本發(fā)明屬于家畜分子生物
技術領域：
：，涉及標記基因miR-429對下游基因調(diào)控在母豬產(chǎn)仔能力判斷方面的應用。
背景技術：
：：二十世紀50年代以來，國內(nèi)外豬的育種工作經(jīng)歷了從脂肪型到瘦肉型的轉變?nèi)〉昧孙@著成效，然而對于低遺傳力的繁殖性狀和難以活體測定的肉質(zhì)性狀，遺傳改良的進展十分緩慢。豬產(chǎn)仔性能是決定豬繁殖能力及現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟的重要因素之一。據(jù)Clutter等根據(jù)英國目前豬的養(yǎng)殖規(guī)模測算，只要將豬產(chǎn)仔數(shù)提高1-1.5頭，英國養(yǎng)豬業(yè)每年可獲得7億英鎊的額外利潤；所以通過提高每頭母豬斷奶仔豬的數(shù)量就可以以較小的額外投入，增加養(yǎng)豬生產(chǎn)者的經(jīng)濟回報。因此豬的產(chǎn)仔數(shù)性狀倍受育種者和生產(chǎn)者的關注，已經(jīng)成為我國當前豬遺傳育種的研究重點。豬的繁殖過程主要依賴于下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)控，這個過程受到基因與環(huán)境之間相互作用的影響。MicroRNA為一類長約21～24nt的非編碼小RNA，其通過對靶基因的轉錄后調(diào)控廣泛參與真核生物的生殖、發(fā)育、病毒防御、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等生命活動中。近年來，關于豬miRNAs的研究逐漸增多，但主要集中在豬的生長發(fā)育、疾病發(fā)生等相關方面。關于miRNAs對豬繁殖性能調(diào)控的研究則相對較少，對于miRNA如何在下丘腦-垂體-性腺軸中發(fā)揮作用尚不清楚。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于以大約克夏和皖南黑豬為試驗對象，通過實時熒光定量PCR技術了解miR-429在高低產(chǎn)仔數(shù)母豬生殖軸組織(垂體、下丘腦、卵巢、子宮、輸卵管)中的表達差異及規(guī)律，分析這些miRNAs可能在哪些組織發(fā)揮作用及的作用機制，以期為豬的候選miRNAs及優(yōu)良品種選育和利用提供參考。1.本發(fā)明提供標記基因miR-429對下游基因調(diào)控在母豬產(chǎn)仔能力判斷方面的應用，所述下游基因為ZEB1和LHβ；miR-429對下游基因調(diào)控為抑制靶基因ZEB1的表達，ZEB1與LHβ基因之間呈負調(diào)控關系，miR-429通過抑制靶基因ZEB1的表達間接上調(diào)LHβ基因表達；標記基因miR-429與母豬產(chǎn)仔能力呈正相關，靶基因ZEB1與母豬產(chǎn)仔能力呈負相關，靶基因LHβ與母豬產(chǎn)仔能力呈正相關；通過分析標記基因miR-429表達水平判斷母豬產(chǎn)仔能力大小。2.上述1提供的應用，該應用通過分析標記基因miR-429和靶基因ZEB1表達水平判斷母豬產(chǎn)仔能力大小。3.上述1提供的應用，該應用通過分析標記基因miR-429和靶基因LHβ表達水平判斷母豬產(chǎn)仔能力大小。4.上述1提供的應用，該應用通過分析標記基因miR-429、靶基因LHβ和靶基因ZEB1表達水平判斷母豬產(chǎn)仔能力大小。5.上述1-4任一項提供的應用，該應用方法具體包括如下步驟：(1)組織RNA提?。禾崛〔煌瑐€體母豬的輸卵管和垂體RNA；(2)引物設計：根據(jù)待分析目標基因分別設計候選基因miR-429的q-RT-PCR引物ssc-miR-429、ZEB1的q-RT-PCR引物ZEB1、LHβ的q-RT-PCR引物LHβ；(3)反轉錄合成cDNA：使用反轉錄試劑盒對反轉錄步驟(1)得到的總RNA合成cDNA；(4)采用q-RT-PCR方法測定候選基因miR-429、ZEB1、LHβ在母豬輸卵管和垂體中的相對表達量；(5)根據(jù)miR-429在輸卵管和垂體中的表達量，ZEB1和LHβ在垂體的表達量；判斷不同母豬個體之間產(chǎn)仔能力相對高低；其中，引物ssc-miR-429序列如SEQIDNO.1所示；引物對LHβ上游序列如SEQIDNO.2所示，下游序列如SEQIDNO.3所示；引物對ZEB1上游序列如SEQIDNO.4所示，下游序列如SEQIDNO.5所示。6.上述5提供的應用，其中，步驟(2)中還包括內(nèi)參基因引物的設計，其中，miR-429的內(nèi)參基因為U6，引物序列如SEQIDNO.6所示；LHβ和ZEB1的內(nèi)參基因為β-Actin，上游引物序列如SEQIDNO.7所示，下游引物序列如SEQIDNO.8所示。