本發(fā)明涉及高通量測(cè)序領(lǐng)域，即二代測(cè)序(NGS)范疇。更具體地，涉及一種利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

隨著科技的不斷進(jìn)步，傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序已經(jīng)不能完全滿足研究和應(yīng)用的需求，對(duì)基因組測(cè)序，需求費(fèi)用更低、速度更快、通量更高的測(cè)序技術(shù)——第二代測(cè)序技術(shù)(NGS)應(yīng)運(yùn)而生。測(cè)序文庫(kù)的定量分析和質(zhì)量評(píng)價(jià)對(duì)于獲得高質(zhì)量的核酸測(cè)序數(shù)據(jù)十分重要，要控制NGS測(cè)序儀上測(cè)序文庫(kù)的載入量，保證測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)量，就需要在測(cè)序前對(duì)DNA測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行精確的定量檢測(cè)分析，力求準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)簇密度，從而合理安排樣本的上樣量和上樣比例。文庫(kù)精確的定量對(duì)于二代測(cè)序的結(jié)果非常關(guān)鍵，過(guò)低估計(jì)文庫(kù)的大小，容易導(dǎo)致clusters或多重模板太多，數(shù)據(jù)質(zhì)量不高；過(guò)高估計(jì)文庫(kù)的大小，導(dǎo)致數(shù)據(jù)讀取量少，基因組覆蓋率低，所以低估或高估文庫(kù)的量都會(huì)影響測(cè)序質(zhì)量與效果。

NGS流程使用多種文庫(kù)定量方法，例如qPCR定量法、分光光度計(jì)(如NanoDrop)、熒光染料法(Qubit)或電泳設(shè)備(Bioanalyzer)，其中，qPCR定量法只測(cè)定可擴(kuò)增文庫(kù)的分子(雙端接頭完整)，避免非特異性檢測(cè)，測(cè)定值與真實(shí)值最接近，并且檢測(cè)靈敏度最高，非常適合低濃度文庫(kù)(PCR-free文庫(kù))的檢測(cè)，因此，qPCR是DNA文庫(kù)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，也是唯一一種能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出分子數(shù)目的方法。理論上來(lái)說(shuō)，文庫(kù)定量試劑盒所定量的濃度應(yīng)該與分光光度計(jì)方法定量的濃度接近或比其低。

qPCR法進(jìn)行準(zhǔn)確定量的一個(gè)前提是保證標(biāo)準(zhǔn)品和未知樣品的擴(kuò)增效率相同，否則無(wú)法進(jìn)行精確定量。針對(duì)不同GC含量的文庫(kù)定量，特別是高GC/AT的文庫(kù)，為保證qPCR法的準(zhǔn)確定量，目前主要通過(guò)改善DNA聚合酶避免PCR擴(kuò)增的偏好性、優(yōu)化反應(yīng)體系(添加GC buffer)、優(yōu)化反應(yīng)條件(提高預(yù)變性溫度)等方式進(jìn)行，例如市場(chǎng)上主流產(chǎn)品KAPA Library Quantification Kits中包含有的KAPA SYBR FAST DNA聚合酶，宣稱針對(duì)高GC/AT的DNA片段可以獲得相似的擴(kuò)增效率，但是我們的多次比較實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)相同濃度的不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其Ct值會(huì)有明顯差異(圖1)，這說(shuō)明其依然無(wú)法保證完全相同的擴(kuò)增效率，避免模板的擴(kuò)增偏好性，對(duì)于富含GC/AT的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增效率要低。因此，如果只用一種GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品，目前的方法無(wú)法對(duì)不同GC含量的文庫(kù)進(jìn)行精確定量，然而通過(guò)改變標(biāo)準(zhǔn)品的GC含量的研究幾乎沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道。

