判定靶標(biāo)化合物的抑制能力。
[0014] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒及方法，可有效對(duì)待檢測(cè)化合物的抗EV71能力（是否以3C 蛋白為靶點(diǎn)）進(jìn)行檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便，易行，特異性及靈敏性高。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1 :抑制劑對(duì)3C蛋白降解2C-3A多肽的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0017] 下述實(shí)施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無(wú)特別說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有 的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過(guò)正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實(shí)施例中所涉及的實(shí)驗(yàn)方法，檢 測(cè)方法等，若無(wú)特別說(shuō)明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)方法等。
[0018] 實(shí)驗(yàn)EV71 3C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法的研究
[0019] 1 :材料：
[0020] 1.1:3C蛋白
[0021] 采用分子克隆方法獲得3C基因的原核表達(dá)質(zhì)粒，使用大腸桿菌B121菌株進(jìn)行蛋 白的表達(dá)和純化（公知技術(shù)）。肽序列如下（如SEQ ID NO. 1所示）：
[0022] GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVN LELTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPV⑶WQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQ CGGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQo
[0023] 3C蛋白第147位半胱氨酸酶活中心的C為酶活中心的關(guān)鍵氨基酸。
[0024] 1.2:熒光多肽底物
[0025] 發(fā)明人前期檢測(cè)了3C蛋白酶對(duì)6條10肽底物的酶活，尋找到一條在水溶液中穩(wěn) 定性好、并被3C蛋白高效降解的多肽（表1)。這一底物是基于EV71上2C-3A蛋白序列設(shè) 計(jì)。酶解位點(diǎn)為谷氨酰胺與甘氨酸之間的肽鍵。多肽的N端連接Dabcyl基團(tuán)，C端連接 Edans基團(tuán)。
[0026] Dabcyl和Edans兩基團(tuán)靠近時(shí)發(fā)生熒光催滅，不顯示熒光。當(dāng)多肽被降解后，兩基 團(tuán)分離，在336nm波長(zhǎng)光激發(fā)下，可在490nm處檢測(cè)到焚光。
[0027] 表1熒光多肽底物
[0028]
[0029] 2方法步驟：蛋白酶活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0030] 2. 1 :酶活性檢測(cè)
[0031] 2. L 1酶活反應(yīng)體系如下：
[0032] 3C蛋白 2ul(0. 5uM);
[0033]多肽底物 5uI(IOuM);
[0034]反應(yīng)buffer液（25mMTris-HClpH8. 0, 200mMNaCl) 13ul〇
[0035] 2.I.2酶活測(cè)定方法
[0036] 多肽底物在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，獲得其在490nm處的熒光強(qiáng)度值A(chǔ)(表示未降解 時(shí)的熒光強(qiáng)度）。將3C蛋白多肽底物加入到反應(yīng)buffer液后，混勻反應(yīng)30min后，倒入玻 璃比色皿中，在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，獲得其在490nm處的熒光強(qiáng)度值B(經(jīng)降解后的熒光強(qiáng) 度）。在上述反應(yīng)體系中加入一定濃度的待檢測(cè)化合物，并重復(fù)以上步驟操作，獲得化合物 存在時(shí)的熒光強(qiáng)度C，通過(guò)比較A，B，C三值大小，確定化合物對(duì)3C蛋白酶的酶活性的影響。
[0037] 2. 1. 3酶活測(cè)定原理
[0038] 多肽的N端連接Dabcyl基團(tuán)，C端連接Edans基團(tuán)。Dabcyl和Edans兩基團(tuán)靠近 時(shí)發(fā)生熒光催滅，不顯示熒光。當(dāng)多肽被逐漸被3C蛋白酶降解后，兩基團(tuán)分離，在336nm波 長(zhǎng)光激發(fā)下，可在490nm處檢測(cè)到熒光，并且隨著降解的加速熒光逐漸變強(qiáng)直至反應(yīng)完全。 通過(guò)比較評(píng)價(jià)受試樣品對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的影響，進(jìn)而確定其是否通過(guò)抑制3C蛋白酶 活性發(fā)揮抗病毒藥效。
[0039] 2. 2 :實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0040] 2. 2. 1抑制劑蘆平曲葦（Rupintrivir)對(duì)3C蛋白降解底物2C-3A的酶活抑制
