本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域的組合物和多重PCR方法，具體涉及一種能同時(shí)鑒定豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌的組合物和多重PCR方法。

背景技術(shù)：

研究表明，豬呼吸道疾病是由一種或多種細(xì)菌、病毒混合感染引起的疾病。通常由病毒或支原體首先侵襲呼吸道，破壞防御屏障，各種氣源性病菌如多殺性巴氏桿菌以及副豬嗜血桿菌等進(jìn)入呼吸道和肺部而造成繼發(fā)或混合感染。豬多殺性巴氏桿菌屬革蘭氏陰性菌，主要導(dǎo)致豬的出急性血性敗血癥、豬肺疫和萎縮性鼻炎，常與其他病毒和細(xì)菌呈混合感染或者繼發(fā)感染。

而副豬嗜血桿菌則是一種革蘭氏陰性菌，能夠引起豬纖維性漿膜炎、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎等，且常與豬呼吸道疾病有關(guān)。副豬嗜血桿菌目前對(duì)其的分離鑒定要比養(yǎng)殖場(chǎng)實(shí)際感染率少20％以上，其通常多殺性巴氏桿菌、豬繁殖與呼吸病毒等病原混合感染，由于其培養(yǎng)條件苛刻，限制了對(duì)其的研究。

豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌是豬呼吸道常見(jiàn)的重要致病菌，引起的臨床癥狀很難區(qū)分。對(duì)豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的鑒定多采用形態(tài)觀(guān)察、生理生化鑒定及其免疫學(xué)鑒定等傳統(tǒng)的方法，這些方法耗時(shí)耗力且準(zhǔn)確度差，因此僅僅依靠常規(guī)檢驗(yàn)方法和臨床經(jīng)驗(yàn)很難對(duì)病原進(jìn)行判斷，進(jìn)而會(huì)貽誤動(dòng)物疫病的防控的最佳時(shí)機(jī)；因此，建立一種準(zhǔn)確快速的鑒定豬上述呼吸道兩種常見(jiàn)病原體方法十分必要。

多重PCR(multiplex PCR)是在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)特異性引物，針對(duì)多個(gè)DNA模板或同一模板的不同區(qū)域擴(kuò)增多個(gè)目的片段的PCR技術(shù)。其可在同一PCR反應(yīng)體系中同時(shí)加入多種病原微生物的特異性引物，在同一條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可用于同時(shí)鑒定多種病原體或鑒定出是哪一型病原體感染。

因此，開(kāi)發(fā)一種通過(guò)多重PCR鑒定豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌方法，已經(jīng)成為本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌均是豬場(chǎng)PRDC的常見(jiàn)重要病原體，且往往是混合感染，而傳統(tǒng)的診斷技術(shù)如細(xì)菌分離、免疫學(xué)試驗(yàn)等費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不適于臨床快速診斷，也不適于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查的現(xiàn)狀。

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種直接從樣品中一次鑒定豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的組合物以及多重PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單易行，鑒定快速，準(zhǔn)確程度高。

本發(fā)明解決所述技術(shù)問(wèn)題的主要發(fā)明構(gòu)思如下：

本發(fā)明為了解決通過(guò)一次檢測(cè)就可以檢出樣品中兩種病原體的技術(shù)問(wèn)題，首先從已發(fā)表的文獻(xiàn)中分別篩選出具有豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌兩種病原體基因型特點(diǎn)的保守性基因片段，針對(duì)這些基因靶點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增這些靶點(diǎn)基因的引物，將多對(duì)引物放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系，通過(guò)各項(xiàng)參數(shù)調(diào)整優(yōu)化，建立直接從樣品中一次檢測(cè)兩種病原體的兩套互為補(bǔ)充鑒定的多重PCR檢測(cè)方法；本發(fā)明還進(jìn)一步優(yōu)化了病原培養(yǎng)方法，通過(guò)縮短培養(yǎng)時(shí)間，進(jìn)一步達(dá)到利用該多重PCR方法快速檢測(cè)實(shí)際樣品的目的。