本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)不同GC含量的文庫(kù)模板DNA模板的GC含量是影響qPCR擴(kuò)增的一個(gè)重要因素，特別是富含GC/AT模板的擴(kuò)增，當(dāng)以相同引物、同一條件擴(kuò)增不同GC含量的目的片段，其Ct值會(huì)有明顯差異。另外，本發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)不同形式的模板(質(zhì)粒、gDNA、cDNA、PCR產(chǎn)物、人工合成片段等)擴(kuò)增效率也會(huì)不一樣，研究報(bào)道線性片段的DNA模板比質(zhì)粒模板的Ct值明顯要小，特別是對(duì)于低拷貝數(shù)的模板，線性片段DNA更容易被擴(kuò)增。生物界(動(dòng)物、植物、細(xì)菌、真菌、病毒等)不同物種基因組DNA的GC含量差異很大(20％-80％)，因此，開(kāi)發(fā)出一種針對(duì)不同GC含量的文庫(kù)模板，選擇與文庫(kù)GC含量接近的線性片段DNA標(biāo)準(zhǔn)品的利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的試劑盒和方法，對(duì)于第二代測(cè)序結(jié)果精確性具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種利用qPCR精確定量Illumina平臺(tái)不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的試劑盒，使得qPCR文庫(kù)定量的準(zhǔn)確性更高，進(jìn)而獲得高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果；

本發(fā)明的目的之二是提供一種利用上述試劑盒進(jìn)行qPCR精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的方法。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

一種利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的試劑盒，包括：多個(gè)不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品，文庫(kù)稀釋液，qPCR預(yù)混液，引物(Primer Premix)，ddH₂O；其中，所述引物為

Primer P5:5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’(SEQ ID NO:1所示)

Primer P7:5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’(SEQ ID NO:2所示)。

進(jìn)一步，所述不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品是通過(guò)使用電腦隨機(jī)合成的不同GC含量的DNA片段，所述不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品個(gè)數(shù)可以為2-10個(gè)，優(yōu)選的為3-9個(gè)，更優(yōu)選的為5-7個(gè)；所述標(biāo)準(zhǔn)品的GC含量為20％-80％，其中，至少有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的GC含量為20％-50％，有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的GC含量為50％-80％；所述標(biāo)準(zhǔn)品是線性DNA片段，其中，包含有P5/P7接頭引物序列。

不同物種基因組GC含量差異明顯，二代測(cè)序構(gòu)建的DNA文庫(kù)GC含量不同。如果不考慮文庫(kù)的GC含量差異，只選擇單一的標(biāo)準(zhǔn)品，利用qPCR定量時(shí)由于DNA聚合酶擴(kuò)增效率不一樣，缺乏針對(duì)不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品，導(dǎo)致文庫(kù)定量不準(zhǔn)確，富含GC/AT序列文庫(kù)以及低樣品文庫(kù)定量差異更加明顯，無(wú)法準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)簇密度，嚴(yán)重影響測(cè)序質(zhì)量與效果。本發(fā)明創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)涵蓋GC含量范圍的多個(gè)特征性標(biāo)準(zhǔn)品(2-10個(gè)，3-9個(gè)，4-8個(gè)或者5-7個(gè)，但不限于此)，都是包含有P5/P7接頭引物序列的線性DNA片段，方便根據(jù)文庫(kù)的GC含量選擇最佳標(biāo)準(zhǔn)品，確保qPCR文庫(kù)定量的準(zhǔn)確性，合理安排不同GC含量樣本的上樣量和上樣比例，獲得高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果。表1與表2分別列出了可以設(shè)計(jì)的5個(gè)或者7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的GC含量。

表1 5個(gè)DNA標(biāo)準(zhǔn)品的GC含量

表2 7個(gè)DNA標(biāo)準(zhǔn)品的GC含量

進(jìn)一步，所述標(biāo)準(zhǔn)品為預(yù)先稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品。

試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品一般選用預(yù)先梯度稀釋好的，方便直接使用，確保穩(wěn)定性，避免操作誤差。

進(jìn)一步，所述標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增片段的大小為300-600bp，優(yōu)選的為400-500bp，更優(yōu)選的為420bp。

本發(fā)明DNA標(biāo)準(zhǔn)品是專為二代測(cè)序平臺(tái)設(shè)計(jì)，根據(jù)二代測(cè)序文庫(kù)一般為平均長(zhǎng)度為300-600bp的線性片段這個(gè)特性，因此，通過(guò)使用電腦隨機(jī)合成了不同GC含量的DNA片段，其擴(kuò)增大小應(yīng)在300-600bp范圍內(nèi)，優(yōu)選的為400-500bp，更優(yōu)選的為420bp。