7.上述5提供的應用，其中，步驟(3)中反轉錄試劑盒Invitrogencode：A11193051進行翻轉錄，反轉錄體系為20μL，miR-429反轉錄過程體系中，總RNA1μL，SuperScriptR酶混合2μL，反應混合物4μL，超純水加至20μL；反應條件為：在37℃下60min，95℃維持5sec滅活反轉錄酶；LHβ和ZEB1反轉錄過程體系中，總RNA2.0μL，gDNAEraser1μL，5×gDNAEraserBuffer2.0μL，超純水加至20μL；反應條件為：37℃反應15min，85℃維持5sec滅活反轉錄酶；步驟(4)所述q-RT-PCR方法中反應體系為：miR-429為20μL反應體系，EXPRESSGreenERTMqPCR綠色熒光染料10μL，2μL引物ssc-miR-429、cDNA2μL加超純水至20μL；LHβ反應體系，iTaqTMUniversalGreenSupermix綠色熒光染料7.5μL、引物對LHβ上下游序列各0.5μL，cDNA1.5μL，超純水加至20uL：ZEB1反應體系同LHβ，引物對為ZEB1；反應過程為：miR-429為95℃20s、95℃5s、60℃20s，40個循環(huán)，于60℃20s時收集熒光值；LHβ和ZEB1為95℃3min、95℃5s、60℃30s，40個循環(huán)，于60℃30s時收集熒光值；其中，所述母豬品種為皖南黑豬和大約克夏豬。8.本發(fā)明還提供標記基因miR-429對下游基因調(diào)控機制的研究方法，本方法以皖南黑豬和大約克夏豬為對象，通過雙熒光素酶實驗確定了在豬中ssc-miR-429靶向于ZEB1的3’-UTR區(qū)域；通過凝膠遷移試驗明確了豬中轉錄因子ZEB1和LHβ的靶向關系。9.上述8所述的研究方法，其中，雙熒光素酶基因中所用載體包括熒光素酶報告載體：pGL3-Control，所用的酶切位點XbaI；miRNA表達載體：pmr-mcherry，所用的酶切位點為BglII和XbaI；引物包括PGL3-ZEB1和ssc-miR-429，其中，引物PGL3-ZEB1上游序列如SEQIDNO.9所示，下游序列如SEQIDNO.10所示；引物ssc-miR-429上游序列如SEQIDNO.11所示，下游序列如SEQIDNO.12所示。10.上述8所述的研究方法，其中，凝膠遷移試驗中DNA探針為T1和T2，其中，T1上游序列如SEQIDNO.13所示，下游序列如SEQIDNO.14所示；T2上游序列如SEQIDNO.15所示，下游序列如SEQIDNO.16所示。本申請?zhí)峁┑摹氨容^”概念是個體間的比較，根據(jù)不同個體間標記基因miR-429、靶基因ZEB1和LHβ表達量，可以確定不同個體間產(chǎn)仔能力的大小?！案摺薄暗汀蓖ㄟ^個體之間數(shù)據(jù)比較獲得，是一個相對的概念。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：1.本申請獲得了豬種垂體中miR-429，ZEB1和LHβ三者之間的靶向關系關系，填補了現(xiàn)有技術的空白，由此得出母豬產(chǎn)仔能力與候選基因表達差異之間的關系，為今后品種選育和新品系的建立提供參考。2.本發(fā)明明確了在母豬尤其是皖南黑豬和大約克夏豬品種中，垂體和輸卵管中miR-429表達量差異，快速判斷出不同母豬個體間產(chǎn)仔能力高低情況，同時結合垂體中ZEB1和LHβ表達量差異，更加準確快速比較出不同母豬個體間產(chǎn)仔能力高低，避免了外界環(huán)境因素對產(chǎn)仔能力判斷的失誤，減少選育過程中的復雜性，從分子水平上的檢測大大縮短了育種的時間。附圖說明圖1總RNA檢測結果。圖2miR-429在大約克夏和皖南黑豬的卵巢、子宮、輸卵管、下丘腦、垂體中的表達規(guī)律。其中，“**”為差異極顯著(P＜0.01)，“*”差異顯著(P＜0.05)。圖3miR-429在大約克夏高低產(chǎn)仔母豬的卵巢、子宮、輸卵管、下丘腦、垂體中的表達差異分析。其中，“**”為差異極顯著(P＜0.01)，“*”差異顯著(P＜0.05)。圖4miR-429在皖南黑豬高低產(chǎn)母豬的卵巢、子宮、輸卵管、下丘腦、垂體中的表達差異分析。其中，“**”為差異極顯著(P＜0.01)，“*”差異顯著(P＜0.05)。圖5pGL3-Control載體圖譜。圖6pmr-mcherry載體圖譜。圖7ZEB1在大約克夏高窩產(chǎn)仔組和低窩產(chǎn)仔組的卵巢、子宮、輸卵管、下丘腦、垂體等組織中的表達差異。其中，“**”為差異極顯著(P＜0.01)，“*”差異顯著(P＜0.05)。圖8LHβ在大約克夏高窩產(chǎn)仔組和低窩產(chǎn)仔組的卵巢、子宮、輸卵管、下丘腦、垂體等組織中的表達差異。