專利名稱：從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物疫苗制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖 并制作脂多糖疫苗的方法。
背景技術(shù)：
禽多殺性巴氏桿菌病是由禽多殺性巴氏桿菌引起的家禽接觸性傳染病，呈世界分 布，在我國也是常見的多發(fā)性傳染病，幾乎所有的家禽都能感染該病，其傳染流行嚴(yán)重影響 著家禽業(yè)的健康發(fā)展。目前我國對于禽多殺性巴氏桿菌病的預(yù)防和治療主要采用的是藥物治療，如抗生 素等，但一旦停藥后容易復(fù)發(fā)，且長期用藥容易誘導(dǎo)禽多殺性巴氏桿菌產(chǎn)生耐藥性，還可能 產(chǎn)生副作用，比如會引起產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率的下降。因此，為了更加有效地預(yù)防禽多殺性巴氏桿 菌病的流行，需要用有效的疫苗進(jìn)行免疫。禽多殺性巴氏桿菌病的常規(guī)疫苗主要有弱毒活疫苗和滅活疫苗兩種，但是弱毒活 疫苗存在一定的缺點(diǎn)，比如免疫持續(xù)期比較短、保護(hù)效果偏低、副作用偏大，應(yīng)用不當(dāng)時會 引起免疫失敗，甚至?xí)斐梢恍┘仪莸乃劳觥６鴾缁钜呙缭跍缁钸^程中可能造成某些抗原物質(zhì)的丟失，只能對同血清型的菌株 感染有一定的免疫效果，且保護(hù)效果和免疫持續(xù)期還不如弱毒活疫苗更好。脂多糖是禽多殺性巴氏桿菌內(nèi)毒素的物質(zhì)基礎(chǔ)，在禽多殺性巴氏桿菌崩裂時釋放 出來，是很強(qiáng)的發(fā)熱原。目前人們普遍認(rèn)為脂多糖在禽多殺性巴氏桿菌的致病過程中起著 重要的作用。研究表明禽多殺性巴氏桿菌的脂多糖在對嗜中性粒細(xì)胞的黏附中起著輔助作 用。從血清型為B:2的禽多殺性巴氏桿菌菌株中分離到的脂多糖能夠引起動物產(chǎn)生出血性 敗血癥的癥狀。除了具有致病性外，禽多殺性巴氏桿菌的脂多糖還能夠誘發(fā)體液免疫應(yīng)答， 因此被認(rèn)為是一種保護(hù)性抗原。截止目前，從禽多殺性巴氏桿菌中提取脂多糖并制作禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫 苗的方法還未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多 糖疫苗的方法，該方法先從禽多殺性巴氏桿菌中提取脂多糖，然后將提取的脂多糖溶液與 弗氏完全佐劑按照1 1.5的比例進(jìn)行混合制成禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫苗，經(jīng)動物 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表明本方法制備出的禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫苗可有效地為被免疫的雞提 供抵抗禽多殺性巴氏桿菌攻擊的能力，保護(hù)率為66. 7%，能夠有效地預(yù)防家禽產(chǎn)生禽多殺性 巴氏桿菌病。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，該方法經(jīng)過①制備禽 多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液、②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體、③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進(jìn)行破碎、④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗 提脂多糖溶液、⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液、⑥用DNA酶和RNA酶來酶解脂 多糖濃縮液中的DNA和RNA、⑦制備純化的脂多糖和⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴 氏桿菌脂多糖疫苗共八個步驟，上述八個步驟中所述的②中涉及到離心機(jī)的離心轉(zhuǎn)速，所 述的③中涉及到超聲波的功率、輻射時間、間歇秒數(shù)和輻射次數(shù)，所述的⑤中涉及到換水次 數(shù)，所述的⑥中涉及到酶解時間，所述的⑦中涉及到用濃度為6摩爾/升NaOH來調(diào)節(jié)溶液 的PH值，所述的⑧中涉及到脂多糖溶液與弗氏完全佐劑的體積比均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段， 這些常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段中的任一項(xiàng)作為單獨(dú)實(shí)驗(yàn)條件或許是存在的，但這些常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù) 手段綜合應(yīng)用在“從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法”則是必需的。
本發(fā)明從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法所述的八個步 驟分述如下
①制備禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液