進(jìn)一步，所述文庫(kù)稀釋液除了緩沖體系，還包括有一種或者多種穩(wěn)定劑；所述緩沖體系為該領(lǐng)域內(nèi)常用的緩沖體系，優(yōu)選的為Tris-HCl，更優(yōu)選的為pH＝8.0的10mM Tris-HCl；所述穩(wěn)定劑為BSA、carrier RNA、tRNA、carrier DNA、EDTA、Tween 20中的一種或多種；優(yōu)選的，所述BSA的濃度為0.2-2mg/ml、carrier RNA的濃度為0.01-0.2mg/ml、tRNA的濃度為0.01-0.2mg/ml、carrier DNA的濃度為0.01-0.1mg/ml、EDTA的濃度為0.2-2mM、Tween 20的濃度為0.02％-0.1％。

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液如果直接用水或TE Buffer稀釋，由于受微管吸附作用等的影響，往往不能準(zhǔn)確地進(jìn)行稀釋，容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果精度降低。使用本發(fā)明中的文庫(kù)稀釋液來(lái)稀釋文庫(kù)與標(biāo)準(zhǔn)品，即使稀釋至低濃度也能夠進(jìn)行準(zhǔn)確地稀釋，容易在寬廣范圍內(nèi)獲得準(zhǔn)確定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且不影響PCR反應(yīng)，用其稀釋后的樣品可直接使用，并且可以穩(wěn)定保存DNA樣品。

進(jìn)一步，所述qPCR預(yù)混液為TransNGS Green qPCR SuperMix，該預(yù)混液為一種基于抗體法熱啟動(dòng)的新型染料法qPCR預(yù)混液。這種qPCR預(yù)混液具有特異性高、擴(kuò)增效率高、GC含量適應(yīng)性廣、檢測(cè)靈敏度高、可以擴(kuò)增大片段等諸多優(yōu)勢(shì)，非常適合進(jìn)行文庫(kù)濃度的絕對(duì)定量。

一種利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的方法(具體操作流程見(jiàn)圖2)：

1)標(biāo)準(zhǔn)品選擇：根據(jù)待測(cè)DNA文庫(kù)GC含量(可以從基因庫(kù)獲知常見(jiàn)模式生物的基因組GC含量，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)，選擇與待測(cè)樣品DNA文庫(kù)GC含量最為接近的標(biāo)準(zhǔn)品；

2)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測(cè)DNA文庫(kù)qPCR：測(cè)定待測(cè)DNA文庫(kù)的平均長(zhǎng)度，使用文庫(kù)稀釋液梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)DNA文庫(kù)后，進(jìn)行qPCR，獲得稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)DNA文庫(kù)的Ct值，以稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)和以稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值對(duì)應(yīng)的Log[pM]為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中，所述pM為稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的濃度；

3)待測(cè)DNA文庫(kù)濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)的Ct值計(jì)算稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)的濃度，依據(jù)待測(cè)DNA文庫(kù)的平均長(zhǎng)度進(jìn)行校正，進(jìn)一步根據(jù)文庫(kù)稀釋度獲得待測(cè)DNA文庫(kù)濃度。

進(jìn)一步，步驟2)中稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的個(gè)數(shù)為4-8個(gè)，濃度范圍為0.0001pM-100pM，拷貝數(shù)范圍是10¹-10⁸個(gè)/微升。該范圍內(nèi)能保證標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，確保定量結(jié)果的穩(wěn)定性與重復(fù)性。

進(jìn)一步，所述步驟2)中相鄰一組標(biāo)準(zhǔn)品間的ΔCt值在3.1-3.6之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率保證在90-110％之間，R²值不小于0.99，確保PCR指數(shù)擴(kuò)增，方可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

進(jìn)一步，所述qPCR的體系為：總體積20μl:qPCR預(yù)混液10μl，引物2μl，ddH₂O 4μl，標(biāo)準(zhǔn)品4μl；或者總體積10μl:qPCR預(yù)混液5μl，引物1μl，ddH₂O 2μl，標(biāo)準(zhǔn)品2μl；

所述qPCR程序，可以選擇兩步法或者三步法，根據(jù)儀器要求添加熔解曲線步驟，便于擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性分析。

