一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型滅活疫苗組合物及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型滅活疫苗組合物及制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中豬圓環(huán)病毒2型疫苗成本高、效力低的問題，一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型滅活疫苗組合物，所述組合物由以下組分組成：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型滅活病毒液、中草藥佐劑、化學類佐劑，其中所述中草藥佐劑由人參、杜仲葉、當歸多糖，所述化學類佐劑為白油、吐溫20、司盤80、硬質(zhì)酸鋁，所述豬圓環(huán)病毒Ⅱ型毒株滅活病毒液與所述中草藥佐劑的質(zhì)量比為1:2～2:1，本發(fā)明提出了制備疫苗的方法，將發(fā)揮免疫作用的中草藥佐劑與豬圓環(huán)病毒Ⅱ型滅活病毒液混合均勻，使得疫苗的效力更高，成本低，抗原物質(zhì)混合佐劑注入機體后，改變了抗原的物理性質(zhì)，可使抗原物質(zhì)緩慢的釋放，延長了抗原的作用時間。
【專利說明】
一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及豬用疫苗領(lǐng)域，特別是指一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物及制備 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原。自 1991年在加拿大豬群中暴發(fā)以來，PMWS給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。PCV2還與 增生性壞死性肺炎、母豬繁殖障礙、豬皮炎與腎病綜合征和豬呼吸道疾病綜合征相關(guān)。據(jù)估 計，PCV2相關(guān)性疾病(PCVD)，主要是PMWS，在2014年給歐洲造成的損失高達6億歐元，PCVD同 樣給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。
[0003] 目前，傳統(tǒng)的PCV2疫苗通常由滅活或被殺死或經(jīng)修飾的活致病微生物的粗制備物 組成，向疫苗中加入較小劑量的佐劑，來刺激類似的免疫應答，從而減少疫苗的制造成本。 因此，當將疫苗與佐劑組合時可顯著增加注射疫苗的效力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提出一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物及制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中 豬圓環(huán)病毒2型疫苗成本高、效力低的問題。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的：一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物，其特征 在于，所述組合物由以下組分組成:豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液、中草藥佐劑、化學類佐劑， 其中所述中草藥佐劑由黃芪多糖、人參、杜仲葉、當歸多糖組成，所述化學類佐劑為白油、吐 溫20、司盤80、硬質(zhì)酸鋁，所述豬圓環(huán)病毒Π 型毒株滅活病毒液與所述中草藥佐劑的質(zhì)量比 為1:2~2:1〇
[0006] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述組合物包含以下重量份的原料：
[0007] 20~25份黃芪多糖、10~15份人參、3~6份杜仲葉、20~30份當歸多糖、30~50份 豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液、18~24份白油、12~15份吐溫20、6~10份司盤80、4~7份硬質(zhì) 酉支錯。
[0008] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液的毒價為105.5TCID50/ mL〇
[0009] 免疫佐劑的選擇對疫苗的效力影響很大，它既可改變免疫反應類型，使體液免疫 轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎庖?，改變免疫球蛋白的種類和亞類，還可改變免疫反應狀態(tài)，消除免疫耐受性 而產(chǎn)生免疫反應。因此，選擇合適的免疫佐劑顯得非常重要。
[0010] 本發(fā)明的中草藥佐劑選用黃芪多糖、人參、杜仲葉、當歸多糖，黃芪多糖主要通過 刺激抗原遞呈細胞的增殖分化和釋放細胞因子來提高機體的免疫力，人參中的活性成分為 皂苷，皂苷能刺激抗原遞呈細胞的增殖分化和釋放細胞因子來提高機體的免疫力。杜仲葉 為益精氣類中草藥，可消除機體免疫耐受性而產(chǎn)生免疫反應，當歸多糖由葡萄糖、阿拉伯糖 和少量糖醛組成，當歸多糖不是直接作用于淋巴細胞，而是在體內(nèi)首先作用于非特異性免 疫細胞如DC使其得到活化、功能增強，再作用于各種免疫效應細胞。
[0011]硬質(zhì)酸鋁作為佐劑，其作用機理:在黏附抗原后，改變抗原的物理性狀，形成庫效 應，延長抗原遞呈細胞(APC)對抗原的攝取、加工、處理的時間，使免疫細胞對該抗原保持長 時間高水平的應答。
[0012] 吐溫20是水相，司盤80是乳化劑，白油作為油相，其作用機制是抗原包被在油相形 成的微結(jié)構(gòu)內(nèi)，使之形成貯存庫而緩慢釋放，刺激B淋巴細胞產(chǎn)生抗體。
[0013] 本發(fā)明又提出一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0014] 1)將中草藥佐劑的活性成分進行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液；
[0015] 2)制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述 待用液中，攪拌均勻；