用接種環(huán)刮取一環(huán)斜面保藏的禽多殺性巴氏桿菌，將刮有一環(huán)禽多殺性巴氏桿菌的接 種環(huán)以“Z”字型劃線接種于培養(yǎng)平板上，將培養(yǎng)平板放置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)M小時，挑 取培養(yǎng)M小時后的培養(yǎng)平板上生長的一個單菌落接種于5毫升的液體培養(yǎng)基中，將該5毫 升的液體培養(yǎng)基放在37°C的搖床中以160轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩培養(yǎng)M小時，再將振蕩培養(yǎng) 的5毫升液體培養(yǎng)基全部倒入200毫升的液體培養(yǎng)基中并在37°C的搖床中以160轉(zhuǎn)/分鐘 的速度振蕩培養(yǎng)M小時制備出禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液；
②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體
將上述①制備出的禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液加入到250毫升的離心管中，將加入禽多 殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液的該250毫升離心管放在離心機(jī)上并在5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心 15分鐘，然后將離心15分鐘后的250毫升離心管中的上清液棄掉，留在該250毫升離心管 中的沉淀物就是所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體；
③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進(jìn)行破碎
在上述②中250毫升離心管所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體中加入10毫升的蒸餾水， 然后將該250毫升離心管置于超聲波破碎儀中，設(shè)置超聲波破碎儀的功率為500瓦，每超聲 波輻射20秒后停止輻射20秒為一個破碎循環(huán)過程，所有破碎循環(huán)過程共持續(xù)30分鐘，30 分鐘后該250毫升離心管中得到的就是經(jīng)超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體；
④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖溶液
從禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖分為三步，三步分述如下
第一步，提取上述③中經(jīng)超聲波破碎得到的禽多殺性巴氏桿菌菌體10毫升并加入到 50毫升離心管中，然后再向該50毫升離心管中加入10毫升其濃度為90%的苯酚，顛倒該 50毫升離心管數(shù)次使10毫升禽多殺性巴氏桿菌菌體和10毫升苯酚充分混勻，然后將充分 混勻的該50毫升離心管放置在70°C的水浴鍋中加熱并用玻璃棒快速攪拌30分鐘，30分鐘 后從水浴鍋中取出該50毫升離心管并在室溫下放置20分鐘，再將該50毫升離心管放在離 心機(jī)上并在4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心結(jié)束后將該50毫升離心管的上層溶 液吸取并加入到另一 50毫升的三角瓶中、該50毫升離心管中的中層溶液棄掉不要、最后再 向該50毫升離心管中的下層溶液中加入蒸餾水補(bǔ)足體積至10毫升待用；
第二步，向第一步中待用的該50毫升離心管中的下層溶液+蒸餾水中加入10毫升其濃度為90%的苯酚，顛倒該50毫升離心管數(shù)次使其充分混勻，充分混勻后將該50毫升離心 管放置在70°C的水浴鍋中加熱并用玻璃棒快速攪拌30分鐘，30分鐘后從水浴鍋中取出該 50毫升離心管并在室溫下放置20分鐘，再將該50毫升離心管放在離心機(jī)上并在4000轉(zhuǎn)/ 分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心結(jié)束后將該50毫升離心管的上層溶液吸取并加入到第一 步中的另一 50毫升的三角瓶中存儲、該50毫升離心管中的中層溶液棄掉不要、最后再向該 50毫升離心管中的下層溶液中加入蒸餾水補(bǔ)足體積至10毫升準(zhǔn)備再次使用；
第三步，重復(fù)第二步數(shù)次直至將另一 50毫升的三角瓶儲滿刻度為止，存儲滿50毫升的 另一 50毫升三角瓶中的所述上層溶液就是從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提 的脂多糖溶液；
⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液
將粗提的50毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中，將透析袋放在自來水流水中持續(xù) 沖洗48小時，再將透析袋放入到蒸餾水中浸泡，每6小時浸泡換一次蒸餾水共換蒸餾水8 次，然后將透析袋放入裝有聚乙二醇6000的燒杯中進(jìn)行濃縮，直到透析袋中的50毫升脂多 糖溶液被濃縮到7. 5毫升濃縮液為止，透析袋中所述
7. 5毫升濃縮液即為脂多糖濃縮液；
⑥用DNA酶和RNA酶來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA
將上述⑤中的所述7. 5毫升脂多糖濃縮液倒入10毫升的離心管中，再向該10毫升離 心管中分別加入375微克的DNA酶和RNA酶；將該10毫升離心管放在37°C水浴中放置5 小時，再將該10毫升離心管放在100°C水浴中放置10分鐘，放置10分鐘后從100°C水浴中 取出該10毫升離心管并冷卻至室溫，在室溫條件下將該10毫升離心管放在離心機(jī)上并在 3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心30分鐘后將該10毫升離心管中的上清液吸取并 倒入另一 100毫升的離心管中備用；
⑦制備純化的脂多糖
向上述⑥備用的另一 100毫升離心管中加入體積是其上述⑥所述上清液液體6倍的無 水乙醇并用6摩爾/升的NaOH調(diào)節(jié)pH值至9. 0，再將該另一 100毫升離心管在4°C時放置 12小時，然后在離心機(jī)上并在6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，離心15分鐘后將該另 一 100毫升離心管中的液體倒掉、留在該另一 100毫升離心管中的沉淀物即為所制備純化 的脂多糖；
⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗
在上述⑦另一 100毫升離心管中所制備純化的脂多糖中加入1毫升的超純水進(jìn)行溶解 并得到高濃度的脂多糖溶液，用蒽酮法測定所述脂多糖溶液的濃度，緩慢加入超純水至所 述脂多糖溶液的濃度達(dá)到0. 5毫克/毫升為止；
向上述濃度為0. 5毫克/毫升的所述脂多糖溶液中倒入50毫升燒杯中，再向該50毫 升燒杯中加入體積是所述脂多糖溶液體積1. 5倍的弗氏完全佐劑，同時在該50毫升燒杯中 放入一磁力棒并在磁力攪拌器作用下攪拌1小時，攪拌1小時后在該50毫升燒杯中的溶液 就是制作的禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗。所述培養(yǎng)平板上包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化鈉、2% 的瓊脂和少量水。所述液體培養(yǎng)基包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化鈉和少量水。
由于采用如上所述的技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下優(yōu)越性
1、本發(fā)明在用超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進(jìn)行破碎時，所用超聲波破碎儀的功率 為500瓦，每超聲波輻射20秒后停止輻射20秒為一個破碎循環(huán)過程，在這一個破碎循環(huán)過 程中，輻射20秒后由于超聲波所形成的空穴效應(yīng)，可使禽多殺性巴氏桿菌菌體破裂，停止 輻射的20秒可以使超聲波破碎儀得到修整。經(jīng)過30分鐘所有破碎循環(huán)過程后及在不損害 超聲波破碎儀的前提下可得到最大量的經(jīng)超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體。2、本發(fā)明從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖溶液時所用苯酚 濃度為90%，當(dāng)經(jīng)超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌與濃度為90%的苯酚混合并加熱至70°C 并用玻璃棒劇烈攪拌時，苯酚和脂多糖溶液形成了單一相，而冷卻后則形成了苯酚相和水 相；脂多糖大部分溶解于水相中，而大部分蛋白質(zhì)溶解于苯酚相中，不溶性物質(zhì)沉淀在兩相 交界處，經(jīng)過這種方法可以得到最大量的粗提的禽多殺性巴氏桿菌脂多糖溶液。3、本發(fā)明從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液時，將粗提的禽多殺性巴氏桿 菌脂多糖溶液全部加入到透析袋中，將透析袋放在自來水流水中持續(xù)沖洗48小時，再將透 析袋放入到蒸餾水中浸泡，每6小時浸泡換一次蒸餾水共換蒸餾水8次，然后將透析袋放入 裝有聚乙二醇6000的燒杯中進(jìn)行濃縮，這種方法可得到高濃度的禽多殺性巴氏桿菌脂多 糖溶液。4、本發(fā)明用DNA酶和RNA酶來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA時，可通過DNA 酶和RNA酶的作用使禽多殺性巴氏桿菌脂多糖濃縮液中的DNA和RNA得以酶解，以除去含 在脂多糖濃縮液中的DNA和RNA，得到更高純度的禽多殺性巴氏桿菌脂多糖溶液。5、本發(fā)明制備純化的脂多糖時，向上述⑥備用的另一 100毫升離心管中加入體積 是其上述⑥所述上清液液體6倍的無水乙醇并用6摩爾/升的NaOH調(diào)節(jié)pH值至9. 0，再將 該另一 100毫升離心管在4°C時放置12小時，用這種方法可使禽多殺性巴氏桿菌脂多糖完 全沉淀下來，得到最大量的純化的脂多糖。