其中，三步法的程序?yàn)椋?/p>

兩步法的程序?yàn)椋?/p>

若文庫(kù)平均長(zhǎng)度大于700bp，建議把延伸時(shí)間適當(dāng)增加15-25s。

本發(fā)明的有益效果如下：

目前qPCR是DNA文庫(kù)定量的金標(biāo)準(zhǔn)，也是唯一能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出有效分子數(shù)目的方法。不論以使用何種方式構(gòu)建，只要文庫(kù)末端包含Illumina P5和P7芯片結(jié)合序列、長(zhǎng)度不超過(guò)1kb且濃度不低于0.0002pM，都可以使用本發(fā)明方法或者試劑盒進(jìn)行精確定量，指導(dǎo)合理安排樣本的上樣量和多樣品混樣比例，力求準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)簇密度，獲取高數(shù)據(jù)量的測(cè)序read。

本發(fā)明方法和試劑盒克服了目前單一GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品引起的不同GC含量DNA文庫(kù)定量誤差較大的缺陷，確?？梢垣@得可重復(fù)、準(zhǔn)確可靠、高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果。通過(guò)與現(xiàn)有產(chǎn)品進(jìn)行比較，本發(fā)明試劑盒和方法可以避免GC含量不同所引起的定量誤差，更精確地指導(dǎo)不同GC含量的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)其定量的結(jié)果上樣，同一測(cè)序Lane上不同的GC含量文庫(kù)與預(yù)期更為準(zhǔn)確，獲得更高的測(cè)序read。

本方法定量精確、使用方便、適用范圍廣、其選擇性強(qiáng)、靈敏度高、特異性好，為高質(zhì)量高效率的測(cè)序提供了保證，是二代測(cè)序中文庫(kù)定量的最佳選擇，彌補(bǔ)了目前定量方法的缺陷。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1示出KAPA公司產(chǎn)品擴(kuò)增同一濃度的5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品的曲線圖；

圖2示出針對(duì)不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)qPCR定量操作過(guò)程；

圖3示出同一濃度的5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線；

圖4示出同一濃度的5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品熔解曲線；

圖5示出6個(gè)梯度濃度預(yù)稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線；

圖6示出6個(gè)梯度濃度預(yù)稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖7示出10倍梯度濃度稀釋的二代測(cè)序DNA文庫(kù)的擴(kuò)增曲線；

圖8示出5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖9示出分別以5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品定量天藍(lán)色鏈霉菌DNA文庫(kù)結(jié)果；

圖10示出分別以5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品定量擬南芥DNA文庫(kù)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說(shuō)明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1

利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的試劑盒，包括：5個(gè)不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品是線性DNA片段，包含有P5/P7接頭引物序列，擴(kuò)增片段大小為420bp，其GC含量見(jiàn)表1)，文庫(kù)稀釋液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl和濃度為1mg/ml BSA以及0.05％的Tween 20的混合物)，基于抗體法熱啟動(dòng)的新型染料法qPCR預(yù)混液TransNGS Green qPCR SuperMix，引物(Primer Premix)，ddH₂O；其中，所述引物為

Primer P5:5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’(SEQ ID NO:1所示)

Primer P7:5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’(SEQ ID NO:2所示)

利用上述試劑盒精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的方法，包括：

1)標(biāo)準(zhǔn)品選擇：根據(jù)待測(cè)DNA文庫(kù)GC含量(可以從基因庫(kù)獲知常見(jiàn)模式生物的基因組GC含量，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)，從表1選擇與待測(cè)樣品DNA文庫(kù)GC含量最為接近的標(biāo)準(zhǔn)品；

2)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測(cè)DNA文庫(kù)qPCR：測(cè)定待測(cè)DNA文庫(kù)的平均長(zhǎng)度，使用文庫(kù)稀釋液梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)DNA文庫(kù)后，進(jìn)行qPCR，獲得稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)DNA文庫(kù)的Ct值，以稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)和以對(duì)應(yīng)的Log[pM]為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，

稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的個(gè)數(shù)為6個(gè)，表3給出了配制好的6個(gè)10x梯度稀釋的穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度范圍為0.0002pM-20pM，拷貝數(shù)為1.2×10²-1.2×10⁷，其穩(wěn)定性高，線性關(guān)系好，確保定量結(jié)果的穩(wěn)定。

