本發(fā)明屬于磷脂類物質(zhì)合成領(lǐng)域，涉及磷脂酶d，具體涉及一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著人們對磷脂類物質(zhì)的深入研究，更加明確地認識了磷脂的藥用價值和營養(yǎng)價值，并將它廣泛的應用到食品、藥物及保健品等領(lǐng)域。以磷脂酰甘油(pg)為例，其可降低肺表面張力,穩(wěn)定肺泡的功能，在肺部疾病的確診和治療方面有著廣泛的應用。同時，pg由于其獨特的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，還是人工合成胡蘿卜素類脂的重要中間產(chǎn)物。

然而自然界獲取的天然pg結(jié)構(gòu)成分復雜，不能滿足生產(chǎn)要求和市場需要。因此，需要采取相應手段對天然磷脂進行改性處理，以制備出高純度，單一組分的磷脂產(chǎn)品。利用磷脂酶d(pld),在丙三醇存在的條件下，催化自然界含量較高的磷脂(通常是磷脂酰膽堿，pc)發(fā)生磷脂?；D(zhuǎn)移反應，可以合成高純度磷脂酰甘油，是目前公認的制備高純度稀有磷脂最有效的途徑。該方法具有操作簡單、反應條件溫和、催化效率高以及產(chǎn)物收率高的顯著優(yōu)勢。而游離磷脂酶d穩(wěn)定性差、難回收、昂貴的價格卻是制約pg大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的主要原因。通過固定化酶技術(shù)可以有效提高磷脂酶d的穩(wěn)定性，實現(xiàn)磷脂酶d的回收再利用，降低生產(chǎn)成本，是實現(xiàn)pg大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)先決條件。

對現(xiàn)有磷脂酶d的固定化技術(shù)而言，即便是利用單位體積活力收率最高的交聯(lián)酶聚集體(cleas)技術(shù)，固定化后的磷脂酶d催化合成磷脂酰甘油的比活力(u/g)相比游離酶也會降低。考慮到磷脂酶d昂貴的價格，現(xiàn)有的固定化技術(shù)無疑會增加pg的生產(chǎn)成本。因此，有必要對磷脂酶d的固定化工藝做詳細的研究，探索一種在保證酶穩(wěn)定性的同時，能夠提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，為磷脂生產(chǎn)和應用，以及固定化酶工程的發(fā)展提供參考價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有磷脂酶d固定化技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，該方法按照以下步驟進行：

步驟一，將印跡底物加入到磷脂酶d溶液中進行配合，得到酶-底物配合溶液；

步驟二，加入沉淀劑沉淀酶-底物配合物，得到含有酶-底物配合物聚集體混合溶液；

步驟三，向沉淀后的混合溶液中加入水溶性交聯(lián)劑進行交聯(lián)反應，得到交聯(lián)酶-底物配合物聚集體；

步驟四，對交聯(lián)酶-底物配合物聚集體進行洗滌，除去底物后得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體。

本發(fā)明還具有如下區(qū)別技術(shù)特征：

該方法具體按照以下步驟進行：

步驟一，磷脂酶d的印跡：

將印跡底物加入到磷脂酶d溶液中，攪拌30～120min，得到酶-底物配合物，其中：

所述的印跡底物為丙三醇或磷脂酰膽堿，優(yōu)選為丙三醇；

所述的磷脂酶d溶液為磷脂酶d的醋酸緩沖液；

所述的1ml含有磷脂酶d濃度為0.05mg/ml的醋酸緩沖液中對應加入0.01～0.1g丙三醇；或者所述的1ml含有磷脂酶d濃度為0.05mg/ml的醋酸緩沖液中對應加入0.1ml含有磷脂酰膽堿濃度為0.1～1mg/ml的乙醚溶液；

步驟二，磷脂酶d-底物配合物的沉淀：

向步驟一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加無水沉淀劑并攪拌，滴加完畢后，繼續(xù)在攪拌下沉淀10～30min，得到含有磷脂酶d-底物配合物聚集體混合溶液，其中：