其中，“**”為差異極顯著(P＜0.01)，“*”差異顯著(P＜0.05)。圖9ZEB1在皖南黑豬的卵巢、子宮、輸卵管、下丘腦、垂體等組織中的表達及差異分析。其中，“**”為差異極顯著(P＜0.01)，“*”差異顯著(P＜0.05)。圖10LHβ在皖南黑豬的卵巢、子宮、輸卵管、下丘腦、垂體等組織中的表達及差異分析。其中，“**”為差異極顯著(P＜0.01)，“*”差異顯著(P＜0.05)圖11ssc-miR-429和ZEB1測定序列與設計序列比較。其中，圖A表示ssc-miR-429和克隆到miRNA表達載體pmr-mcherry后的序列比較；圖B表示ZEB1和克隆到miRNA表達載體雙熒光素檢測載體pGL3-Control后的序列比較。圖12不同濃度LipofectamineTM2000的轉染效果。其中，圖A表示濃度為1ul的轉染效果；圖B表示濃度為2ul的轉染效果；圖C表示濃度為5ul的轉染效果。圖13空載體和帶有ssc-miR-429載體的熒光值比值。其中，“**”為差異極顯著(P＜0.01)。圖14根據(jù)酶標儀測定A562時不同濃度標準品吸光度數(shù)據(jù)制作標準曲線圖15DNA探針T1、T2與白豬子宮核蛋白相互作用的EMSA結果。其中，1為空探針、2為競爭、3為T1、4為空探針、5為競爭T2、6為T2。具體實施方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行具體闡述。實施例1：1.1試驗對象本試驗所用大約克夏和皖南黑豬取自安徽農(nóng)業(yè)大學試驗基地豬場。統(tǒng)計母豬產(chǎn)仔數(shù)進行正態(tài)分布分析，選擇處于間情期產(chǎn)仔數(shù)在兩尾分布且體況、年齡一致的健康母豬各3頭，屠宰取卵巢、垂體、下丘腦、輸卵管、子宮等組織，液氮保存用于總RNA的提取。樣本信息見表1。表1樣品信息注：表中的平均產(chǎn)仔數(shù)數(shù)值為平均值±標準誤1.2主要儀器和試驗試劑1.2.1主要儀器見表2.表2主要儀器1.2.2主要試劑見表3表3主要試劑其中無水乙醇、異丙醇、氯仿、DEPC處理水、瓊脂糖、10×TBE等試劑為進口或國產(chǎn)分裝試劑，均為分析純。1.3實驗方法1.3.1miR-429引物設計與合成根據(jù)最新miRase數(shù)據(jù)庫中豬的miR-429的成熟序列設計加尾法設計上游特異性引物，下游通用引物由Invitrogen試劑盒提供；通過熒光定量標準曲線實驗結果，選取U6作為miRNAs的內(nèi)參基因進行RT-PCR，實驗引物由上海生工基因公司合成。表4基因和miRNAs的引物序列注：F為上游引物，R為下游引物1.3.2總RNA提取和反轉錄1.3.2.1總RNA提取本試驗總RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen)提取法。操作步驟如下：將樣本用液氮迅速研磨后，取適量組織加入1mlTRIzol中，震蕩，室溫靜置，使其充分裂解，13000rpm離心5min，然后將管中的上清液轉移至新2.0mlEP管(如樣品為富含脂肪的組織，需將上層油脂去除)。加入氯仿，蓋緊管蓋，漩渦振蕩器上振蕩混勻，室溫靜置，使其自然分相。4℃，13000rpm離心，混合物會分成三層：下層紅色為苯酚-氯仿有機相，中間層和無色上層水相，RNA主要集中在水相。將上清轉入一新2.0mlEP管(注意不要吸到中間層和下層)，加入氯仿，漩渦振蕩器上振蕩混勻15s，室溫靜置，使其自然分相，4℃，13000rpm離心。將上層水相轉入新的1.5mlEP管，離心管上標明項目名稱、樣品名稱和日期，加入等體積的異丙醇，混勻后，-80℃或干冰放置一段時間。4℃，13000rpm離心，棄掉上清。向RNA沉淀中加入1ml75％乙醇，顛倒混勻5s，4℃，13000rpm離心5min，棄上清；重復步驟7。4℃，13000rpm離心1min，用槍頭小心吸棄多余液體。將RNA沉淀置于超凈工作臺吹干，約1-2min(不易太干，否則RNA很難溶解)，用適量RNase-FreeddH2O溶解RNA沉淀，必要時可用移液槍輕輕地吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。1.3.2.2RNA質(zhì)量檢測1)RNA濃度與純度檢測：取1μL待測RNA溶液，于超微量紫外分光光度儀上測定RNA的濃度與純度。RNA純度＝OD260/OD280，純度處于1.8-2.0之間為合格的RNA樣品，可進行反轉錄。若純度值低于1.8，是有蛋白質(zhì)污染；若純度值高于2.0，是有其他核酸污染。