表3預(yù)稀釋好標(biāo)準(zhǔn)品濃度與拷貝數(shù)

qPCR的體系為總體積20μl:TransNGS Green qPCR SuperMix 10μl，引物2μl，ddH₂O 4μl，標(biāo)準(zhǔn)品4μl；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋后的文庫(kù)以及NTC(文庫(kù)稀釋液)做好平行孔(3個(gè))，根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)加DYE，采用兩步法進(jìn)行qPCR。

3)待測(cè)DNA文庫(kù)濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)的Ct值計(jì)算稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)的濃度，依據(jù)文庫(kù)平均長(zhǎng)度進(jìn)行校正，進(jìn)一步根據(jù)文庫(kù)稀釋度獲得待測(cè)DNA文庫(kù)濃度。

實(shí)施例2

利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的試劑盒，包括：7個(gè)不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品是線性DNA片段，包含有P5/P7接頭引物序列，擴(kuò)增片段大小為300bp，其GC含量見(jiàn)表2)，文庫(kù)稀釋液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl和濃度為0.05mg/ml的carrier RNA的混合物)，基于抗體法熱啟動(dòng)的新型染料法qPCR預(yù)混液TransNGS Green qPCR SuperMix，引物(Primer Premix)，ddH₂O；其中，所述引物為

Primer P5:5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’(SEQ ID NO:1所示)

Primer P7:5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’(SEQ ID NO:2所示)

利用上述試劑盒精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的方法，包括：

1)標(biāo)準(zhǔn)品選擇：根據(jù)待測(cè)DNA文庫(kù)GC含量(可以從基因庫(kù)獲知常見(jiàn)模式生物的基因組GC含量，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)，從表2中選擇與待測(cè)樣品DNA文庫(kù)GC含量最為接近的標(biāo)準(zhǔn)品；

2)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測(cè)DNA文庫(kù)qPCR：測(cè)定待測(cè)DNA文庫(kù)的平均長(zhǎng)度，使用文庫(kù)稀釋液梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)DNA文庫(kù)后，進(jìn)行qPCR，獲得稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)DNA文庫(kù)的Ct值，以稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)和以稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值對(duì)應(yīng)的Log[pM]為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，

稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的個(gè)數(shù)為8個(gè)，表4給出了配制好的8個(gè)5x梯度稀釋的穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度范圍為0.0005-40pM，拷貝數(shù)為3×10²-2.4×10⁷個(gè)/μl。

表4預(yù)稀釋好標(biāo)準(zhǔn)品濃度與拷貝數(shù)

qPCR的體系為總體積20μl:TransNGS Green qPCR SuperMix 10μl，引物2μl，ddH₂O 4μl，標(biāo)準(zhǔn)品4μl；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)以及NTC(文庫(kù)稀釋液)做好平行孔(2個(gè))，根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)加DYE，采用三步法進(jìn)行qPCR。

3)待測(cè)DNA文庫(kù)濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)的Ct值計(jì)算稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)的濃度，依據(jù)文庫(kù)平均長(zhǎng)度進(jìn)行校正，進(jìn)一步根據(jù)文庫(kù)稀釋度獲得待測(cè)DNA文庫(kù)濃度。

實(shí)施例3

利用qPCR精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的試劑盒，包括：5個(gè)不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品(標(biāo)準(zhǔn)品是線性DNA片段，包含有P5/P7接頭引物序列，擴(kuò)增片段大小為600bp，其GC含量見(jiàn)表1)，文庫(kù)稀釋液(pH＝8.0的10mM Tris-HCl和濃度為1mM的EDTA以及0.05mg/ml的tRNA的混合物)，基于抗體法熱啟動(dòng)的新型染料法qPCR預(yù)混液TransNGS Green qPCR SuperMix，引物(Primer Premix)，ddH₂O；其中，所述引物為

Primer P5:5’-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA-3’(SEQ ID NO:1所示)

Primer P7:5’-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA-3’(SEQ ID NO:2所示)