[0041] 分別取0. 5uM3C蛋白加入到含多肽底物的反應(yīng)體系中，混勻反應(yīng)30min中后測(cè)定 336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，在490nm處的熒光強(qiáng)度，根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)方法，分別檢測(cè)有無(wú)5uM抑制劑蘆 平曲葦存在時(shí)的熒光強(qiáng)度，作圖。
[0042] 結(jié)果如圖1所示，由圖可知，在無(wú)抑制劑蘆平曲葦存在時(shí)，3C蛋白不受到抑制，可 降解多肽底物，可檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光。在有5uM抑制劑蘆平曲葦存在時(shí)，3C蛋白受到抑制， 不降解多肽底物，幾乎檢測(cè)不到熒光。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種EV713C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括3C蛋白、多肽底物，以 及酶解反應(yīng)緩沖液，所述3C蛋白的序列如下（如SEQ ID NO. 1所示）： GPSLDFALSLLRRNIRQVQTDQGHFTMLGVRDRLAVLPRHSQPGKTIWVEHKLVNVLDAVELVDEQGVNLE LTLITLDTNEKFRDITKFIPENISTASDATLVINTEHMPSMFVPV⑶WQYGFLNLSGKPTHRTMMYNFPTKAGQC GGVVTSVGKVVGIHIGGNGRQGFCAGLKRSYFASEQ； 所述多肽底物為Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，N端 連接Dabcyl基團(tuán)，C端連接Edans基團(tuán)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的EV713C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述酶解 反應(yīng)緩沖液為反應(yīng)buffer液，其包括如下組分：25mMTris-HCKpH8.0)，200mMNaCl。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的EV713C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括 以下物質(zhì)：〇. 5uM 3C蛋白2ul ;10uM多肽底物5ul ;反應(yīng)buffer液13ul。4. 一種利用權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的EV713C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒進(jìn)行 檢測(cè)的方法，其特征在于：將待檢測(cè)化合物、3C蛋白加入到酶解反應(yīng)緩沖液中，然后加入多 肽底物，混勾，反應(yīng)30min后，在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，檢測(cè)其在490nm處的焚光強(qiáng)度；若檢測(cè) 不到熒光，則表明該待檢測(cè)化合物能抑制3C蛋白，具有抗EV71病毒能力；若能夠檢測(cè)到熒 光，則表明該待檢測(cè)化合物不能抑制3C蛋白。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于：多肽底物在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，獲得 其在490nm處的熒光強(qiáng)度值A(chǔ)，表示未降解時(shí)的熒光強(qiáng)度；將3C蛋白多肽底物加入到反應(yīng) buffer液后，混勾反應(yīng)30min后，倒入玻璃比色皿中，在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，獲得其在490nm 處的熒光強(qiáng)度值B，表示經(jīng)降解后的熒光強(qiáng)度；在上述反應(yīng)體系中加入一定濃度的待檢測(cè) 化合物，并重復(fù)以上步驟操作，獲得化合物存在時(shí)的熒光強(qiáng)度C，通過(guò)比較A，B，C三值大小， 確定待檢測(cè)化合物對(duì)3C蛋白酶的酶活性的影響。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種EV71？3C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)試劑盒，包括3C蛋白、多肽底物，以及酶解反應(yīng)緩沖液，所述3C蛋白的序列如SEQ？ID？NO.1所示；所述多肽底物為Dabcyl-EALFQGPPKFE-Edans。本發(fā)明還公開了一種EV71？3C蛋白酶作用靶點(diǎn)檢測(cè)方法：將待檢測(cè)化合物、3C蛋白加入到酶解反應(yīng)緩沖液中，然后加入多肽底物，混勻，在336nm波長(zhǎng)激發(fā)下，檢測(cè)其在490nm處的熒光強(qiáng)度；若檢測(cè)不到熒光，則表明該待檢測(cè)化合物能抑制3C蛋白；若能夠檢測(cè)到熒光，則表明該待檢測(cè)化合物不能抑制3C蛋白。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒及方法，可有效對(duì)待檢測(cè)化合物的抗EV71能力進(jìn)行檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便，易行，特異性及靈敏性高。
【IPC分類】G01N21/64
【公開號(hào)】CN105067574
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510342092
【發(fā)明人】李冰清, 孟紅, 秦立增, 李鵬, 李志會(huì), 岳盈盈, 宋楠楠
【申請(qǐng)人】山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 山東中醫(yī)藥大學(xué)
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年6月18日