具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。

一種鑒定豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌的組合物，所述組合物至少包含如下兩組引物對(duì)；其中一組引物對(duì)選自由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)組成的引物對(duì)組中的至少一組引物對(duì)；另一組引物對(duì)選自由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)組成的引物對(duì)組中的至少一組引物對(duì)。

其中，所述組合物包含如下五組引物對(duì)：序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)。

其中，所述組合物用于同時(shí)鑒定豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌。

本發(fā)明還提供一種含有所述組合物的試劑盒。

進(jìn)一步，該試劑盒還包括說(shuō)明書(shū)。

一種同時(shí)鑒定豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的多重PCR方法，所述方法包括如下步驟：

(1)篩選具有豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的至少兩個(gè)高保守性基因片段，作為PCR檢測(cè)的靶點(diǎn)基因，分別設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增上述靶點(diǎn)基因的引物，所述引物至少包含如下兩組引物對(duì)；其中一組引物對(duì)選自由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)組成的引物對(duì)組中的至少一組引物對(duì)；另一組引物對(duì)選自由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)組成的引物對(duì)組中的至少一組引物對(duì)；

(2)將步驟(1)的引物對(duì)放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，擴(kuò)增靶點(diǎn)基因；以及

(3)鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

其中，在步驟(1)中，豬多殺性巴氏桿菌的保守性基因片段為KMT1基因、16s rRNA，副豬嗜血桿菌pila基因、16s rRNA和lipo基因。

其中，在步驟(2)中采用兩個(gè)PCR反應(yīng)體系；優(yōu)選所述兩個(gè)PCR反應(yīng)體系的退火溫度分別為55℃和58℃。

其中，步驟(2)所述兩個(gè)PCR反應(yīng)體系分別如下：PCR反應(yīng)體系1：DNA模板10μl，副豬嗜血桿菌16s rRNA和豬多殺性巴氏桿菌16s rRNA上、下游引物分別為各1.2μl和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至55μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，55℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；PCR反應(yīng)體系2：DNA模板12μl，副豬嗜血桿菌pila，LIPO，豬多殺性巴氏桿菌KMT1多套上、下游引物分別為各0.96μl，0.64μ和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至60μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，58℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。

一種通過(guò)所述組合物，所述試劑盒，所述PCR方法對(duì)樣品進(jìn)行鑒定的方法，所述方法包括如下步驟：將待測(cè)樣品直接接種在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h后，取菌液98℃加熱10min提取病原體DNA樣品，作為模板，按照權(quán)利要求6-9任一項(xiàng)所述方法進(jìn)行多重PCR，得到擴(kuò)增結(jié)果后確認(rèn)是否含有豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌；優(yōu)選在反應(yīng)體系1中，通過(guò)815bp的條帶鑒定副豬嗜血桿菌，通過(guò)305bp的條帶鑒定豬多殺性巴氏桿菌，在反應(yīng)體系2中，通過(guò)288bp或231bp的條帶鑒定副豬嗜血桿菌，通過(guò)588bp的條帶鑒定豬多殺性巴氏桿菌。如果采用PCR反應(yīng)體系1對(duì)病原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)815bp的條帶，說(shuō)明感染了副豬嗜血桿菌，發(fā)現(xiàn)305bp的條帶則說(shuō)明感染了豬多殺性巴氏桿菌，如果815bp和305bp的條帶都存在則表明存在兩種病原的混合感染現(xiàn)象；如果采用PCR反應(yīng)體系2對(duì)病原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)288bp或231bp的條帶，說(shuō)明感染了副豬嗜血桿菌，發(fā)現(xiàn)588bp的條帶則說(shuō)明感染了豬多殺性巴氏桿菌，如果288bp和588bp或231bp和588bp的條帶都存在則表明存在兩種病原的混合感染現(xiàn)象；反之，如果上述電泳條帶都沒(méi)發(fā)現(xiàn)則表明該樣本中無(wú)感染現(xiàn)象。PCR體系1和PCR體系2的結(jié)果互相補(bǔ)充，2個(gè)反應(yīng)體系鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性的樣本，準(zhǔn)確程度高。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種同時(shí)鑒定豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的多重PCR方法，具體步驟如下：