利用上述試劑盒精確定量不同GC含量的二代測(cè)序文庫(kù)的方法，包括：

1)標(biāo)準(zhǔn)品選擇：根據(jù)待測(cè)DNA文庫(kù)GC含量(可以從基因庫(kù)獲知常見(jiàn)模式生物的基因組GC含量，例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/)，從表2中選擇與待測(cè)樣品DNA文庫(kù)GC含量最為接近的標(biāo)準(zhǔn)品；

2)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線與待測(cè)DNA文庫(kù)qPCR：測(cè)定待測(cè)DNA文庫(kù)的平均長(zhǎng)度，使用文庫(kù)稀釋液梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)DNA文庫(kù)后，進(jìn)行qPCR，獲得稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)DNA文庫(kù)的Ct值，以稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值為縱坐標(biāo)和以稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值對(duì)應(yīng)的Log[pM]為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

其中，

稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的個(gè)數(shù)為4個(gè)，表5給出了配制好的4個(gè)10x梯度稀釋的穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度范圍為0.01-10pM，拷貝數(shù)為6×10³-6×10⁶個(gè)/μl。

表5預(yù)稀釋好標(biāo)準(zhǔn)品濃度與拷貝數(shù)

qPCR的體系為總體積10μl:TransNGS Green qPCR SuperMix 5μl，引物1μl，ddH₂O 2μl，標(biāo)準(zhǔn)品2μl；稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)以及NTC(文庫(kù)稀釋液)做好平行孔(3個(gè))，根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)加DYE，采用三步法進(jìn)行qPCR。

3)待測(cè)DNA文庫(kù)濃度計(jì)算：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)的Ct值計(jì)算稀釋后的待測(cè)DNA文庫(kù)的濃度，依據(jù)文庫(kù)平均長(zhǎng)度進(jìn)行校正，進(jìn)一步根據(jù)文庫(kù)稀釋度獲得待測(cè)DNA文庫(kù)濃度。

實(shí)驗(yàn)例1

按照實(shí)施例1方法比較同一濃度的5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品(表1)的Ct值，倍數(shù)換算結(jié)果見(jiàn)表6，從表中可以看出，使用M3(50％)作比較，各標(biāo)準(zhǔn)品之間差異明顯，特別是M1(25％)與M5(75％)，跟M3相比超過(guò)了2倍，這表明不充分考慮不同文庫(kù)的GC含量的影響，只是單一的標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)計(jì)將嚴(yán)重影響文庫(kù)的準(zhǔn)確定量，低估或高估的文庫(kù)定量都會(huì)影響測(cè)序質(zhì)量與效果。如果定量富含GC/AT的文庫(kù)，單一的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致定量結(jié)果偏低，而過(guò)低估計(jì)文庫(kù)的大小，容易導(dǎo)致clusters或多、重模板太多，數(shù)據(jù)質(zhì)量不高或者測(cè)序失敗，因此很有必要設(shè)計(jì)多個(gè)不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品。

表6同一濃度的5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值與定量差異對(duì)比

實(shí)驗(yàn)例2

按照實(shí)施例1方法比較同一濃度的5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線與熔解曲線，如圖3與4所示，從圖中可以看出：同一濃度的5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線與熔解曲線都不同，GC含量越高，Tm值也越高，因此，其標(biāo)準(zhǔn)曲線也會(huì)不一樣。

實(shí)驗(yàn)例3

按照實(shí)施例1方法繪制表1中50％GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線(詳見(jiàn)圖5和6)，數(shù)據(jù)顯示相鄰一組標(biāo)準(zhǔn)品之間的ΔCt值在3.2-3.5之間，擴(kuò)增效率為98.8％，R²值為0.996。

實(shí)驗(yàn)例4

用TE作為稀釋液代替實(shí)施例1所用的文庫(kù)稀釋液，其他同實(shí)施例1，分別按照表3的濃度梯度稀釋6個(gè)M3(50％)的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行qPCR，分別獲得Ct值(表7)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示使用文庫(kù)稀釋液，相鄰標(biāo)準(zhǔn)品之間的ΔCt值在3.2-3.5之間，擴(kuò)增效率為99.7％，斜率為-3.35，R²值為0.995，而使用TE稀釋液，相鄰標(biāo)準(zhǔn)品之間的ΔCt值遠(yuǎn)超出了3.2-3.5這個(gè)范圍，其斜率為-3.82，擴(kuò)增效率只有82.2％，不符合90％-110％的標(biāo)準(zhǔn)，因此，本發(fā)明方法的文庫(kù)稀釋液要明顯優(yōu)于TE稀釋液，能有效提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表7文庫(kù)稀釋液與TE預(yù)稀釋的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的qPCR結(jié)果