6、本發(fā)明將將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗時，將提取的脂 多糖溶液與弗氏完全佐劑按照1 1.5的比例進(jìn)行混合制成禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫 苗，弗氏完全佐劑含結(jié)核分枝桿菌的細(xì)胞壁成分，是一種油包水的乳濁液，可以加強(qiáng)對抗原 的抗體反應(yīng)，能夠非常有效的誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度的抗體，弗氏完全佐劑活性來自于制備的脂 多糖疫苗中免疫原的持續(xù)釋放并刺激局部免疫反應(yīng)，用這種方法制備的禽多殺性巴氏桿菌 脂多糖疫苗可增強(qiáng)免疫效果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明是一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，該方法 經(jīng)過①制備禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液、②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏 桿菌菌體、③超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體、④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌 菌體中粗提脂多糖溶液、⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液、⑥用DNA酶和RNA酶 來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA、⑦制備純化的脂多糖和⑧將純化的脂多糖制作成禽 多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗共八個步驟。本發(fā)明方法中所涉及的禽多殺性巴氏桿菌CVCC474 Uvian Pasteurella multocida CVCC474)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所儲存和提供。
上述八個步驟中所述的②中涉及到離心機(jī)的離心轉(zhuǎn)速，所述的③中涉及到超聲波 的功率、輻射時間、間歇秒數(shù)和輻射次數(shù)，所述的⑤中涉及到換水次數(shù)，所述的⑥中涉及到 酶解時間，所述的⑦中涉及到用濃度為6摩爾/升NaOH來調(diào)節(jié)溶液的pH值，所述的⑧中涉 及到脂多糖溶液與弗氏完全佐劑的體積比均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，這些常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段 中的任一項(xiàng)作為單獨(dú)實(shí)驗(yàn)條件或許是存在的，但這些常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段綜合應(yīng)用在本發(fā)明 的方法之中則是必需的。本發(fā)明的八個步驟分述如下 ①制備禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液
用接種環(huán)刮取一環(huán)斜面保藏的禽多殺性巴氏桿菌，將刮有一環(huán)禽多殺性巴氏桿菌的接 種環(huán)以“Z”字型劃線接種于培養(yǎng)平板上，將培養(yǎng)平板放置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)對小時，挑 取培養(yǎng)M小時后的培養(yǎng)平板上生長的一個單菌落接種于5毫升的液體培養(yǎng)基中，將該5毫 升的液體培養(yǎng)基放在37°C的搖床中以160轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩培養(yǎng)M小時，再將振蕩培養(yǎng) 的5毫升液體培養(yǎng)基全部倒入200毫升的液體培養(yǎng)基中并在37°C的搖床中以160轉(zhuǎn)/分鐘 的速度振蕩培養(yǎng)M小時制備出禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液。需要注意的是
所述培養(yǎng)平板上包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化鈉、2%的瓊 脂和少量水。所述液體培養(yǎng)基包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化鈉和少 量水。上述①中兩次使用的液體培養(yǎng)基相同。②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體
將上述①制備出的禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液加入到250毫升的離心管中，將加入禽多 殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液的該250毫升離心管放在離心機(jī)上并在5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心 15分鐘，然后將離心15分鐘后的250毫升離心管中的上清液棄掉，留在該250毫升離心管 中的沉淀物就是所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體，為下一步的超聲波破碎作準(zhǔn)備。③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進(jìn)行破碎