2)甲醛變性膠檢測RNA質(zhì)量：稱量2g瓊脂糖，加入20mL10×TBE，144mLDEPC水，微波爐加熱至完全溶解，待冷卻至60℃左右時加入5μL10mg/mL的EB溶液，在通風櫥中加入36mL甲醛，放置一段時間后待膠凝固后。取RNA樣品4μL加1μL的5×RNALoadingbuffer，在70℃水浴鍋內(nèi)加熱10min后，置于冰上驟冷后，將混合樣點在甲醛變性膠上，3-5V/cm電泳檢測，觀察電泳條帶。1.3.2.3miRNA的反轉錄及定量用反轉錄試劑盒(Invitrogencode：A11193051)，按下列組份進行配制反轉錄反應液，見表6。表6miRNA反轉錄反應操作步驟反轉錄的反應條件如下：在37℃下60min，95℃維持5sec(反轉錄酶失活反應)。反轉錄后獲得的樣品cDNA用于PCR檢測后，加入RNaseFree水至40μL。將反轉錄產(chǎn)物保存于-20℃冰箱內(nèi)。用實時熒光定量PCR方法來檢測豬miR-429和內(nèi)參基因U6基因的表達量，在Bio-radCFX96qPCR熒光定量PCR的系統(tǒng)上進行反應。反應體系為20μL，具體步驟如表7：表7RT-PCR反應操作步驟每個樣品重復3次。反應循環(huán)結束后，用溶解曲線圖來檢驗RT-PCR的產(chǎn)物純度。1.3.2.4基因表達數(shù)據(jù)分析基因的表達量分析：用2-ΔΔCt法對有效性數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。目的基因的相對表達量為2-ΔΔCT，ΔΔCt表示內(nèi)參基因，其中miRNA是以U6為內(nèi)參基因，以對照組目標基因與內(nèi)參基因的Ct差值平均值做為參照值，x表示任意一樣本，其公式如下：ΔΔCt＝(Ct.Targetgene-Ct.Referencegene)x-(Ct.Targetgene-Ct.Referencegene)control上述公式計算了每一個樣本目標基因的表達量，通過內(nèi)參基因校正后，數(shù)據(jù)用平均值±標準誤(M±SE)表示，采用GraphPadPrism6軟件對實驗數(shù)據(jù)結果進行統(tǒng)計學分析和作圖，均值差異顯著性用t-test方法進行分析比較。P＜0.01表明差異水平極顯著，P＜0.05表明為差異水平顯著。1.4結果與分析1.4.1總RNA的抽提與檢測從圖可以看出，提取的總RNA經(jīng)過1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以看到三條清晰的條帶，從上到下依次是28S、18S、5SrRNA。OD260/OD280的比值在1.9～2.1之間，表明提取的總RNA質(zhì)量完好，沒有蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)的污染，可以用來進行后續(xù)反轉錄試驗。1.4.2miR-429在兩個不同品種母豬生殖軸組織中的表達差異通過定量實驗發(fā)現(xiàn)miR-429三者的高表達組織各有不同。miR-429只在輸卵管和垂體中高表達。在相同組織中，miR-429在大約克夏垂體中的表達顯著低于皖南黑豬(P＜0.01)，在大約克輸卵管中的表達顯著高于皖南黑豬(P＜0.01)。1.4.3miR-429在同一品種不同產(chǎn)仔數(shù)母豬的生殖軸組織的表達規(guī)律在大約克中，高產(chǎn)組輸卵管和垂體中，miR-429的表達均高于低產(chǎn)組(P＜0.01或P＜0.05)。在皖南黑豬中，在高產(chǎn)組的垂體和輸卵管中miR-429的表達均高于低產(chǎn)組(P＜0.01)。1.5討論1.5.1miR-429對母豬產(chǎn)仔數(shù)的影響miR-429是屬于miR-200家族，其研究多集中在人的癌癥研究中。在豬上的研究特別是豬繁殖方面的研究十分稀缺。根據(jù)本實驗中miR-429在生殖軸各組織的定量數(shù)據(jù)可知，miR-429幾乎只在輸卵管和垂體這兩個組織中表達，而且在這兩個組織中高產(chǎn)組的表達均高于低產(chǎn)組。說明miR-429很可能在垂體和下丘腦中發(fā)揮對產(chǎn)仔性狀的調(diào)控作用。輸卵管具有極其復雜而精細的生理功能，對拾卵、精子獲能、卵子受精、受精卵輸送及早期胚胎的生存和發(fā)育都起著重要作用，所以輸卵管狀況的好壞對繁殖行為順利進行有著重要的意義。我們可以推斷miR-429可能在母豬的垂體和輸卵管中對母豬的產(chǎn)仔數(shù)產(chǎn)生上調(diào)的作用。1.6小結本試驗探討了miR-429的母豬生殖軸組織中的表達規(guī)律及在高、低產(chǎn)仔母豬群體中表達差異。