實(shí)驗(yàn)例5

使用文庫(kù)稀釋液，把構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行10x梯度稀釋，取稀釋了10³-10⁸倍的文庫(kù)(L1-L6)，按照實(shí)施例1方法制定這個(gè)文庫(kù)擴(kuò)增曲線，如圖7所示，從圖中可以看出相鄰一組文庫(kù)稀釋品之間的ΔCt值在3.2-3.5之間，擴(kuò)增效率為97.6％，R²值為0.992，而使用TE進(jìn)行文庫(kù)梯度稀釋，獲得的曲線沒(méi)有達(dá)到擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)。

實(shí)驗(yàn)例6

分別以超聲打斷的250ng人類和大腸桿菌基因組DNA作為模板，用文庫(kù)構(gòu)建試劑盒制備了兩個(gè)連接有P5/P7接頭的DNA文庫(kù)L1和L2，進(jìn)行高保證擴(kuò)增(8個(gè)循環(huán))，使用磁珠DNA分選試劑盒對(duì)文庫(kù)進(jìn)行片段篩選(400-600bp)，用安捷倫高靈敏度DNA分析試劑盒分析擴(kuò)增的DNA片段，獲得到這2個(gè)文庫(kù)的平均的片段大小和大致質(zhì)量濃度(詳見(jiàn)表8)。

每個(gè)文庫(kù)使用文庫(kù)稀釋液進(jìn)行10倍梯度稀釋到10000倍，然后再稀釋2倍。因?yàn)槿说幕蚪MGC含量大致為41％，因此選擇37.5％的標(biāo)準(zhǔn)品M2，而大腸桿菌基因組DNA的GC含量為50％左右，選擇50％的標(biāo)準(zhǔn)品M3，按照實(shí)施例1方法進(jìn)行qPCR文庫(kù)定量，所有梯度稀釋后的DNA標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋過(guò)后的文庫(kù)都要進(jìn)行3個(gè)重復(fù)，NTC同樣需要重復(fù)3個(gè)，文庫(kù)定量數(shù)據(jù)分析詳見(jiàn)表8。

表8文庫(kù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)例7

分別使用天藍(lán)色鏈霉菌(基因組GC含量約72％)與擬南芥(基因組GC含量約36％)的基因組構(gòu)建二代測(cè)序文庫(kù)，按照實(shí)驗(yàn)例7把構(gòu)建好的文庫(kù)進(jìn)行10x梯度稀釋，稀釋到10000x和20000x后，按照實(shí)施例1方法分別以5個(gè)不同GC含量的標(biāo)準(zhǔn)品(表1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行文庫(kù)定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示，詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)表9，結(jié)果都滿足對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的要求。分別以這5條標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算天藍(lán)色鏈霉菌(圖9)與擬南芥(圖10)這兩個(gè)DNA文庫(kù)的濃度，數(shù)據(jù)顯示定量結(jié)果差異明顯，如果是以M3(50％)作為標(biāo)準(zhǔn)品，其定量結(jié)果明顯會(huì)偏小(M1,M2,M4,M5 vs M3統(tǒng)計(jì)分析，p值都小于0.001，n＝4)。而過(guò)低估計(jì)文庫(kù)的大小，上樣增多，容易導(dǎo)致clusters或多重模板太多，測(cè)序結(jié)果質(zhì)量不高，甚至測(cè)序失敗，造成不必要的浪費(fèi)。按照本發(fā)明專利，天藍(lán)色鏈霉菌的DNA文庫(kù)應(yīng)該選擇GC含量為75％的標(biāo)準(zhǔn)品(M5)，而擬南芥則選擇GC含量為37.5％的標(biāo)準(zhǔn)品(M2)進(jìn)行qPCR文庫(kù)定量最為合適，文庫(kù)定量結(jié)果會(huì)更加精確，獲取更高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果。

表9 5個(gè)不同GC含量DNA標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)對(duì)比

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。