約3mm。兩線距離5 ~8mm，均勾。37 °C烘干，封裝備用。
[0061 ] 2、膠體金、金標(biāo)記單克隆抗體的制備。
[0062] (1)溶液的配制。
[0063] ①氯金酸的配制：用雙蒸去離子水溶解氯金酸，配成1 %溶液，置4°C備用，有效期 四個月。l〇〇〇mL 1%氯金酸溶液配方:10g氯金酸:雙蒸去離子水定容至1000mL。
[0064] ②檸檬酸三鈉的配制：用雙蒸去離子水溶解檸檬酸鈉，配成1 %溶液，0.22μπι膜濾 過，置4度備用，有效期容至1000mL。
[0065] ③0.1M碳酸鉀的配制：用雙蒸去離子水配制，0.22μπι膜濾過，置4度備用，有效期四 個月。lOOOmLO. 1Μ碳酸鉀溶液配方:13.8g碳酸鉀;雙蒸去離子水定容至1000mL。
[0066] ④2 %PEG-20000的配制：用雙蒸去離子水配制，0.22μπι膜濾過，置4度備用，有效期 四個月。1000mL 2%PEG-20000溶液配方:20g PEG-20000;雙蒸去離子水定容至1000mL。
[0067] ⑤標(biāo)記洗滌保存液的配制：2%牛血清白蛋白（BSA)，0.05%疊氮鈉(NaN3)，0.01M pH7.2PBS溶液，0.22μπι膜濾過，置4度備用，有效期四個月。1 OOOrnL標(biāo)記洗滌保存液配方:20g BSA，0.5g NaN3、0.01M pH7.2PBS溶液定容至 1000mL。
[0068] (2)膠體金的制備：
[0069]用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%，置電爐煮沸，按每100mL 0.01%氯金 酸加入2mL 1%檸檬酸三鈉，繼續(xù)煮沸，直到液體呈亮紅色即停止加熱，冷卻至室溫后補(bǔ)足 失水。制備好的膠體金外觀應(yīng)純凈、透亮、無沉淀和漂浮物，有效期一周。
[0070] (3)膠體金標(biāo)記單克隆抗體的制備：
[0071 ]用0.1M碳酸鉀調(diào)膠體金的pH值至8.2，按8~10yg抗體/ml膠體金加入實(shí)施例1中制 備得到的單克隆抗體7P1-11，磁力攪拌器混勻30min，攪拌下加入BSA至終濃度為1%靜置1 小時。13000rpm、4 °C離心30min，棄上清，沉淀用標(biāo)記洗滌保存液洗滌兩次，用十分之一初始 膠體金體積的標(biāo)記洗滌保存液將沉淀重懸，置4°C備用，有效期一周。
[0072] 3、金標(biāo)墊的制備。
[0073] (1)封閉液的配制：
[0074] 2%BSA，0 · 1 %TritonX-100、0 · 05%NaN3，0 · 01M pH7 · 2PBS溶液，0 · 22μπι膜濾過，置 4度備用，有效期四個月。1000mL封閉液配方:20g BSA，0.5g NaN3、lmL TritonX-100、0.01M PH7.2PBS溶液定容至lOOOmL。
[0075] (2)金標(biāo)墊的制備：
[0076]將金標(biāo)墊浸泡于封閉液中30min后好的金標(biāo)記抗體均勻的鋪在金標(biāo)墊上，每毫升 溶液鋪20平方厘米，冷凍干燥，封裝，置4 °C備用。
[0077] 4、試紙條樣品墊的制備。
[0078] (1)封閉液的配制：
[0079] 2%BSA，0 · 1 %TrtionX-100、0 · 05%NaN3，0 · 01M pH7 · 2PBS溶液，0 · 22μπι膜濾過，置 4度備用，有效期四個月。1000mL封閉液配方:20g BSA，0.5g NaN3、lmL TrtionX-100、0.01M PH7.2PBS溶液定容至1000mL。
[0080] (2)樣品塾的制備：
[0081] 將樣品墊浸泡于封閉液中30min后，于37°C烘干，封裝，置4°C備用。
[0082] 5、試紙條的組裝。
[0083]將吸收墊(購自Millipore公司）、硝酸纖維素膜、金標(biāo)墊、樣品墊依次層疊設(shè)置在 不吸水的支撐薄片上，切成3mm寬的小條。每十小條一包，加入干燥劑，真空封裝，得到所述 檢測試紙。
[0084] 實(shí)施例3
[0085] 檢測EV71病毒VP1蛋白的試劑盒。
[0086] 1、快速檢測EV71病毒VP 1蛋白的試劑盒包括:實(shí)施例2制作的檢測試紙及樣品稀釋 液。
[0087] 樣品稀釋液為8%NaCl溶液。配制方法:80gNaCl，加蒸餾水定容至1000ml。
[0088] 2、膠體金法檢測EV71病毒VP1蛋白。
[0089] (1)直接吸取120μ1采集好的人血清或血漿加入到試紙卡加樣孔，等待15min后即 可觀察結(jié)果。
[0090] (2)結(jié)果判定：當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紅色質(zhì)控線，沒有出現(xiàn)肉眼可見的紅色檢 測線，結(jié)果判為陰性；當(dāng)試紙條出現(xiàn)肉眼可見的紅色質(zhì)控線，同時也出現(xiàn)肉眼可見的紅色檢 測線，結(jié)果判為陽性。檢測線顏色越深說明被檢測樣品的EV71病毒VP1蛋白水平越高。當(dāng)試 紙條沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色質(zhì)控線，不管有沒有出現(xiàn)肉眼可見的紫紅色檢測線，結(jié)果 都判為檢測試紙條失效，應(yīng)廢棄。
[0091] 實(shí)施例4