(1)篩選具有豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌兩個(gè)病原體基因型特點(diǎn)的保守性基因片段，作為PCR鑒定的基因靶點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增上述靶點(diǎn)基因的引物；

(2)將多對(duì)引物放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，擴(kuò)增靶點(diǎn)基因；

(3)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳鑒定鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；其中：

擴(kuò)增豬多殺性巴氏桿菌的上游引物1的序列如序列1所示；下游引物1的序列如序列2所示，上游引物2的序列如序列3所示；下游引物2的序列如序列4所示；擴(kuò)增副豬嗜血桿菌的上游引物1的序列如序列5所示；下游引物1的序列如序列6所示,上游引物2的序列如序列7所示；下游引物2的序列如序列8所示,上游引物3的序列如序列9所示；下游引物3的序列如序列10所示，相關(guān)的具體信息見(jiàn)下表1。

表1病原引物相關(guān)信息

其中，在本發(fā)明的步驟(1)中，由于對(duì)引物的退火溫度，片段長(zhǎng)度等要求，最終選定的結(jié)果是豬多殺性巴氏桿菌(PM)的KMT1基因、16s rRNA，副豬嗜血桿菌pila基因、16s rRNA和LIPO基因。

其中，在步驟(2)中，PCR反應(yīng)體系1如下：DNA模板10μl，副豬嗜血桿菌和豬多殺性巴氏桿菌16s rRNA上、下游引物分別為各1.2μl和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至55μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，55℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；PCR反應(yīng)體系2如下：DNA模板12μl，pila，LIPO，KMT1多套上、下游引物分別為各0.96μl，0.64μ和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至60μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，58℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；

其中，對(duì)實(shí)際待檢測(cè)樣品前處理時(shí)，選擇豬多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌都適宜的TSB改良培養(yǎng)基(胰蛋白大豆肉湯30g，加水940ml，121度高壓滅菌15分鐘，冷卻后加50ml小牛血清和10ml過(guò)濾除菌的0.01％NAD(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)，將現(xiàn)場(chǎng)采到組織樣品直接接種在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h后，取菌液98℃加熱10min提取病原體DNA樣品，作為模板，進(jìn)行多重PCR方法。而常規(guī)的樣品前處理則是先將組織樣品在TSA固體平板上劃線(xiàn)，一般要等24小時(shí)后才能長(zhǎng)出菌落，然后將長(zhǎng)出菌落再接種TSB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)后取菌液作為提取被檢病原體DNA樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。因此本發(fā)明較常規(guī)方法縮短了28小時(shí)的檢測(cè)時(shí)間，能進(jìn)一步達(dá)到快速檢測(cè)實(shí)際樣品的目的。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

(1)較常規(guī)的PCR檢測(cè)方法，本發(fā)明的多重PCR檢測(cè)方法具有重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確程度高、快速的特點(diǎn)，提高了檢測(cè)效率。

(2)該方法體系既可以準(zhǔn)確檢測(cè)病原體，還可以對(duì)混合感染狀況進(jìn)行分析。

附圖說(shuō)明：

圖1：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌多重PCR體系1退火溫度優(yōu)化結(jié)果；

其中：M：DNA 100bp ladder；泳道1：58℃；泳道2：57.5℃；泳道3：57℃；泳道4：56.5℃；泳道5：56℃；泳道6：51℃；

圖2：副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌多重PCR體系1特異性檢測(cè)結(jié)果；

其中：M：DNA 100bp ladder；泳道1：嗜熱脂肪土芽孢桿菌；泳道2：大腸桿菌；泳道3：沙門(mén)氏菌；泳道4：副豬嗜血桿菌；泳道5：副豬嗜血桿菌；泳道6：多殺巴氏桿菌；泳道7：副豬嗜血桿菌和多殺性巴氏桿菌；泳道8：副豬嗜血桿菌和多殺性巴氏桿菌。

圖3：副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌多重PCR體系1樣品檢測(cè)結(jié)果；