所述的1ml含有磷脂酶d濃度為0.05mg/ml的醋酸緩沖液中對應加入8～10ml無水沉淀劑；

步驟三，磷脂酶d-底物配合物聚集體的交聯(lián)：

向步驟二中得到的混合溶液中加入水溶性交聯(lián)劑進行交聯(lián)反應60～120min，反應結(jié)束后離心收集產(chǎn)物，得到交聯(lián)酶-底物配合物聚集體，其中：

水溶性交聯(lián)劑的質(zhì)量濃度控制在0.5％～2.5％之間；

步驟四，磷脂酶d配體底物的洗滌脫除：

將步驟三中得到的交聯(lián)酶-底物配合物聚集體用純化溶劑洗去酶分子的配合底物，再用去離子水洗去未交聯(lián)的酶分子，冷凍干燥，得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體。

優(yōu)選的，所述的步驟一、步驟二和步驟三均在冰浴條件下進行，冰浴即通過冰塊使得反應體系的溫度控制在0℃以下。

優(yōu)選的，步驟一中，所述的醋酸緩沖液的濃度為0.2m，ph值為5.0～6.0。

優(yōu)選的，步驟二中，所述的無水沉淀劑降溫至0℃以下后再加入酶-底物配合物溶液中。

優(yōu)選的，步驟二中，所述的無水沉淀劑為無水甲醇、無水乙醇、無水丙醇無水異丙醇或無水丙酮，優(yōu)選為無水乙醇。

優(yōu)選的，步驟三中，所述的水溶性交聯(lián)劑為戊二醛。

優(yōu)選的，步驟四中，若印跡底物為丙三醇，則對應的純化溶劑為去離子水；若印跡底物為磷脂酰膽堿，則對應的純化溶劑為無水乙醇。

優(yōu)選的，步驟四中，所述的交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體置于4℃下保存。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：

(ⅰ)本發(fā)明的方法通過交聯(lián)印跡酶聚集體技術(shù)，可以實現(xiàn)印跡磷脂酶d在水溶液中持續(xù)保持印跡特征，克服了現(xiàn)有印跡技術(shù)只能在有機溶劑中使用的缺陷。

(ⅱ)本發(fā)明的方法制得的交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體的酶活力得到了很大的提升，相比于傳統(tǒng)交聯(lián)無印跡酶聚集體技術(shù)制備的固定化磷脂酶d(cleas)和游離磷脂酶d，其磷脂酰甘油合成反應活力分別提高了約3.4和2.8倍。

(ⅲ)本發(fā)明的方法制得的交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體穩(wěn)定性好，回收后可以重復利用，重復利用8次后，其磷脂酰甘油合成反應活力(140u/g)仍然高于傳統(tǒng)交聯(lián)無印跡酶聚集體技術(shù)制備的固定化磷脂酶d(cleas)首次使用時的酶活力(110u/g)，甚至與游離磷脂酶d首次使用時的酶活力幾乎一樣(137u/g)。

(ⅳ)本發(fā)明的方法在磷脂酶d分子與底物分子配合作用形成利于催化的狀態(tài)后(印跡酶)，采用沉淀法“僵化”酶分子的這種“超活化”結(jié)構(gòu)，再加入適當?shù)乃苄越宦?lián)劑對酶分子進行交聯(lián)作用，實現(xiàn)了“超活化”結(jié)構(gòu)酶分子的分子間交聯(lián)和分子內(nèi)交聯(lián)，形成交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體。從而可以簡便、低成本、大規(guī)模地制備具有高磷脂酰甘油合成反應活力的固定化磷脂酶d。所制備的交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體具有催化活力高、性能穩(wěn)定、可重復利用、不污染產(chǎn)品等優(yōu)點。