通過對miR-429在兩個品種不同產(chǎn)仔數(shù)母豬的生殖軸組織的定量數(shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)在母豬的輸卵管和垂體中，miR-429可能對母豬的產(chǎn)仔性狀產(chǎn)生上調(diào)作用。實施例22.1試驗材料本實驗中實時熒光定量實驗所用的實驗樣品，與實施例1中相同。另外本試驗又從安徽農(nóng)業(yè)大學試驗基地豬場，選擇的健康的大約克夏母豬1頭，屠宰取子宮和心臟等組織，液氮保存。使用說明：由于子宮的樣本經(jīng)過實施例1的定量實驗，發(fā)現(xiàn)ZEB1在其中有較高水平的表達，所以選取大約克夏母豬的子宮細胞用來提取核蛋白進行EMSA實驗。用大約克夏母豬的心臟組織提取DNA，用于制作雙熒光素酶實驗所需的載體2.2常用儀器與試劑的配制常用儀器見表8.表8常用儀器常用試劑見表9。表9常用試劑另外配制如下試劑：(1)1.0％瓊脂糖電泳凝膠：稱取瓊脂糖0.5g加入50mL的IXTBE電泳緩沖液中，在微波爐中充分加熱溶解，冷卻至60℃后加2-3ul的Gelstain，并充分混勻。(2)6％非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制：在15ml試管中，按順序放入ddH2O7.15ml，30％聚丙烯酰胺溶液2ml，5×TBE1ml，甘油175ul，10％APS75ul，TEMED8ul，并充分混勻。1.3實驗方法1.3.1ZEB1和LHβ的實時熒光定量引物設計與合成根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中豬的ZEB1和LHβ的mRNA序列(序列號為：XM-003482813.2和NM-214080.1)用PrimerPremier5.0軟件設計目的基因的上、下游引物；并通過熒光定量標準曲線實驗結果，選取β-Actin(序列號為：XM-003124280.2)作為這些mRNAs的內(nèi)參基因進行RT-PCR，各個基因的引物由上海生工合成。各目的基因上、下游引物見表10。表10試驗所用引物注：F為上游引物，R為下游引物2.3.2雙熒光素酶所用載體及目的片段引物設計雙熒光素酶實驗所用的載體有合肥帛瑯生物科技公司負責構建：(1)熒光素酶報告載體：pGL3-Control，所用的酶切位點XbaI。pGL3-Control載體如圖5：(2)miRNA表達載體：pmr-mcherry[Clontech]，所用的酶切位點為BglII&XbaI。pmr-mcherry載體如圖6：結合上面的miRNA與靶基因ZEB13’UTR的預測結果和所用的載體和酶切位點的信息來設計引物，引物由上海生工負責合成，引物的具體信息如表11：表11雙熒光素酶實驗所用引物注：F為上游引物，R為下游引物2.3.3EMSA的DNA探針設計結合上面轉錄因子ZEB1與靶基因LHβ啟動子區(qū)的結合情況，選擇其中兩段預測的區(qū)域制備探針T1和T2，實驗所用到的DNA探針有南京鐘鼎生物負責合成，探針序列信息如表12。表12EMSA的探針引物注：F為正向引物，R為反向引物2.3.4ZEB1和LHβ的反轉錄及定量此反轉錄實驗用到的總mRNA為試驗一中提取的，反轉錄反應按TaKaRa的PrimeScriptTMRTreagentkitwithgDNAEraser(PeffectRealTime)試劑說明書進行：第一步是去除總RNA中的DNA。在0.2ml無RNA酶的PCR管中加入2μL(250ng/μL)總RNA、2μL5×gDNAEraserBuffer、1μLgDNAEraser，加入5μLRNaseFreedH2O至體積為10μL，離心后放入PCR儀中，42℃預變性2min，4℃保存。去除基因組DNA反應體系如表13所示。表13去除基因組DNA反應第二步，將處理后的產(chǎn)物進行反轉錄反應。向第一步的反應物中加入4μL5×PrimeScriptBuffer2(forRealTime)、1μLPrimeScriptRTEnzymeMixI、1μLRTPrimerMix，4μLRNaseFreedH2O，總體積為20μL，混勻后短暫離心，將反應管于PCR儀中37℃反應15min，85℃/5sec滅活反轉錄酶。反轉錄產(chǎn)物(RT產(chǎn)物)分裝后于-20℃保存用于實時定量PCR。mRNA反轉錄體系如表14。表14mRNA反轉錄體系用實時熒光定量PCR方法來檢測豬的ZEB1、LHβ及內(nèi)參基因β-Actin的表達量，在Bio-radCFX96qPCR熒光定量PCR的系統(tǒng)上進行反應。反應體系為20μL，每個樣品重復3次。反應循環(huán)結束后，基因定量數(shù)據(jù)處理和實施例1相同。具體步驟如表15。