其中：M：DNA 100bp ladder；泳道1：陰性樣品1；泳道2：副豬嗜血桿菌感染樣品2；泳道3：副豬嗜血桿菌感染樣品3；泳道4：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品4；泳道5：豬多殺性巴氏桿菌感染樣品5；泳道6：豬多殺性巴氏桿菌感染樣品6；泳道7：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品7；泳道8：副豬嗜血桿菌感染樣品8；泳道9：豬多殺性巴氏桿菌9；泳道10：豬多殺性巴氏桿菌感染樣品10；泳道11：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品11；泳道12：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品12；泳道13：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品13；。

圖4：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌多重PCR體系2退火溫度優(yōu)化結(jié)果；

其中：M：DNA 100bp ladder；泳道1：55℃；泳道2：54.5℃；泳道3：54℃；泳道4：53.5℃；泳道5：53℃；泳道6：52.5℃；泳道7：52℃；泳道8：51.5℃。

圖5：副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌多重PCR體系2特異性檢測(cè)結(jié)果；

其中：M：DNA 100bp ladder；泳道1、2：嗜熱脂肪土芽孢桿菌；泳道3、4：副豬嗜血桿菌；泳道5、6：多殺巴氏桿菌；泳道7、8：雙重PCR。

圖6：副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌多重PCR體系2樣品檢測(cè)結(jié)果；

其中：M：DNA 100bp ladder；泳道1-13：副豬嗜血桿菌感染樣品1；泳道2：副豬嗜血桿菌感染樣品2；泳道3：副豬嗜血桿菌感染樣品3；泳道4：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品4；泳道5：副豬嗜血桿菌感染樣品4；泳道6：豬多殺性巴氏桿菌感染樣品6；泳道7：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品7；泳道8：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品8；泳道9：副豬嗜血桿菌感染樣品9；泳道10：豬多殺性巴氏桿菌感染樣品10；泳道11：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品11；泳道12：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品12；泳道13：副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌感染樣品13；。

具體實(shí)施方式

為了充分說(shuō)明本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題所實(shí)施使用的技術(shù)方案。下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明,但本發(fā)明的技術(shù)方案、技術(shù)方案的實(shí)施方式以及保護(hù)范圍并不僅僅限于此。

在一種具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種鑒定豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌的組合物，所述組合物至少包含如下兩組引物對(duì)；其中一組引物對(duì)選自由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)組成的引物對(duì)組中的至少一組引物對(duì)；另一組引物對(duì)選自由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)組成的引物對(duì)組中的至少一組引物對(duì)。

通過(guò)上述表述可以看出，本發(fā)明可以通過(guò)只選擇每個(gè)病原體中的一組引物對(duì)進(jìn)行鑒定，也可以選擇多組引物對(duì)進(jìn)行鑒定，這樣有利于針對(duì)不同的樣品來(lái)源選擇合適的樣品，同時(shí)還可以基于上述組合，制備適合不同場(chǎng)合應(yīng)用的試劑盒，當(dāng)然地，當(dāng)同時(shí)使用五組序列進(jìn)行測(cè)定時(shí)，增加測(cè)定的準(zhǔn)確度和假陽(yáng)性率。

優(yōu)選地，本發(fā)明的鑒定豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌的組合物含如下五組引物對(duì)：序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)。

上述組合物可以做成任何用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的工具，包括但不限于試劑盒等，優(yōu)選所述的試劑盒進(jìn)一步包含說(shuō)明書(shū)以及必要試劑和工具等。進(jìn)一步地，可以含有用于定量的相關(guān)工具如熒光參比試劑等。

本發(fā)明還提供一種通過(guò)所述引物對(duì)同時(shí)鑒定豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的多重PCR方法，具體包括如下步驟：(1)篩選具有豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的至少兩個(gè)高保守性基因片段，作為PCR鑒定的靶點(diǎn)基因，分別設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增上述靶點(diǎn)基因的引物，其中所述引物至少包含如下兩組引物對(duì)；其中一組引物對(duì)選自由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)組成的引物對(duì)組中的至少一組引物對(duì)；另一組引物對(duì)選自由序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)，和序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的PCR引物對(duì)組成的引物對(duì)組中的至少一組引物對(duì)；之后將步驟(1)的引物對(duì)放在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中，擴(kuò)增靶點(diǎn)基因；以及鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