附圖說明

圖1是不同沉淀劑對交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體固定化酶活力的影響圖。

圖2是戊二醛濃度對所制備交聯(lián)丙三醇印跡磷脂酶d聚集體固定化酶活力的影響圖。

圖3是戊二醛濃度對所制備交聯(lián)磷脂酰膽堿印跡磷脂酶d聚集體固定化酶活力的影響圖。

圖4是交聯(lián)丙三醇印跡磷脂酶d聚集體固定化酶的重復再利用的活性圖。

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體內(nèi)容作進一步詳細解釋說明。

具體實施方式

在廣義范圍上，固定化酶是將酶分子束縛/限制在某一載體或某一區(qū)域內(nèi)以減少酶的流失。此技術(shù)在有效改善酶分子穩(wěn)定性的同時，會導致酶三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。通常這種變化是不利的，從而引起酶活力的下降，降低了酶催化的高效性。因此，探索一種能夠制備具有較高酶活的固定化方法一直是固定化技術(shù)的研究熱點。

在固定化酶領(lǐng)域，交聯(lián)酶聚集體(cleas)是應用最為廣泛的制備具有較高單位體積催化活力固定化酶的方法。理論上通過交聯(lián)酶聚技術(shù)可以最大程度降低酶三維結(jié)構(gòu)的變化盡可能保留酶原有結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)酶活力的最大化。微觀上，交聯(lián)劑在酶分子之間發(fā)生作用的同時會發(fā)生分子內(nèi)交聯(lián)，“僵化”酶的三維結(jié)構(gòu)。這種“僵化作用”在穩(wěn)定酶三維結(jié)構(gòu)的同時會降低酶分子結(jié)構(gòu)的柔韌性，限制了酶分子在催化過程中分子結(jié)構(gòu)合理的變構(gòu)，致使其并不能獲得理想的催化性能。

利用印跡技術(shù)，即通過底物的配合作用誘導酶分子構(gòu)象定向排布，預先形成有利于催化的“超活化”狀態(tài)(印跡酶)，再利用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)，通過分子間和分子內(nèi)的交聯(lián)作用，“記憶”酶分子的這種“超活化”結(jié)構(gòu)，使酶分子始終保持在利于催化的結(jié)構(gòu)狀態(tài)下，提高交聯(lián)酶聚集體固定化酶的催化性能的同時，克服了酶印跡技術(shù)無法在水相中使用的缺點，操作簡便、成本低，是具有應用前景的新穎固定化酶技術(shù)。

本發(fā)明的原理：依據(jù)酶分子印跡理論，當酶分子與底物結(jié)合時，通過底物的配合作用誘導酶分子構(gòu)象定向排布，使其形成利于催化的“超活化”狀態(tài)，增加了酶于底物之間的親和力，表現(xiàn)出更高的催化活性。再利用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)，“記憶”酶分子的這種“超活化”狀態(tài)，從而制備無載體的高磷脂酰甘油合成反應活力固定化磷脂酶d。本發(fā)明中利用短鏈交聯(lián)劑戊二醛進行酶分子間和分子內(nèi)交聯(lián)，其自身韌性小，能為酶分子提供更高的剛性，能更有效的“記憶”酶分子的這種“超活化”結(jié)構(gòu)，使酶分子始終保持在利于催化的結(jié)構(gòu)狀態(tài)下，有效抑制了酶分子印跡效果在水相中的衰退。

遵從上述技術(shù)方案，以下給出本發(fā)明的具體實施例，需要說明的是本發(fā)明并不局限于以下具體實施例，凡在本申請技術(shù)方案基礎(chǔ)上做的等同變換均落入本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：

本實施例給出一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，該方法按照以下步驟進行：

步驟一，磷脂酶d的印跡：

將0.05g丙三醇加入1ml含有磷脂酶d濃度為0.05mg/ml的醋酸緩沖液(濃度為0.2m，ph值為5.5)，冰浴溫和攪拌下，印跡60min，得到含有酶-底物配合物(印跡酶)溶液。