[0092] EV71病毒VP1抗原膠體金快速檢測試紙?jiān)噭┖械膽?yīng)用。
[0093] 以Suoaobio腸道病毒71型/柯薩奇病毒A16型(EV71/CA16)雙色熒光檢測試劑盒檢 出的EV71陽性樣本，CA16陽性樣本，以及EV71/CA16雙陰性樣本作為本試劑盒的檢測樣本， 其中126例檢出EV71陽性樣本，43例檢出CA16陽性樣本，500例陰性標(biāo)本。采用本專利發(fā)明的 EV71病毒VP1抗原膠體金試劑盒檢測上述126份EV71陽性樣本，43份CA16陽性樣本和500份 陰性樣本，檢出結(jié)果見表1。
[0094]表1:實(shí)施例3的EV71病毒VP1抗原檢測試劑盒的檢測結(jié)果
[0095]
[0096] 由表1可以看出，本實(shí)施例的EV71病毒VP1抗原膠體金快速檢測試紙?jiān)噭┖袡z出 EV71陽性標(biāo)本117份，相對靈敏度為92.68%;0416標(biāo)本未檢出，相對特異性為100%，500份 陰性樣本檢出500份，相對特異性為100 %。該結(jié)果與Suoaobio腸道病毒71型/柯薩奇病毒 八16型化￥71/^416)雙色熒光檢測試劑盒的結(jié)果符合率為98.65%。
[0097]由此說明，本實(shí)施例的EV71病毒VP1抗原膠體金快速檢測試紙?jiān)噭┖锌梢杂糜?EV71型腸道病毒早期分型快速診斷。
[0098]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，保藏號為 CCTCC No：C2015225〇2. 如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞在制備EV71病毒檢測試劑或EV71病毒檢測設(shè)備中的 應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1的單克隆抗體，其特征在 于，所述抗EV71病毒蛋白VP1的單克隆抗體記為7P1-7。4. 一種可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，其特征在于，保藏號為 CCTCC No：C2015226〇5. 如權(quán)利要求4所述的抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體在制備EV71病毒檢測試劑或檢 測設(shè)備中的應(yīng)用。6. 如權(quán)利要求4所述的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1的單克隆抗體，其特征在 于，所述抗EV71病毒蛋白VP1的單克隆抗體記為7P1-11。7. -種EV71病毒檢測試紙，其特征在于，包括如權(quán)利要求3所述的7P1-7和如權(quán)利要求6 所述的7P1-11。8. 如權(quán)利要求7所述的EV71病毒檢測試紙，其特征在于，包括支撐薄片、樣品墊、金標(biāo) 墊、硝酸纖維素膜、吸收墊、檢測線及質(zhì)控線，所述樣品墊、所述金標(biāo)墊、所述硝酸纖維素膜 及所述吸收墊從所述支撐薄片的一端向另一端依次設(shè)置在所述支撐薄片上，所述樣品墊與 所述金標(biāo)墊部分重疊，所述金標(biāo)墊與所述硝酸纖維素膜部分重疊，所述硝酸纖維素膜與所 述吸收墊部分重疊，所述檢測線及所述質(zhì)控線設(shè)在所述硝酸纖維素膜上，且所述檢測線設(shè) 在靠近所述金標(biāo)墊的一端，所述質(zhì)控線設(shè)在靠近所述吸收墊的一端，所述金標(biāo)墊上涂覆有 7P1-7包附膠體金顆粒形成的膠體金標(biāo)記的單克隆抗體，所述檢測線為7P1-11，所述質(zhì)控線 為羊抗鼠 IgG抗體。9. 一種EV71病毒檢測試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求7或8所述的EV71病毒檢測 試紙。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種靈敏度較高且特異性較強(qiáng)的EV71病毒檢測試紙，該EV71病毒檢測試紙通過使用雜交瘤細(xì)胞分泌的抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體，在標(biāo)記物為較大的納米顆粒時，間接標(biāo)記可以降低標(biāo)記抗原的使用量，在提高靈敏度的同時改善特異性。此外，本發(fā)明還涉及一種可分泌抗EV71病毒蛋白VP1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞、單克隆抗體及應(yīng)用。該雜交瘤細(xì)胞為兩株，保藏在湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)保藏中心，保藏號是CCTCC？No：C2015225和CCTCC？No：C2015226。CCTCC No：C201522520151217
【IPC分類】G01N33/569, G01N33/577, C07K16/10, C12N5/20
【公開號】CN105567643
【申請?zhí)枴緾N201511005121
【發(fā)明人】李泓彥, 李凡
【申請人】菲鵬生物股份有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月28日