在上述②中250毫升離心管所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體中加入10毫升的蒸餾水， 10毫升的蒸餾水能將禽多殺性巴氏桿菌菌體在該250毫升離心管中懸浮起來，然后將該 250毫升離心管置于超聲波破碎儀中，設(shè)置超聲波破碎儀的功率為500瓦，每超聲波輻射20 秒后停止輻射20秒為一個破碎循環(huán)過程，所有破碎循環(huán)過程共持續(xù)30分鐘，30分鐘后該 250毫升離心管中得到的就是經(jīng)超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體，該步驟的目的是通 過超聲波破碎對禽多殺性巴氏桿菌菌體進(jìn)行裂解，使其中的脂多糖盡可能多的釋放出來。④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖溶液 從禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖分為三步，三步分述如下
第一步，提取上述③中經(jīng)超聲波破碎得到的禽多殺性巴氏桿菌菌體10毫升并加入到 50毫升離心管中，然后再向該50毫升離心管中加入10毫升其濃度為90%的苯酚，顛倒該 50毫升離心管數(shù)次(至少3次)使10毫升禽多殺性巴氏桿菌菌體和10毫升苯酚充分混勻， 然后將充分混勻的該50毫升離心管放置在70°C的水浴鍋中加熱并用玻璃棒快速攪拌30分 鐘，30分鐘后從水浴鍋中取出該50毫升離心管并在室溫下放置20分鐘，再將該50毫升離 心管放在離心機(jī)上并在4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心結(jié)束后將該50毫升離心管的上層溶液吸取并加入到另一 50毫升的三角瓶中、該50毫升離心管中的中層溶液棄掉 不要、最后再向該50毫升離心管中的下層溶液中加入蒸餾水補(bǔ)足體積至10毫升待用。第二步，向第一步中待用的該50毫升離心管中的下層溶液+蒸餾水中加入10毫 升其濃度為90%的苯酚，顛倒該50毫升離心管數(shù)次(至少3次)使其充分混勻，充分混勻后 將該50毫升離心管放置在70°C的水浴鍋中加熱并用玻璃棒快速攪拌30分鐘，30分鐘后從 水浴鍋中取出該50毫升離心管并在室溫下放置20分鐘，再將該50毫升離心管放在離心機(jī) 上并在4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心結(jié)束后將該50毫升離心管的上層溶液吸 取并加入到第一步中的另一 50毫升的三角瓶中存儲、該50毫升離心管中的中層溶液棄掉 不要、最后再向該50毫升離心管中的下層溶液中加入蒸餾水補(bǔ)足體積至10毫升準(zhǔn)備再次 使用。第三步，重復(fù)第二步數(shù)次直至將另一 50毫升的三角瓶儲滿刻度為止，存儲滿50毫 升的另一 50毫升三角瓶中的所述上層溶液就是從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中 粗提的脂多糖溶液。該步驟的第三步要不斷重復(fù)進(jìn)行直至將另一 50毫升的三角瓶儲滿刻度為止，可 以粗提更多的的脂多糖溶液，也為下一步提取脂多糖濃縮液作準(zhǔn)備。⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液
將粗提的50毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中，將透析袋放在自來水流水中持續(xù) 沖洗48小時，再將透析袋放入到蒸餾水中浸泡，每6小時浸泡換一次蒸餾水共換蒸餾水8 次，然后將透析袋放入裝有聚乙二醇6000的燒杯中進(jìn)行濃縮，直到透析袋中的50毫升脂多 糖溶液被濃縮到7. 5毫升濃縮液為止，透析袋中所述7. 5毫升濃縮液即為脂多糖濃縮液，該 步驟通過濃縮過程可以提高脂多糖的濃縮液濃度。所述脂多糖濃縮液中含有微量DNA和 RNA。⑥用DNA酶和RNA酶來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA
將上述⑤中的所述7. 5毫升脂多糖濃縮液倒入10毫升的離心管中，再向該10毫升離 心管中分別加入375微克的DNA酶和RNA酶，可使分別加入375微克的DNA酶和RNA酶在 所述7. 5毫升脂多糖濃縮液中的濃度控制在50微克/毫升左右并使所述脂多糖濃縮液中 含有的微量DNA和RNA得以酶解。將該10毫升離心管放在37°C水浴中放置5小時，再將 該10毫升離心管放在100°C水浴中放置10分鐘，放置10分鐘后從100°C水浴中取出該10 毫升離心管并冷卻至室溫，在室溫條件下將該10毫升離心管放在離心機(jī)上并在3000轉(zhuǎn)/ 分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心30分鐘后將該10毫升離心管中的上清液吸取并倒入另一 100毫升的離心管中備用。⑦制備純化的脂多糖
向上述⑥備用的另一 100毫升離心管中加入體積是其上述⑥所述上清液液體6倍的無 水乙醇并用6摩爾/升的NaOH調(diào)節(jié)pH值至9. 0，再將該另一 100毫升離心管在4°C時放置 12小時，然后在離心機(jī)上并在6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，離心15分鐘后將該另 一 100毫升離心管中的液體倒掉、留在該另一 100毫升離心管中的沉淀物即為所制備純化 的脂多糖。⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗
在上述⑦另一 100毫升離心管中所制備純化的脂多糖中加入1毫升的超純水進(jìn)行溶解并得到高濃度的脂多糖溶液，用蒽酮法測定所述脂多糖溶液的濃度，緩慢加入超純水至所 述脂多糖溶液的濃度達(dá)到0. 5毫克/毫升為止，此時另一 100毫升離心管中的所述脂多糖 溶液大約為10毫升左右。向上述濃度為0. 5毫克/毫升的所述脂多糖溶液中倒入50毫升燒杯中，再向該50 毫升燒杯中加入體積是所述脂多糖溶液體積1. 5倍的弗氏完全佐劑，同時在該50毫升燒杯 中放入一磁力棒并在磁力攪拌器作用下攪拌1小時，攪拌1小時后在該50毫升燒杯中的 溶液就是制作的禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗，所述禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗約為25 毫升，25毫升所述禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗中的脂多糖含量約為0. 2毫克/毫升。由 于實(shí)驗(yàn)的環(huán)境、條件、手段以及操作方式不同，制作的所述禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗或 ^ 25毫升，或<25毫升，所述的25毫升并非是確定值，僅供參考而已。本發(fā)明八個步驟中所使用的接種環(huán)、培養(yǎng)平板、培養(yǎng)箱、搖床、離心機(jī)、超聲波破碎 儀、水浴鍋、透析袋、燒杯、三角瓶、磁力棒、玻璃棒等均為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室普通實(shí)驗(yàn)儀器及材 料，均可在生物工程公司購買到。本發(fā)明八個步驟中所使用的胰蛋白胨、大豆蛋白胨、蒸餾水、苯酚、聚乙二醇6000、 DNA酶、RNA酶、無水乙醇、NaOH、超純水、蒽酮、硫酸、弗氏完全佐劑等為生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室普通 試劑，均能在化學(xué)試劑公司或生物工程公司購買到。本發(fā)明所使用的胰蛋白胨，大豆蛋白胨，苯酚，聚乙二醇6000，氫氧化鈉，無水乙 醇，DNA酶，RNA酶，弗氏完全佐劑，蒽酮，硫酸，透析袋等均能在化學(xué)試劑公司或生物工程公 司購買到。有關(guān)從禽多殺性巴氏桿菌中提取脂多糖并制作禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗的 免疫預(yù)防效果參考如下
動物免疫實(shí)驗(yàn)和動物攻毒實(shí)驗(yàn)的限定條件是禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗中的脂多 糖含量為0.2毫克/毫升。1、動物免疫實(shí)驗(yàn)
動物免疫實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)物為雞，取30只1日齡的未經(jīng)過免疫的雞進(jìn)行飼養(yǎng)，等30只 雞長到4周齡時將它們隨機(jī)分為兩組，每組15只雞，其中的一組中所有的15只雞均免疫本 發(fā)明制備的禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫苗，將這一組自定義為脂多糖免疫組，該免疫組 的雞均免疫三次，第一次免疫的時間為4周齡時，第二次免疫的時間為6周齡時，第三次免 疫的時間為8周齡時，每次免疫的劑量均為1毫升/每只雞，免疫方式為皮下注射，另外一 組的15只雞不進(jìn)行任何免疫，只是與脂多糖免疫組的雞在相同的條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，將這一 組自定義為非免疫組。2、動物攻毒實(shí)驗(yàn)
本實(shí)驗(yàn)的目的是為了檢測本發(fā)明制備禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫苗能否給雞提供 抵抗禽多殺性巴氏桿菌攻擊的能力，具體操作方法如下
用禽多殺性巴氏桿菌CVCC474菌株對上述脂多糖疫苗免疫組和非免疫組中的所有的 雞都進(jìn)行肌肉注射攻毒，攻毒時的劑量為1 X IO4個禽多殺性巴氏桿菌CVCC474/只雞，攻毒 之后對脂多糖免疫組和非免疫組中的所有的雞繼續(xù)飼養(yǎng)2周，記錄2周后兩組中仍然存活 的雞的數(shù)目，并計算出兩組的保護(hù)率，保護(hù)率越高說明免疫預(yù)防效果越好，兩組的保護(hù)率的 計算方法如下(攻毒2周后仍然存活的雞的數(shù)量+15) X 100%
結(jié)果如表1所示，在攻毒2周后脂多糖免疫組的雞仍然有10只存活，說明禽多殺性巴 氏桿菌病脂多糖疫苗的保護(hù)率為66. 7%，非免疫組的雞在攻毒2周后已經(jīng)全部死亡，說明非 免疫組的保護(hù)率為0%。上述結(jié)果表明利用本發(fā)明制備出的禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫苗給雞進(jìn)行三 次免疫之后能使被免疫雞有效地預(yù)防禽多殺性巴氏桿菌病。表1攻毒兩周后仍存活的雞的數(shù)量及保護(hù)
權(quán)利要求