步驟二，磷脂酶d-底物配合物的沉淀：

向步驟一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8ml過冷(0℃以下)無水沉淀劑(分別使用了甲醇、乙醇、丙酮、丙醇和異丙醇作為沉淀劑)，滴加完畢后，繼續(xù)在冰浴下溫和攪拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶d-底物配合物聚集體混合溶液。

步驟三，磷脂酶d-底物配合物聚集體的交聯(lián)：

冰浴條件下，向步驟二中得到的混合溶液中加入水溶性交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為25％的戊二醛，調(diào)節(jié)反應液中戊二醛質(zhì)量濃度為1.5％，交聯(lián)120min，反應結(jié)束后離心收集產(chǎn)物，得到交聯(lián)酶-底物配合物聚集體。

步驟四，磷脂酶d配體底物的洗滌脫除：

將步驟三中得到的交聯(lián)酶-底物配合物聚集體用去離子水沖洗，洗去酶分子的配合底物和未交聯(lián)的酶分子，用去離子水沖洗至少3次，冷凍干燥，得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體，將制得交聯(lián)印跡酶聚集體置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對比例1：

本對比例給出一種磷脂酶d固定化方法，該方法的與實施例1的區(qū)別僅僅在于沒有實施例1的步驟一，即在其制備過程中不用添加印跡底物丙三醇，其余步驟與交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體的制備一樣，最終制得交聯(lián)無印跡磷脂酶d聚集體。

本對比例制得的交聯(lián)無印跡磷脂酶d聚集體作為對照組。

固定化酶活力的測定：

通過利用磷脂?；D(zhuǎn)移反應制備磷脂酰甘油測定制備固定化磷脂酶d的活力，具體操作步驟如下：稱取20μg制備的固定化磷脂酶d(交聯(lián)印跡固定化酶或交聯(lián)無印跡固定化酶)超聲分散于0.5ml醋酸鈉緩沖液中(0.2m，ph5.5)，再加入0.05g丙三醇，將上述混合溶液與0.5ml磷脂酰膽堿濃度為1mg/ml的乙醚溶液混合。在400rpm，30℃下反應。每隔15min檢測溶液中磷脂酰甘油的生成速率。固定化磷脂酶d酶的活力單位被定義為1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol底物所需的酶量為一個活力單位(u)。

如圖1所示，不同沉淀劑的選擇對固定化酶的制備具有較大影響。就磷脂酶d而言，本發(fā)明確定乙醇作為最優(yōu)沉淀劑。利用乙醇作沉淀劑制備的交聯(lián)印跡酶聚集體固定化磷脂酶d比活力可達到390u/g，甚至遠高于游離磷脂酶d的活力(137u/g)。另外，如圖所示，無論使用哪種沉淀劑，利用交聯(lián)印跡酶聚集體制備的固定化酶其酶活力都比交聯(lián)無印跡酶聚集體制備的固定化酶和游離磷脂酶d的活力高。這是因為，利用印跡技術(shù)，即通過酶與底物分子或抑制劑的預作用，使酶分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生定向變構(gòu)，形成利于催化的“超活化”狀態(tài)，再利用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)，通過分子間和分子內(nèi)的交聯(lián)作用，“僵化”酶分子的這種“超活化”結(jié)構(gòu)，使酶分子始終保持在利于催化的結(jié)構(gòu)狀態(tài)下，大大提高交聯(lián)酶聚集體固定化酶的催化性能。

實施例2：

本實施例給出一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，該方法按照以下步驟進行：

步驟一，磷脂酶d的印跡：

與實施例1的步驟一相同。

步驟二，磷脂酶d-底物配合物的沉淀：

向步驟一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8ml過冷(0℃以下)無水沉淀劑無水乙醇，滴加完畢后，繼續(xù)在冰浴下溫和攪拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶d-底物配合物聚集體混合溶液。