[0016] 3)向白油中添加司盤80和硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的吐溫20與所述 油相混合物混勻，得混合液；
[0017] 4)將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。
[0018] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，步驟2)中制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液的過程中包括設(shè) 計三對引物用于擴增豬圓環(huán)病毒Π 型毒株的全基因序列，所述三對引物分別是：
[0019] PCV2-F1 的基因序列為5，-TGCAGAAGCGTGATTGGAAGAC-3,，
[0020] ?(^2-1?1的基因序列為5，-01^^0：1'111^^了厶了厶0^1'(：-3，；
[0021] ?(^2+2的基因序列為5'-厶6660^6厶厶1'11^厶0：1'1'1'-3'，
[0022] ?(^2-1?2的基因序列為5，-1^0^〇厶6厶61'(：1^厶6了厶6厶-3'；
[0023] PCV2-F3的基因序列為5，-AGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTC-3，，
[0024] ?(^2-1?3的基因序列為5，-6176厶厶1'1'(^66〇0^6(^0：01^1'-3'。
[0025] 本發(fā)明提出了制備疫苗的方法，將發(fā)揮免疫作用的中草藥佐劑與豬圓環(huán)病毒Π 型 滅活病毒液混合均勻，使得疫苗的效力更高，成本低，為了讓硬質(zhì)酸鋁更好的溶于白油中， 加入了作為乳化劑的司盤80,然后再將白油與吐溫20混合，形成油包水型佐劑，與抗原、中 藥佐劑混合，抗原物質(zhì)混合佐劑注入機體后，改變了抗原的物理性質(zhì)，可使抗原物質(zhì)緩慢的 釋放，延長了抗原的作用時間。
【附圖說明】
[0026] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本 發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可 以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。
[0027]圖1為PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；
[0028] 圖2為PCV2全基因 Η擴增圖；
[0029] 圖3為PCV2全基因 Η擴增圖。
【具體實施方式】
[0030]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；?本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
[0031 ] -種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物，其特征在于，所述組合物由以下組分組成： 豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液、中草藥佐劑、化學類佐劑，其中所述中草藥佐劑由黃芪多糖、 人參、杜仲葉、當歸多糖，所述化學類佐劑為白油、吐溫20、司盤80、硬質(zhì)酸鋁，所述豬圓環(huán)病 毒Π 型毒株滅活病毒液與所述中草藥佐劑的質(zhì)量比為1:2~2:1。
[0032] 本發(fā)明優(yōu)選所述豬圓環(huán)病毒Π 型毒株滅活病毒液與所述中草藥佐劑的質(zhì)量比為 1:1〇
[0033] 作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述組合物包含以下重量份的原料：
[0034] 20~25份黃芪多糖、10~15份人參、3~6份杜仲葉、20~30份當歸多糖、30~50份 豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液、18~24份白油、12~15份吐溫20、6~10份司盤80、4~7份硬質(zhì) 酉支錯。
[0035]作為優(yōu)選的技術(shù)方案，所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液的毒價為105'5TCID50/m L〇
[0036] 本發(fā)明又提出一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0037] 1)將中草藥佐劑的活性成分進行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液；
[0038] 2)制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述 待用液中，攪拌均勻；
[0039] 3)向白油中添加司盤80和硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的吐溫20與所述 油相混合物混勻，得混合液；
[0040] 4)將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。
[0041] 本發(fā)明制備豬圓環(huán)病毒Π 型病毒的具體方法：
[0042] 1、病毒分離培養(yǎng)
[0043] 取疑似PCV2感染豬肺臟或淋巴結(jié)，加 DMEM研磨，0.22μπι濾膜過濾除菌接種于單層 ΡΚ-15細胞，孵育lh后棄上清，繼續(xù)培養(yǎng)，盲傳20代。反復凍融細胞收集病毒。
[0044] 2、用于全基因組擴增的引物設(shè)計與合成
[0045] 設(shè)計三對引物PCV2-F1/RUPCV2F2/R2及PCV2F3/R3三對引物（見表1)用于擴增 PCV2全基因組。
[0046] 表1引物及序列
[0047]
[0048] 3、病毒DNA提取
[0049] 根據(jù)病毒DNA提取試劑盒使用說明書進行操作，步驟如下：