表15mRNA的RT-PCR反應操作步驟2.3.5雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?.3.5.1重組質(zhì)粒的抽提及測序鑒定本實驗按照北京全式金生物的EasyPurePlasmidMiniPrepKit試劑盒的說明書進行操作：去過夜培養(yǎng)的菌液，10,000xg離心1分鐘，去上清(盡量吸盡)。如菌液亮量過大，可分多次離心收集。加入無色溶液RB(含RNaseA)，震蕩懸浮菌體，不應留有小的菌塊。加入藍色溶液LB，溫和地上下翻轉混合4-6次，使菌體充分裂解，形成藍色透亮的溶液，顏色由半透亮變成透亮藍色，指示完全裂解(不宜超過5分鐘)。加入黃色溶液NB，輕輕混合5-6次(顏色由藍色完全變成黃色，指示混合均勻，中和完全)，直至形成緊實的黃色凝集塊，室溫靜置2分種。12,000xg離心5分鐘，小心吸取上清加入離心柱。12,000xg離心1分鐘，棄流出液。(如上清體積大于800ul，可以分成多次加入柱中，并同上離心，棄流出液)。加入250ul溶液TB，室溫靜置10分種，12,000xg離心1分種，棄流出液。加入650ul溶液WB，12,000xg離心1分種，棄流出液。12,000xg離心1-2分種，徹底去除殘留的WB。將離心柱置于一干凈的離心管中，在柱的中央加入30-50ulEB或去離子水(pH＞7.0)室溫靜置1分鐘。(EB或去離子水在60-70℃水浴預熱，使用效果更好)。10,000xg離心1分鐘，洗脫DNA，洗脫出的DNA于-20℃保存用于測序。2.3.5.2共轉染條件的優(yōu)化由于細胞共轉染的效率受脂質(zhì)體的量、脂質(zhì)體與載體的比例及實驗細胞等因素的影響。本實驗根據(jù)之前的實驗經(jīng)驗在細胞密度為70％最適合進行轉染實驗，實驗采用六孔板，每孔的質(zhì)粒的推薦添加量為2ug(1ugpmr-mcherryorpmr-mcherry-ssc-mir-429+1ugpGL3-Control-ZEB1)。為了去尋找每孔最優(yōu)的脂質(zhì)體的添加量，我們根據(jù)文獻設定1ul，2ul，5ul的3個不同用量的LipofectamineTM2000，然后觀察轉染效率。轉染前把細胞培養(yǎng)液換成無雙抗的DMEM培養(yǎng)基，293T細胞在細胞密度為70％進行轉染質(zhì)粒。在3個EP管中加入都加入125ul的OPTI-MEM，然后分別加入1ul，2ul，5ul的LipofectamineTM2000，震蕩混勻，靜置5min。每管中加入2ug質(zhì)粒(pmr-mcherry-ssc-mir-429+1ugpGL3-Control-ZEB1)，震蕩混勻，靜置20min。把靜置后的混合物加到六孔版中，6小時后換新鮮培養(yǎng)液，24小時觀察熒光，確認轉染效率。其中pmr-mcherry-ssc-mir-429質(zhì)粒帶有mcherry熒光染料，發(fā)紅光可以在倒置顯微鏡下直接觀察轉染效果。2.3.5.3共轉染及雙熒光素酶報告基因活性檢測在確定LipofectamineTM2000的最優(yōu)添加量之后，在6孔板中做兩組共轉染：1ugpGL3-Control-ZEB1+1ugpmr-mcherry-ssc-mir-429orpmr-mcherry。為了保證實驗的準確和可靠，我們每組做了5個生物學重復。轉染6小時后換新鮮培養(yǎng)液，24小時后用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶和海腎熒光值。其中Renilla熒光值作為內(nèi)參，進行歸一化處理，以消除細胞數(shù)量和轉染效率產(chǎn)生的差異。Dualluciferasereporterassaysystem檢測熒光活性的步驟：裂解細胞：對6孔板中培養(yǎng)的293T細胞，吸盡細胞培養(yǎng)液后，每孔直接加入充分混勻的報告基因細胞裂解液100ml，充分裂解細胞；溶解螢火蟲熒光素酶檢測試劑和海腎熒光素酶檢測緩沖液，并達到室溫。海腎熒光素酶檢測底物(100X)置于冰浴或冰盒上備用。按照每個樣品需要100ul的量，取適量的海腎熒光素酶檢測緩沖液，按照1∶100加入海腎螢光素酶檢測底物(100X)配置成海腎熒光素酶檢測工作液。按照說明書開啟熒光檢測儀，將測定時間間隔設為2s，測定時間定為10s.每個樣品測定時，加入100ul螢火蟲熒光素酶檢測試劑，用槍吹打混合均勻后測定RLU(relativelightunit)。用報告基因細胞裂解液為空白對照。在完成以上步驟后，加入100ul海腎熒光酶檢測工作液，用移液器打勻后測定RLU在以海腎熒光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲螢光素酶測定的RLU值除以海腎熒光素酶測定的RLU值。