步驟三，磷脂酶d-底物配合物聚集體的交聯(lián)：

冰浴條件下，向步驟二中得到的混合溶液中加入水溶性交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為25％的戊二醛，調(diào)節(jié)反應液中戊二醛質(zhì)量濃度分別為0.5％，0.8％，1.0％，1.2％，1.5％，1.8％，2％，2.3％，2.5％，交聯(lián)120min，反應結(jié)束后離心收集產(chǎn)物，得到交聯(lián)酶-底物配合物聚集體。

步驟四，磷脂酶d配體底物的洗滌脫除：

與實施例1的步驟四相同，得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體，將制得交聯(lián)印跡酶聚集體置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對比例2：

本對比例給出一種磷脂酶d固定化方法，該方法的與實施例2的區(qū)別僅僅在于沒有實施例2的步驟一，即在其制備過程中不用添加印跡底物丙三醇。其余步驟與交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體的制備一樣，最終制得交聯(lián)無印跡磷脂酶d聚集體。

本對比例制得的交聯(lián)無印跡磷脂酶d聚集體作為對照組。

固定化酶活力的測定：

通過利用磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應制備磷脂酰甘油測定制備固定化磷脂酶d的活力，具體操作步驟如下：稱取20μg制備的固定化磷脂酶d(交聯(lián)印跡固定化酶或交聯(lián)無印跡固定化酶)超聲分散于0.5ml醋酸鈉緩沖液中(0.2m，ph5.5)，再加入0.05g丙三醇，將上述混合溶液與0.5ml磷脂酰膽堿濃度為1mg/ml的乙醚溶液混合。在400rpm，30℃下反應。每隔15min檢測溶液中磷脂酰甘油的生成速率。固定化磷脂酶d酶的活力單位被定義為1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol底物所需的酶量為一個活力單位(u)。

圖2是戊二醛濃度對所制備交聯(lián)丙三醇印跡磷脂酶d聚集體固定化酶活力的影響圖，其中虛線代表游離磷脂酶d的活力。如圖所示，隨著戊二醛濃度的增大，固定化酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。在戊二醛濃度較低時，酶分子間和分子內(nèi)的交聯(lián)作用不顯著，不能更好的“僵化”酶分子的這種“超活化”結(jié)構(gòu)，無法始終將酶分子保持在利于催化的結(jié)構(gòu)狀態(tài)下。此時酶分子與水相接觸后，其三維結(jié)構(gòu)會向酶分子的自然狀態(tài)變構(gòu)，印跡效果下降，宏觀表現(xiàn)為交聯(lián)印跡固定化酶活力下降。而當戊二醛濃度過高，戊二醛分子在一端連接蛋白質(zhì)分子的氨基時更易在另一端發(fā)生聚合作用，形成的聚合物會影響酶分子的三維結(jié)構(gòu)導致酶活力的下降。另外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)在制備交聯(lián)印跡固定化磷脂酶d與交聯(lián)無印跡固定化磷脂酶d有著不同的最優(yōu)戊二醛用量。交聯(lián)印跡固定化磷脂酶d其最優(yōu)戊二醛濃度為1.5％，其比活力可達到393u/g，遠高于游離磷脂酶d的活力(137u/g)，而交聯(lián)無印跡固定化磷脂酶d最優(yōu)戊二醛濃度為1.2％，其比活力僅為110u/g。這是因為，利用印跡技術(shù)，即通過酶與底物分子或抑制劑的預作用，使酶分子的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生定向變構(gòu)，形成利于催化的“超活化”狀態(tài)，這種“超活化”狀態(tài)擁有與自然態(tài)的酶分子不同的三維結(jié)構(gòu)，導致在分子間和分子內(nèi)的交聯(lián)作用時，為了維持一個最優(yōu)的結(jié)構(gòu)，根據(jù)其自身三維結(jié)構(gòu)需要不同的戊二醛濃度。