[0050] 取300yL細胞懸液加入2倍體積的BufferPLY?；旌暇鶆颍覝胤胖?5min。向混合液 中加0.5倍體積的無水乙醇，顛倒五次混勾。將上步混合液轉(zhuǎn)入ezBind Columns，12000r/ min離心lmin。加650yL Wash Buffer，12000r/min離心lmin，重復一次。棄掉洗液，空轉(zhuǎn) ezBind，12000r/min離心2min，將ezHind柱轉(zhuǎn)移至潔凈的eppendorf管，加入 15yL ddH20,室 溫放置 2min，12000r/min 離心 2min，收獲 DNA。
[0051] 4、目的核苷酸克隆測序
[0052]這個步驟包括PCR產(chǎn)物的回收、連接、DH5a大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備、連接產(chǎn)物 進行轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒DNA的提取、重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定、陽性克隆序列測定。
[0053] 5、結(jié)果
[0054] 5.1 PCV2-SD核酸片段擴增結(jié)果
[0055] 以組織中提取的總DNA為模板，應用兩對特異性引物分別進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳后，分別獲得了 l〇57bp(A)和1110bp(B)的核酸片段，與預期大小一致，結(jié)果見圖1。
[0056] 以片段A、B混合物為模板，以PCV2-F3/R3為引物，進行PCR反應，得到PCV2全基因組 H，片段大小1767bp，如圖2。
[0057] 5.2 PCR產(chǎn)物的克隆與重組質(zhì)粒的鑒定
[0058]擴增的PCR產(chǎn)物與pMD 18-T載體連接后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞， 提取的質(zhì)粒用S a 1 I和B a m Η I酶切，電泳結(jié)果如圖3。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后，得到17 6 7 b p和 2692bp的核酸片段，與預期大小一致。
[0059] 制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液的方法：
[0060] 將PCV2株接種PK15細胞培養(yǎng)，病毒培養(yǎng)物經(jīng)3次凍融后收獲，經(jīng)高速離心棄細胞雜 質(zhì)，再經(jīng)超速離心適當濃縮病毒，置-70°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0061 ] 測定PCV2-SD濃縮病毒液毒價，調(diào)整為105.5TCID50/m L，加入甲醛，使甲醛的最終 濃度為0.1%。37°(：恒溫搖床滅活18h。分別抽取少量滅活病毒液以1:10稀釋后接種于單層 PK15細胞，盲傳3代，即得。
[0062]本發(fā)明以具體的實施例來解釋說明本發(fā)明創(chuàng)造。
[0063] 實施例一
[0064] -種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0065] 1)將20份黃芪多糖、10份人參、3份杜仲葉、20當歸多糖中草藥佐劑的活性成分進 行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液；
[0066] 2)制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述 待用液中，且以1:2比例混合，攪拌均勻；
[0067] 3)向18份白油中添加6份司盤80和4份硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的12 份的吐溫20與所述油相混合物混勻，得混合液；
[0068] 4)將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。
[0069] 實施例二
[0070] -種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0071] 1)將25份黃芪多糖、15份人參、6份杜仲葉、30當歸多糖中草藥佐劑的活性成分進 行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液；
[0072] 2)制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述 待用液中，且以1:2比例混合，攪拌均勻；
[0073] 3)向24份白油中添加10份司盤80和7份硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的 15份的吐溫20與所述油相混合物混勻，得混合液；
[0074] 4)將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。
[0075] 實施例三
[0076] -種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0077] 1)將20份黃芪多糖、10份人參、3份杜仲葉、20當歸多糖中草藥佐劑的活性成分進 行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液；
[0078] 2)制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述 待用液中，且以1:1比例混合，攪拌均勻；
[0079] 3)向18份白油中添加6份司盤80和4份硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的12 份的吐溫20與所述油相混合物混勻，得混合液；
[0080] 4)將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。
[0081] 實施例四
[0082] -種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0083] 1)將25份黃芪多糖、15份人參、6份杜仲葉、30當歸多糖中草藥佐劑的活性成分進 行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液；