根據(jù)得到的比值來比較目的報告基因的激活程度。2.3.6EMSA實驗2.3.6.1核蛋白的提取本實驗按照ThermoScientific的NE-PERNuclearandCytoplasmicExtractionReagents試劑盒說明書進行操作：(1)采用預冷的PBS沖洗大白豬子宮組織樣品；轉移至1.5ml離心管中，500×g，離心3min；小心棄去上清，備用；(2)加入預冷的CERI(含ProteaseInhibitor)100ul；劇烈votex15s，冰浴10min；(3)加入預冷的CERII5.5ul；劇烈votex5s，冰浴1min；(4)劇烈votex5s，16000×g，離心10min；(5)立即吸取上清至一預冷的離心管中，即為抽提得到的組織漿蛋白；(6)加入預冷的NER(含ProteaseInhibitor)40ul；(7)劇烈votex15s，置于冰上，每10min劇烈votex15s，共40min；(8)16000×g，離心10min；立即吸取上清至一預冷的離心管中，即為抽提得到的組織核蛋白。2.3.6.2采用BCA檢測蛋白濃度：本實驗按照北京艾德萊的BCA蛋白定量試劑盒說明書進行操作：A先根據(jù)樣品數(shù)量，按照50倍體積SolutionA加1倍體積SolutionB(50∶1)配適量BCA工作液，充分混勻。B蛋白標準品完全溶解后，將稀釋后的標準品按0、1、2、4、8、12、16、20ul分別加到96孔板中，加稀釋液補足到20ul。C各孔加入200ulBCA工作液，輕輕吹打混勻，37℃放置45min。D冷卻到室溫后，用酶標儀測定A562的吸光度。并根據(jù)測定的數(shù)據(jù)制作標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。2.3.6.3ZEB1和LHB的EMSA實驗(1)6％非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制：在15ml試管中，按順序放入ddH2O7.15ml，30％聚丙烯酰胺溶液2ml，5×TBE1ml，甘油175ul，10％APS75ul，TEMED8ul；(2)4℃，100V電壓預電泳約60min；(3)根據(jù)PIERCE公司EMSA試劑盒(貨號：20148)要求配制結合反應液，室溫放置10min；(4)加入生物素標記的探針，室溫放置45min；(5)加入5ulLoadingBuffer到每一個結合反應中，混勻，上樣；(6)4℃，100V電壓電泳，至溴芬蘭電泳至2/3凝膠長度時停止電泳；(7)轉膜：將合適大小的尼龍膜浸泡在0.5×TBE中15min，按照夾心法依次將海綿、濾紙、凝膠、尼龍膜、濾紙、海綿順序放好，篩孔板固定，細心去除夾心內(nèi)所有氣泡，凝膠面向陰極插入電泳槽中，倒入0.5×TBE，300mA恒流電轉移30min；紫外線交聯(lián)；(8)化學發(fā)光法檢測生物素標記的DNA：參照PIERCE公司ChemiluminescentEMSAKit說明操作；(9)50℃水浴溫和地將封閉緩沖液(blockingbuffer)和4×漂洗緩沖液(WashBuffer)預熱，直至顆粒物全部溶解；(10)將膜放入潔凈的塑料平皿中，加入20ml封閉緩沖液，放在搖床上溫和搖動15min；(11)吸取66.7ul辣根抗生物素蛋白鏈菌素過氧化物酶底物到20ml封閉緩沖液，混勻備用；(12)將封閉緩沖液倒去，加入步驟10所配溶液，放在搖床上溫和搖動15min；(13)取40ml4漂洗緩沖溶液到120mlddH2O中，得到1漂洗緩沖溶液；將膜轉移到一個新的塑料平皿，加入20ml1漂洗緩沖溶液漂洗5min，共漂洗4次；(14)將膜轉移至另一新的塑料平皿，加入30ml底物平衡緩沖液，平衡5min；(15)配置底物工作液(SubstrateWorkingSolution)：將6mlLuminol/EnhancerSolution加入到6mlStablePeroxideSolution中，混勻，避光保存?zhèn)溆茫?16)將膜從底物平衡緩沖液中拿出，正面朝上放到新的潔凈平皿中，將底物工作液倒入膜的表面，避光放置5min；(17)將膜從底物工作液中取出，用塑封膜封好，避免氣泡和皺褶；(18)在暗房用X-rayfilm曝光，顯影，定影，洗片，曝光記錄結果。2.4結果2.4.1基因ZEB1和LHβ在同一品種不同產(chǎn)仔數(shù)母豬的生殖軸組織的表達規(guī)律如圖7-8，在大約克中，高產(chǎn)組垂體ZEB1的表達極顯著低于低產(chǎn)組(P＜0.01)。高產(chǎn)組垂體LHβ的表達極顯著高于低產(chǎn)組(P＜0.01)。如圖9-10，在皖南黑豬中，在高產(chǎn)組垂體中ZEB1的表達低于低產(chǎn)組(P＜0.01)。