專利名稱：獲取生物肥料中膠凍樣芽孢桿菌工程菌株的生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及一種獲取生物肥料中膠凍樣芽孢桿菌 工程菌株的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
化肥的過量應(yīng)用，雖然提高了作物產(chǎn)量，卻造成了土壤環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的嚴重污染， 直接影響著人們的身體健康。生物肥料屬于無公害、無污染的綠色農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，具 有改良土壤、減少污染、增產(chǎn)增收的顯著特點，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護具有十分重要 的意義，受到世界農(nóng)業(yè)的廣泛關(guān)注。鉀是作物生長所需要的大量元素，土壤和施肥是作物鉀營養(yǎng)的主要來源，每畝土壤含鉀量約1740Kg，而其中只有2%的代換性鉀和水溶 性鉀可被作物吸收利用，而其余礦物態(tài)鉀無法被作物直接吸收。膠凍樣芽孢桿菌對礦 物態(tài)鉀具有很強分解能力，同時還有固氮、解磷的作用，所以膠凍樣芽孢桿菌在生物 肥料的生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用。目前在生物肥料的生產(chǎn)中，膠凍樣芽孢桿菌種子的選育、活化和生產(chǎn)工藝程序如下斜面菌種一孢子懸液一到平板一挑去有典型特征的菌落一斜面一復(fù)篩一一級擴大 培養(yǎng)一二級擴大培養(yǎng)一種子培養(yǎng) 發(fā)酵培養(yǎng)一吸附一成品。 這種生產(chǎn)工藝技術(shù)的缺點-1、 單從菌落特征無法準確判定生長勢、活性強的菌株；2、 多次傳代會使種子的活性逐漸降低；3、 發(fā)酵液菌數(shù)3億個/ML，有效活菌數(shù)低，很難提高產(chǎn)品質(zhì)量；4、 發(fā)酵液中生理活性物質(zhì)含量低，不能明顯的促進作物生長；5、 產(chǎn)品中膠凍樣芽孢桿菌的解鉀、解磷和固氮能力低；6、 產(chǎn)品中膠凍樣芽孢桿菌的抗逆性差，在干旱、高溫和強酸堿條件下容易死亡。為了提高膠凍樣芽孢桿菌的活性，增加發(fā)酵生產(chǎn)中的活菌數(shù)量，使膠凍樣芽孢桿 菌的肥效更加明顯，本發(fā)明者利用物理和化學手段對膠凍樣芽孢桿菌進行復(fù)合誘變，篩選出高產(chǎn)的、具有抗高溫和耐酸堿的膠凍樣芽孢桿菌突變菌株，突變株在發(fā)酵生產(chǎn)
中，發(fā)酵液中的活菌數(shù)從3億個/ML提高到20億個/ML，而且可分泌大量的植物激素、 氨基酸、有機酸等生理活性物質(zhì)，大大提高了固氮、解磷和解鉀的能力。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種獲取生物肥料中膠凍樣芽孢桿菌工程菌株的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明的目的通過以下措施來實現(xiàn)-本發(fā)明的生產(chǎn)工藝包括以下工序斜面菌種一孢子懸液一到平板一挑取有典型特 征的菌落一斜面一復(fù)篩一傳代實驗一一級擴大培養(yǎng)一二級擴大培養(yǎng)一種子培養(yǎng)一發(fā)酵 培養(yǎng)一吸附一成品，其特征在于，所述孢子懸液經(jīng)誘變處理。其中所述誘變處理包括硫酸二甲酯處理和紫外線誘變處理。所述硫酸二甲酯處理包括以下步驟(1) 將硫酸二甲酯用無水乙醇配制成0.5 0.7% (V/V)的溶液；(2) 將孢子懸液和硫酸二甲酯溶液與磷酸鹽緩沖液混合，震蕩80 100分鐘；(3) 移取菌液到NaS203溶液和磷酸鹽緩沖液中，終止化學誘變作用。 其中，在步驟(2)中所述震蕩釆用32"C往復(fù)式恒溫搖床。在步驟(2)和(3)中所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. lmol/L， pH為7.0。 在步驟(3)中所述NaSA溶液的濃度為20 30%。 所述紫外線誘變處理包括以下步驟(1) 移取經(jīng)硫酸二甲酯處理的菌液于培養(yǎng)皿中；(2) 在紫外燈下32 35cm處照射3 5分鐘。 其中，在步驟(2)中所述紫外燈的功率為20 30W。 本發(fā)明的技術(shù)優(yōu)點1、 通過理化處理，生長勢弱的菌株被滅活，高活性的膠凍樣芽孢桿菌菌株被篩 選出來；2、 提高了發(fā)酵生產(chǎn)水平，可使發(fā)酵液的活菌數(shù)達到16-20億個/ml比以前提高了 6-7倍；3、 生長素、赤霉素和細胞分裂素等植物生理活性物質(zhì)提高1-2倍；4、 提高了解鉀、解磷和固氮能力，解鉀能力提高3—4倍，解磷能力提高2-3倍;5、 提高了膠凍樣芽孢桿菌耐酸堿和高溫能力，pH在3.5-10.5,溫度在5(TC的
不良環(huán)境下，膠凍樣芽孢桿菌工程菌株能夠存活；6、降低了生產(chǎn)成本，比原來降低5-6倍，使產(chǎn)品更具有競爭力。
具體實施方式