[0084] 2)制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述 待用液中，且以1:1比例混合，攪拌均勻；
[0085] 3)向24份白油中添加10份司盤80和7份硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的 15份的吐溫20與所述油相混合物混勻，得混合液；
[0086] 4)將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。
[0087] 實施例五
[0088] -種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0089] 1)將20份黃芪多糖、10份人參、3份杜仲葉、20當歸多糖中草藥佐劑的活性成分進 行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液；
[0090] 2)制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述 待用液中，且以2:1比例混合，攪拌均勻；
[0091] 3)向18份白油中添加6份司盤80和4份硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的12 份的吐溫20與所述油相混合物混勻，得混合液；
[0092] 4)將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。
[0093] 實施例六
[0094] -種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，包括以下步驟：
[0095] 1)將25份黃芪多糖、15份人參、6份杜仲葉、30當歸多糖中草藥佐劑的活性成分進 行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液；
[0096] 2)制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述 待用液中，且以2:1比例混合，攪拌均勻；
[0097] 3)向24份白油中添加10份司盤80和7份硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的 15份的吐溫20與所述油相混合物混勻，得混合液；
[0098] 4)將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。
[0099]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物，其特征在于，所述組合物由以下組分組成:豬 圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液、中草藥佐劑、化學類佐劑，其中所述中草藥佐劑由黃芪多糖、人 參、杜仲葉、當歸多糖組成，所述化學類佐劑為白油、吐溫20、司盤80、硬質(zhì)酸鋁，所述豬圓環(huán) 病毒Π 型毒株滅活病毒液與所述中草藥佐劑的質(zhì)量比為1:2~2:1。2. 如權(quán)利要求1所述的一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物，其特征在于，所述組合物 包含以下重量份的原料： 20~25份黃芪多糖、10~15份人參、3~6份杜仲葉、20~30份當歸多糖、30~50份豬圓 環(huán)病毒Π 型滅活病毒液、18~24份白油、12~15份吐溫20、6~10份司盤80、4~7份硬質(zhì)酸 錯。3. 如權(quán)利要求2所述的一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物，其特征在于： 所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液的毒價為105'5TCID50/m L。4. 制備如權(quán)利要求1至3中任一項所述的一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的方法， 其特征在于，包括以下步驟： 1) 將中草藥佐劑的活性成分進行提取，后用生理鹽水溶解，過濾后制成待用液； 2) 制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液，將所述豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液加至所述待用 液中，攪拌均勻； 3) 向白油中添加司盤80和硬質(zhì)酸鋁制成油相混合物，將作為水相的吐溫20與所述油相 混合物混勻，得混合液； 4) 將步驟2)中的產(chǎn)物加入到所述混合液中，離心乳化3min，即得成品。5. 如權(quán)利要求4所述的一種豬圓環(huán)病毒Π 型滅活疫苗組合物的制備方法，其特征在于， 步驟2)中制備豬圓環(huán)病毒Π 型滅活病毒液的過程中包括設(shè)計三對引物用于擴增豬圓環(huán)病 毒Π 型毒株的全基因序列，所述三對引物分別是： PCV2-F1 的基因序列為5 '-TGCAGAAGCGTGATTGGAAGAC-3 '， PCV2-R1 的基因序列為5 '-CCGCACCTTCGGATATACTATC-3 ' ； PCV2-F2的基因序列為5 '-AGGGCCAGAATTCAACCTTT-3 '， PCV2-R2的基因序列為5 '-TCCCACAGAGTCTCAGTAGA-3 ' ； PCV2-F3的基因序列為5 '-AGGGCCAGAATTCAACCTTAACCTTC-3 '， PCV2-R3的基因序列為5 '-GTTGAATTCTGGCCCTGCTCCCCGAT-3 '。
【文檔編號】A61K39/39GK105833262SQ201610236244
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】郭洪梅, 李舫, 王成森, 王中杰, 蘇丹
【申請人】山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院