LHβ主要在垂體中表達具有組織特異性，且高產(chǎn)組高于低產(chǎn)組(P＜0.01)。2.4.2雙熒光素酶實驗，2.4.2.1重組質(zhì)粒的測序結果與分析根據(jù)我們設計引物獲取的片段序列和測序結果的序列比對來看，ssc-miR-429和ZEB13’UTR分別成功的克隆到miRNA表達載體pmr-mcherry和雙熒光素檢測載體pGL3-Control中，測定序列與設計完全一致如圖11，可以用與后續(xù)的雙熒光檢測實驗。2.4.2.2轉染條件的優(yōu)化本試驗就LipofectamineTM2000的最優(yōu)加入量，建立了3個不同加入量的實驗組A，B，C。由于轉染的pmr-mcherry-ssc-mir-429是帶有mcherry熒光蛋白，可以在倒置顯微鏡下觀察熒光發(fā)光朗讀水平，來評估轉染效率。具體結果如圖12所示結果表明，在LipofectamineTM2000的用量為5ul/well時，轉染效率最高。因此在下面的共轉染實驗中，使用LipofectamineTM2000為5ul/well，進行轉染。2.4.2.3雙熒光素酶報告基因活性的檢測實驗根據(jù)[PromegaDualluciferasereporterassaye1910]雙熒光報告系統(tǒng)的所明書操作，用FluoroskanAscentFL熒光化學發(fā)光微孔板讀數(shù)儀測得熒光值，然后將原始數(shù)據(jù)中的所有Luciferase熒光值用Renilla均一化處理，然后用GraphPadPrism6作圖13由圖13可知，空載體實驗組和帶有ssc-miR-429載體實驗組的熒光比值可知空載體組的熒光值極顯著高于帶有ssc-miR-429載體實驗組的熒光值(P＜0.01)。說明ssc-miR-429靶向于ZEB1的3’-UTR區(qū)域。24.3EMSA實驗2.4.3BCA檢測蛋白的濃度根據(jù)BCA試劑盒提供的測量方法：先用酶標儀測定不同濃度標準品在A562時吸光度，然后根據(jù)數(shù)據(jù)制作標準曲線如圖表16BCA法測定的不同濃度標準品的吸光度依據(jù)標準曲線和A562是樣品的吸光度，計算得出白豬子宮中的蛋白濃度提取濃度為＝16.46mg/ml，符合下一步EMSA的實驗要求。2.4.4EMSA實驗的鑒定結果EMSA結果顯示如圖15，T1和T2的膠孔中均出現(xiàn)DNA探針與目的蛋白結合并遷移的條帶，表明樣品的核蛋白中確實存在能與DNA探針特異性結合的轉錄因子原件。但由于樣品提取的核蛋白中含有內(nèi)源性生物素，故競爭T1和競爭T2均顯示有條帶。從以上試驗結果中miR-429，ZEB1，LHβ的定量數(shù)據(jù)可知，在垂體中miR-429有下調(diào)ZEB1的趨勢，ZEB1也有下調(diào)LHβ的趨勢，因此，在豬的垂體中，miR-429可能也存在這種通過下調(diào)靶基因ZEB1從而上調(diào)繁殖力候選基因-LHβ的調(diào)控機制。miRNA能過通過靶向基因的3’UTR區(qū)域進行轉錄后調(diào)控，從而對靶基因的蛋白表達水平發(fā)揮調(diào)控作用。根據(jù)本實施例中，空載體實驗組的熒光值高于帶有ssc-miR-429載體實驗組的熒光值(P＜0.01)，我們可以確定在豬上miR-429和ZEB1之間存在著靶向關系，可以被其上調(diào)。結合試驗中EMSA的結果，我們發(fā)現(xiàn)只在特異性DNA探針T1和T2的電泳泳道中出現(xiàn)探針與目的蛋白結合并遷移的條帶，表明樣品的核蛋白中確實存在能與DNA探針特異性結合的轉錄因子原件。這更加明確了轉錄因子ZEB1和LHβ的靶向關注。綜上所訴，我們利用已有的實驗結果，初步驗證了miR-429在垂體中可以通過下調(diào)ZEB1從而上調(diào)LHβ的調(diào)控機制。上述實施例首先分析miR-429在高低產(chǎn)大約克夏和皖南黑豬生殖組織中的表達規(guī)律，得出miR-429可能影響豬產(chǎn)仔性能的推論。接著通過實時熒光定量，雙熒光素酶報告基因，電泳遷移率等多個驗證實驗，驗證miR-429調(diào)控豬產(chǎn)仔性狀的分子機制。得出：(1)miR-429參與豬生殖調(diào)控；(2)miR-429可通過抑制靶基因ZEB1的表達而間接上調(diào)LHβ基因的表達，從而調(diào)控豬的產(chǎn)仔性能?？梢灾?，上述實施例僅為了說明發(fā)明原理而采用的示例性實施方式，然而本發(fā)明不僅限于此，本領域技術人員在不脫離本發(fā)明實質(zhì)情況下，可以做出各種改進和變更，這些改進和變更也屬于本發(fā)明的保護范圍。當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3