在該P(yáng)CR過(guò)程中，選擇合適的引物是十分關(guān)鍵的，本發(fā)明通過(guò)選擇所述的引物對(duì)達(dá)到了準(zhǔn)確特異性地測(cè)定所述病原菌的目的。

在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，所述步驟(2)中采用兩個(gè)PCR反應(yīng)體系；優(yōu)選所述兩個(gè)PCR反應(yīng)體系的退火溫度分別為55℃和58℃。這是通過(guò)多次試驗(yàn)證明的結(jié)果，在最終確定的最適退火溫度下，瓊脂糖電泳圖譜上的條帶清晰，無(wú)非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，有利于操作者很容易速的判斷鑒定結(jié)果，真正達(dá)到了實(shí)時(shí)快速監(jiān)測(cè)。

在一種優(yōu)選的具體實(shí)施方式中，兩個(gè)PCR反應(yīng)體系分別如下：PCR反應(yīng)體系1：DNA模板10μl，副豬嗜血桿菌和豬多殺性巴氏桿菌16s rRNA上、下游引物分別為各1.2μl和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至55μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，55℃退火1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；優(yōu)選PCR反應(yīng)體系2：DNA模板12μl，pila，LIPO，KMT1多套上、下游引物分別為各0.96μl，0.64μ和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至60μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，58℃退火1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min。

上述兩個(gè)體系單獨(dú)均能進(jìn)行鑒定，本發(fā)明將兩體系結(jié)合，達(dá)到結(jié)果互相補(bǔ)充，兩個(gè)反應(yīng)體系鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性的樣本，準(zhǔn)確程度高。PCR反應(yīng)體系中適用PCR Mix簡(jiǎn)化了PCR過(guò)程，增強(qiáng)鑒定過(guò)程的重復(fù)性和規(guī)范性。

在本發(fā)明優(yōu)選的一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供對(duì)樣品鑒定前的產(chǎn)品的處理方法，其將待測(cè)樣品直接接種在TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h后，取菌液98℃加熱10min提取病原體DNA樣品，作為模板，進(jìn)行多重PCR，得到擴(kuò)增結(jié)果后確認(rèn)是否含有豬多殺性巴氏桿菌和/或副豬嗜血桿菌，如果采用PCR反應(yīng)體系1對(duì)病原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)815bp的條帶，說(shuō)明感染了副豬嗜血桿菌，發(fā)現(xiàn)305bp的條帶則說(shuō)明感染了豬多殺性巴氏桿菌，如果815bp和305bp的條帶都存在則表明存在兩種病原的混合感染現(xiàn)象；如果采用PCR反應(yīng)體系2對(duì)病原體DNA進(jìn)行擴(kuò)增后，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳圖譜中發(fā)現(xiàn)288bp或231bp的條帶，說(shuō)明感染了副豬嗜血桿菌，發(fā)現(xiàn)588bp的條帶則說(shuō)明感染了豬多殺性巴氏桿菌，如果288bp和588bp或231bp和588bp的條帶都存在則表明存在兩種病原的混合感染現(xiàn)象；反之，如果上述電泳條帶都沒(méi)發(fā)現(xiàn)則表明該樣本中無(wú)感染現(xiàn)象。PCR體系1和PCR體系2的結(jié)果互相補(bǔ)充，2個(gè)反應(yīng)體系鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性的樣本，準(zhǔn)確程度高。

實(shí)施例

下面對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的測(cè)定方法以及材料來(lái)源進(jìn)行說(shuō)明。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照試劑制造廠(chǎng)商所建議的條件。

實(shí)施例1多重PCR方法退火溫度優(yōu)化

1.樣品前處理

將養(yǎng)豬場(chǎng)送檢豬肺組織樣品置于TSB改良液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)8小時(shí)后取菌液作為提取病原體DNA樣品。