實施例3：

本實施例給出一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，該方法按照以下步驟進行：

步驟一，磷脂酶d的印跡：

將0.1ml含有磷脂酰膽堿濃度為1mg/ml的乙醚溶液加入1ml含有磷脂酶d濃度為0.05mg/ml的醋酸緩沖液(濃度為0.2m，ph值為5.5)，冰浴溫和攪拌下，印跡60min，得到含有酶-底物配合物(印跡酶)溶液。

步驟二，磷脂酶d-底物配合物的沉淀：

向步驟一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8ml過冷(0℃以下)無水沉淀劑無水乙醇，滴加完畢后，繼續(xù)在冰浴下溫和攪拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶d-底物配合物聚集體混合溶液。

步驟三，磷脂酶d-底物配合物聚集體的交聯(lián)：

冰浴條件下，向步驟二中得到的混合溶液中加入水溶性交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為25％的戊二醛，調(diào)節(jié)反應液中戊二醛質(zhì)量濃度分別為0.5％，0.8％，1.0％，1.2％，1.5％，1.8％，2％，2.3％，2.5％，交聯(lián)120min，反應結(jié)束后離心收集產(chǎn)物，得到交聯(lián)酶-底物配合物聚集體。

步驟四，磷脂酶d配體底物的洗滌脫除：

將步驟三中得到的交聯(lián)酶-底物配合物聚集體用1ml過冷無水乙醇沖洗3遍，洗去酶分子的配合底物，然后用去離子水沖洗至少三次，洗去未交聯(lián)的酶分子，冷凍干燥，得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體，將制得交聯(lián)印跡酶聚集體置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對比例3：

本對比例給出一種磷脂酶d固定化方法，該方法的與實施例3的區(qū)別僅僅在于沒有實施例3的步驟一，即在其制備過程中不用添加印跡底物磷脂酰膽堿。其余步驟與交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體的制備一樣，最終制得交聯(lián)無印跡磷脂酶d聚集體。

本對比例制得的交聯(lián)無印跡磷脂酶d聚集體作為對照組。

固定化酶活力的測定：

通過利用磷脂?；D(zhuǎn)移反應制備磷脂酰甘油測定制備固定化磷脂酶d的活力，具體操作步驟如下：稱取20μg制備的固定化磷脂酶d(交聯(lián)印跡固定化酶或交聯(lián)無印跡固定化酶)超聲分散于0.5ml醋酸鈉緩沖液中(0.2m，ph5.5)，再加入0.05g丙三醇，將上述混合溶液與0.5ml磷脂酰膽堿濃度為1mg/ml的乙醚溶液混合。在400rpm，30℃下反應。每隔15min檢測溶液中磷脂酰甘油的生成速率。固定化磷脂酶d酶的活力單位被定義為1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol底物所需的酶量為一個活力單位(u)。

圖3是戊二醛濃度對所制備交聯(lián)磷脂酰膽堿印跡磷脂酶d聚集體固定化酶活力的影響圖，其中虛線代表游離磷脂酶d的活力。如圖所示，當時用不同印跡底物時，以戊二醛用量為變量，觀察到的現(xiàn)象與實施例2類似，即酶活力隨戊二醛用量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，且交聯(lián)印跡酶聚集體與交聯(lián)無印跡酶聚集體有著不同的最優(yōu)戊二醛用量。交聯(lián)印跡固定化磷脂酶d其最優(yōu)戊二醛濃度為1.0％，其比活力可達到228u/g，遠高于游離磷脂酶d的活力(137u/g)，而交聯(lián)無印跡固定化磷脂酶d最優(yōu)戊二醛濃度為1.2％，其比活力僅為110u/g。相比丙三醇作為印跡物時，用磷脂酰膽堿作為印跡物分子得到的交聯(lián)印跡酶聚集體其酶活力相對較低。這是因為，磷脂酰膽堿自身不溶于水，需要將磷脂酰膽堿溶于乙醚后再和水相混合，此時相界面間的傳質(zhì)阻力無法避免，導致印跡效果不明顯。另外考慮到丙三醇相對磷脂酰膽堿，其價格十分便宜，因此在交聯(lián)印跡酶聚集體生產(chǎn)過程中選用丙三醇作為印跡物分子更具有實際意義。