以下用實施例對本發(fā)明作更詳細的描述。這些實施例僅僅是對本發(fā)明最佳實施方 式的描述，并不對本發(fā)明的范圍有任何限制。 實施例本發(fā)明的膠凍樣芽孢桿菌工程菌株的生產(chǎn)工藝按下述工序進行1、 斜面菌種將斜面菌種在32。C恒溫箱培養(yǎng)活化25-30小時左右；2、 孢子懸液將活化菌株用生理鹽水洗后，接種到盛有玻璃球的三角瓶中，在32"恒溫振蕩30分鐘后，血球記數(shù)板記數(shù)調(diào)整菌數(shù)濃度105個/克；3、 硫酸二甲酯處理a、 將硫酸二甲酯用無水乙醇配成0.5% (V/V)的溶液；b、 將制備的孢子懸液加入盛有16ral 0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)的無菌 三角瓶中，并加入0.5ml硫酸二甲酯(0.5%V/V)使它們充分混合，在32r往復(fù)式恒 溫搖床上震蕩80分鐘；c、 移出3ml菌液加入0. 5ml 20%的NaS20:,溶液和80ml磷酸鹽緩沖液中，終止化學誘變作用；4、 紫外線誘變處理a、 移取經(jīng)硫酸二甲酯處理的菌液10m1-12ml于直徑9cm的培養(yǎng)皿底座中；b、 在20w的長管型紫外燈下32cra處照射3分鐘；5、 到平板將經(jīng)理化誘變處理的菌懸液接種到盛有膠凍樣芽孢桿菌培養(yǎng)基的9cm 的培養(yǎng)皿中，用接種針涂抹均勻，在32。C恒溫箱培養(yǎng)30小時左右；6、 挑取有典型特征的菌落挑選單個菌落，大小2-3ram，表面光滑、潤濕，邊緣 整齊，凸起，粘稠發(fā)亮，不易挑起并拉絲的菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，在32'C恒溫箱 培養(yǎng)30小時左右;7、 搖瓶初篩a將斜面的培養(yǎng)基與菌苔一起攪碎接種到三角瓶的液體培養(yǎng)基中，在32°C、 180 轉(zhuǎn)/分的搖床下培養(yǎng)20小時左右；b、吸取10ml涂平板培養(yǎng)，挑取有典型特征的菌落，然后接種斜面培養(yǎng)，具體方 法同5、 6;
8、 復(fù)篩用新的斜面重復(fù)以上1 7的選種過程；
9、 一級擴大培養(yǎng)取復(fù)篩斜面種子一支，將培養(yǎng)基與菌苔一起攪碎接種到三角瓶的液體培養(yǎng)基中，在32。C、 180轉(zhuǎn)/分的搖床下培養(yǎng)20小時左右；
10、 二級擴大培養(yǎng)用無菌吸管吸取30 40ml—級擴大培養(yǎng)瓶中的菌液，接種于 二級擴大培養(yǎng)瓶中，放在大搖床32。C、 180轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)17小時；
11、 種子培養(yǎng)按1%的接種量將二級擴大培養(yǎng)液接種到種子罐，在通風比為1: 1， 罐壓l.O Mpa，溫度為32土2。C的條件下培養(yǎng)10小時；
12、 發(fā)酵培養(yǎng)將發(fā)酵好的種子液的2%接入發(fā)酵罐，在通風比1: 1，罐壓1. OMpa， 溫度32土2'C的條件下發(fā)酵培養(yǎng)24小時，發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵罐活菌平板計數(shù)為2 3億個 /ml;
13、 吸附用滅過菌的載體吸附；
14、 成品稱量包裝成品入庫。
權(quán)利要求
1. 一種獲取生物肥料中膠凍樣芽孢桿菌工程菌株的生產(chǎn)工藝，包括以下工序斜面菌種→孢子懸液→到平板→挑取有典型特征的菌落→斜面→復(fù)篩→傳代實驗→一級擴大培養(yǎng)→二級擴大培養(yǎng)→種子培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→吸附→成品，其特征在于，所述孢子懸液經(jīng)誘變處理。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)工藝，其中所述誘變處理包括硫酸二甲酯處理和紫 外線誘變處理。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其中所述硫酸二甲酯處理包括以下步驟(1) 將硫酸二甲酯用無水乙醇配制成0.5 0.7% (V/V)的溶液；(2) 將孢子懸液和硫酸二甲酯溶液與磷酸鹽緩沖液混合，震蕩80 100分鐘；(3) 移取菌液到NaSA溶液和磷酸鹽緩沖液中，終止化學誘變作用。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其中步驟(2)中所述震蕩采用32'C往復(fù)式 恒溫搖床。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其中步驟(2)和(3)中所述磷酸鹽緩沖液 的濃度為0. lmol/L， pH為7.0。
6、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的生產(chǎn)工藝，其中步驟(3)中所述NaSA溶液的濃度為 20 30%。
7、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)工藝，其中所述紫外線誘變處理包括以下步驟(1) 移取經(jīng)硫酸二甲酯處理的菌液于培養(yǎng)皿中；(2) 在紫外燈下32 35cm處照射3 5分鐘。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的生產(chǎn)工藝，其中步驟(2)中所述紫外燈的功率為20 30W。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種獲取生物肥料中膠凍樣芽孢桿菌工程菌株的生產(chǎn)工藝。本發(fā)明的技術(shù)方案是在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上，對菌株通過硫酸二甲酯處理及紫外線誘變處理，篩選出高產(chǎn)的、具有抗高溫和耐酸堿的膠凍樣芽孢桿菌突變菌株，并進行純培養(yǎng)。采取本發(fā)明工藝，可進一步提高發(fā)酵生產(chǎn)的活菌數(shù)量和分泌大量的植物活性物質(zhì)，使所得的膠凍樣芽孢桿菌菌株的解鉀解磷和固氮能力、抗旱抗病能力以及促進作物生長的能力得到提高，從而增強了生物肥料的肥效。
文檔編號C12N1/20GK101210226SQ20061014833
公開日2008年7月2日 申請日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者李芳柏, 李香真, 賈小紅, 閆龍翔 申請人:上海綠樂生物科技有限公司