2.細(xì)菌DNA提取

本發(fā)明采用常規(guī)DNA提取方法，步驟如下：

2.1取菌液1mL98℃加熱10min提取病原體DNA樣品，作為模板。

3.多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系建立

在PCR反應(yīng)體系，特別是多重PCR反應(yīng)體系中，退火溫度是一個(gè)關(guān)鍵因素。本發(fā)明為兩套多重PCR體系選擇了適合多對(duì)引物的退火溫度，多重PCR反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)體系1如下：DNA模板10μl，副豬嗜血桿菌和豬多殺性巴氏桿菌16s rRNA上、下游引物(即序列1和2、5和6)分別為各1.2μl和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至55μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，55℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；

PCR反應(yīng)體系2如下：DNA模板12μl，pila，LIPO，KMT1多套上、下游引物(即序列3和4、7和8、9和10)分別為各0.96μl，0.64μ和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至60μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，58℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；

4結(jié)果

圖1和圖4為副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌多重PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果，設(shè)置退火溫度進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示多重PCR反應(yīng)體系1和反應(yīng)體系2分別在退火溫度55℃和58℃時(shí)能更好的擴(kuò)增出預(yù)期的條帶。

實(shí)施例2：多重PCR方法體系特異性驗(yàn)證

特異性是PCR反應(yīng)體系又一個(gè)關(guān)鍵的因素。本發(fā)明為了確保所建立的多重PCR體系的特異性，利用大腸桿菌等作為對(duì)照，驗(yàn)證該體系的特異性，以體系只能擴(kuò)增出豬多殺性巴氏桿菌或副豬嗜血桿菌目的基因片段，而對(duì)照組不能擴(kuò)增出片段為特異性合格。

1.樣品前處理

取大腸桿菌等菌株作為對(duì)照PCR模板；將實(shí)驗(yàn)室保存的副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌在TSB改良培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，37℃培養(yǎng)24h后挑取單菌落接種于TSB培養(yǎng)基中。

2.細(xì)菌DNA提取

方法同實(shí)施例1。

3.多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系建立

多重PCR反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)體系1如下：DNA模板10μl，副豬嗜血桿菌和豬多殺性巴氏桿菌16S rRNA上、下游引物分別為各1.2μl和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至55μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，55℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；

PCR反應(yīng)體系2如下：DNA模板12μl，pila，LIPO，KMT1多套上、下游引物分別為各0.96μl，0.64μ和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至60μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，58℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；PCR結(jié)束后，取8μl產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳分析。

4.結(jié)果

副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌多重PCR特異性鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2和圖5?？梢?jiàn)該多重PCR體系只能檢出副豬嗜血桿菌、豬多殺性巴氏桿菌單獨(dú)或混合感染，特異性強(qiáng)。

實(shí)施例3多重PCR方法檢測(cè)實(shí)際樣品中豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌

1.樣品前處理

選擇豬多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌都比較適宜的TSB改良培養(yǎng)基，將面拭子采集感染豬多殺性巴氏桿菌或副豬嗜血桿菌或未感染的上述兩種病原菌的豬肺部滲出液，無(wú)菌操作直接接種在TSB改良液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8h后，取菌液提取豬被檢病原體DNA樣品，作為模板，進(jìn)行多重PCR檢測(cè)。

2.細(xì)菌DNA提取

方法同實(shí)施例1。

3.多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)

多重PCR反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)體系1如下：DNA模板10μl，副豬嗜血桿菌和豬多殺性巴氏桿菌16S rRNA上、下游引物分別為各1.2μl和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至55μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，55℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；PCR反應(yīng)體系2如下：DNA模板12μl，pila，LIPO，KMT1多套上、下游引物分別為各0.96μl，0.64μ和0.8μl，PCR Mix30μl，超純水補(bǔ)充至60μl；PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min，進(jìn)入94℃60s，58℃1min和72℃1min的循環(huán)，循環(huán)30次，最后72℃延伸10min；PCR結(jié)束后，取8μl產(chǎn)物作瓊脂糖凝膠電泳分析。

4結(jié)果

副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌多重PCR樣品鑒定結(jié)果如圖3和圖6所示。由結(jié)果看出，該多重PCR鑒定體系可以直接檢出組織樣品中單獨(dú)感染的巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌的單獨(dú)及混合感染。