實施例4：

本實施例給出一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，該方法按照以下步驟進行：

步驟一，磷脂酶d的印跡：

與實施例1的步驟一相同。

步驟二，磷脂酶d-底物配合物的沉淀：

向步驟一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8ml過冷(0℃以下)無水沉淀劑無水乙醇，滴加完畢后，繼續(xù)在冰浴下溫和攪拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶d-底物配合物聚集體混合溶液。

步驟三，磷脂酶d-底物配合物聚集體的交聯(lián)：

與實施例1的步驟三相同。

步驟四，磷脂酶d配體底物的洗滌脫除：

與實施例1的步驟四相同，得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體，將制得交聯(lián)印跡酶聚集體置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對比例4：

本對比例給出一種磷脂酶d固定化方法，該方法的與實施例4的區(qū)別僅僅在于沒有實施例4的步驟一，即在其制備過程中不用添加印跡底物丙三醇，其余步驟與交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體的制備一樣，最終制得交聯(lián)無印跡磷脂酶d聚集體。

固定化酶回收再利用和酶活力的測定：

通過利用磷脂?；D(zhuǎn)移反應制備磷脂酰甘油測定制備固定化磷脂酶d的活力，具體操作步驟如下：稱取20μg制備的固定化磷脂酶d(交聯(lián)印跡固定化酶或交聯(lián)無印跡固定化酶)超聲分散于0.5ml醋酸鈉緩沖液中(0.2m，ph5.5)，再加入0.05g丙三醇，將上述混合溶液與0.5ml磷脂酰膽堿濃度為1mg/ml的乙醚溶液混合。在400rpm，30℃下反應。使用后的固定化酶通過離心分離后回收再利用，固定化酶使用后先用去離子水反復沖洗，在4℃冷凍干燥即可再次使用，每次使用后都如此操作。重復使用后，測定酶活力，每隔15min檢測溶液中磷脂酰甘油的生成速率。固定化磷脂酶d酶的活力單位被定義為1min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol底物所需的酶量為一個活力單位(u)。

圖4是交聯(lián)丙三醇印跡磷脂酶d聚集體固定化酶的重復再利用的活性圖，其中虛線代表游離磷脂酶d的活力。如圖所示，交聯(lián)印跡酶聚集體經(jīng)重復使用8次后，酶比活力仍能達到140u/g，高于交聯(lián)無印跡酶聚集體首次使用時的酶活力(115u/g)，甚至與游離磷脂酶d首次使用時的酶活力幾乎一樣(137u/g)。說明本方法制備的印跡固定化酶，其印跡效果即便在水溶液中仍能得到較好的保存，固定化酶的穩(wěn)定性好，重復利用率高，從而達到降低成本的目的。

實施例5：

本實施例給出一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，該方法按照以下步驟進行：

步驟一，磷脂酶d的印跡：

將0.01g丙三醇加入1ml含有磷脂酶d濃度為0.05mg/ml的醋酸緩沖液(濃度為0.2m，ph值為5.5)，冰浴溫和攪拌下，印跡30min，得到含有酶-底物配合物(印跡酶)溶液。

步驟二，磷脂酶d-底物配合物的沉淀：

向步驟一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加10ml過冷(0℃以下)無水沉淀劑無水乙醇，滴加完畢后，繼續(xù)在冰浴下溫和攪拌下沉淀30min，得到含有磷脂酶d-底物配合物聚集體混合溶液。

步驟三，磷脂酶d-底物配合物聚集體的交聯(lián)：

冰浴條件下，向步驟二中得到的混合溶液中加入水溶性交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為25％的戊二醛，調(diào)節(jié)反應液中戊二醛質(zhì)量濃度為1.5％，交聯(lián)60min，反應結(jié)束后離心收集產(chǎn)物，得到交聯(lián)酶-底物配合物聚集體。

步驟四，磷脂酶d配體底物的洗滌脫除：

將步驟三中得到的交聯(lián)酶-底物配合物聚集體用去離子水沖洗，洗去酶分子的配合底物和未交聯(lián)的酶分子，用去離子水沖洗至少3次，冷凍干燥，得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體，將制得交聯(lián)印跡酶聚集體置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例6：

本實施例給出一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，該方法按照以下步驟進行：

步驟一，磷脂酶d的印跡：

將0.1g丙三醇加入1ml含有磷脂酶d濃度為0.05mg/ml的醋酸緩沖液(濃度為0.2m，ph值為6.0)，冰浴溫和攪拌下，印跡120min，得到含有酶-底物配合物(印跡酶)溶液。

步驟二，磷脂酶d-底物配合物的沉淀：

向步驟一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加9ml過冷(0℃以下)無水沉淀劑無水乙醇，滴加完畢后，繼續(xù)在冰浴下溫和攪拌下沉淀20min，得到含有磷脂酶d-底物配合物聚集體混合溶液。

步驟三，磷脂酶d-底物配合物聚集體的交聯(lián)：

冰浴條件下，向步驟二中得到的混合溶液中加入水溶性交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為25％的戊二醛，調(diào)節(jié)反應液中戊二醛質(zhì)量濃度為1.5％，交聯(lián)90min，反應結(jié)束后離心收集產(chǎn)物，得到交聯(lián)酶-底物配合物聚集體。

步驟四，磷脂酶d配體底物的洗滌脫除：

將步驟三中得到的交聯(lián)酶-底物配合物聚集體用去離子水沖洗，洗去酶分子的配合底物和未交聯(lián)的酶分子，用去離子水沖洗至少3次，冷凍干燥，得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體，將制得交聯(lián)印跡酶聚集體置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例7：

本實施例給出一種提高磷脂酰甘油合成反應活力的磷脂酶d固定化方法，該方法按照以下步驟進行：

步驟一，磷脂酶d的印跡：

將0.1ml含有磷脂酰膽堿濃度為0.1mg/ml的乙醚溶液加入1ml含有磷脂酶d濃度為0.05mg/ml的醋酸緩沖液(濃度為0.2m，ph值為5.0)，冰浴溫和攪拌下，印跡60min，得到含有酶-底物配合物(印跡酶)溶液。

步驟二，磷脂酶d-底物配合物的沉淀：

向步驟一中得到的酶-底物配合物溶液中滴加8ml過冷無水沉淀劑無水乙醇，滴加完畢后，繼續(xù)在冰浴下溫和攪拌下沉淀10min，得到含有磷脂酶d-底物配合物聚集體混合溶液。

步驟三，磷脂酶d-底物配合物聚集體的交聯(lián)：

冰浴條件下，向步驟二中得到的混合溶液中加入水溶性交聯(lián)劑質(zhì)量濃度為25％的戊二醛，調(diào)節(jié)反應液中戊二醛質(zhì)量濃度為1.0％，交聯(lián)120min，反應結(jié)束后離心收集產(chǎn)物，得到交聯(lián)酶-底物配合物聚集體。

步驟四，磷脂酶d配體底物的洗滌脫除：

將步驟三中得到的交聯(lián)酶-底物配合物聚集體用1ml過冷無水乙醇沖洗3遍，洗去酶分子的配合底物，然后用去離子水沖洗至少三次，洗掉未交聯(lián)的酶分子，冷凍干燥，得到交聯(lián)印跡磷脂酶d聚集體，將制得交聯(lián)印跡酶聚集體置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>