1. 一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，該方法經(jīng)過①制備 禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液、②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體、 ③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進(jìn)行破碎、④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中 粗提脂多糖溶液、⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液、⑥用DNA酶和RNA酶來酶解 脂多糖濃縮液中的DNA和RNA、⑦制備純化的脂多糖和⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性 巴氏桿菌脂多糖疫苗共八個步驟，上述八個步驟中所述的②中涉及到離心機(jī)的離心轉(zhuǎn)速， 所述的③中涉及到超聲波的功率、輻射時間、間歇秒數(shù)和輻射次數(shù)，所述的⑤中涉及到換水 次數(shù)，所述的⑥中涉及到酶解時間，所述的⑦中涉及到用濃度為6摩爾/升NaOH來調(diào)節(jié)溶 液的PH值，所述的⑧中涉及到脂多糖溶液與弗氏完全佐劑的體積比均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手 段，這些常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段中的任一項(xiàng)作為單獨(dú)實(shí)驗(yàn)條件或許是存在的，但這些常規(guī)實(shí)驗(yàn) 技術(shù)手段綜合應(yīng)用在“從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法”則是必 需的；其特征是所述的八個步驟分述如下①制備禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液用接種環(huán)刮取一環(huán)斜面保藏的禽多殺性巴氏桿菌，將刮有一環(huán)禽多殺性巴氏桿菌的接 種環(huán)以“Z”字型劃線接種于培養(yǎng)平板上，將培養(yǎng)平板放置于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)M小時，挑 取培養(yǎng)M小時后的培養(yǎng)平板上生長的一個單菌落接種于5毫升的液體培養(yǎng)基中，將該5毫 升的液體培養(yǎng)基放在37°C的搖床中以160轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩培養(yǎng)M小時，再將振蕩培養(yǎng) 的5毫升液體培養(yǎng)基全部倒入200毫升的液體培養(yǎng)基中并在37°C的搖床中以160轉(zhuǎn)/分鐘 的速度振蕩培養(yǎng)M小時制備出禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液；②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體將上述①制備出的禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液加入到250毫升的離心管中，將加入禽多 殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液的該250毫升離心管放在離心機(jī)上并在5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心 15分鐘，然后將離心15分鐘后的250毫升離心管中的上清液棄掉，留在該250毫升離心管 中的沉淀物就是所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體；③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進(jìn)行破碎在上述②中250毫升離心管所收集的禽多殺性巴氏桿菌菌體中加入10毫升的蒸餾水， 然后將該250毫升離心管置于超聲波破碎儀中，設(shè)置超聲波破碎儀的功率為500瓦，每超聲 波輻射20秒后停止輻射20秒為一個破碎循環(huán)過程，所有破碎循環(huán)過程共持續(xù)30分鐘，30 分鐘后該250毫升離心管中得到的就是經(jīng)超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體；④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖溶液從禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖分為三步，三步分述如下第一步，提取上述③中經(jīng)超聲波破碎得到的禽多殺性巴氏桿菌菌體10毫升并加入到 50毫升離心管中，然后再向該50毫升離心管中加入10毫升其濃度為90%的苯酚，顛倒該 50毫升離心管數(shù)次使10毫升禽多殺性巴氏桿菌菌體和10毫升苯酚充分混勻，然后將充分 混勻的該50毫升離心管放置在70°C的水浴鍋中加熱并用玻璃棒快速攪拌30分鐘，30分鐘 后從水浴鍋中取出該50毫升離心管并在室溫下放置20分鐘，再將該50毫升離心管放在離 心機(jī)上并在4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心結(jié)束后將該50毫升離心管的上層溶 液吸取并加入到另一 50毫升的三角瓶中、該50毫升離心管中的中層溶液棄掉不要、最后再 向該50毫升離心管中的下層溶液中加入蒸餾水補(bǔ)足體積至10毫升待用；第二步，向第一步中待用的該50毫升離心管中的下層溶液+蒸餾水中加入10毫升其 濃度為90%的苯酚，顛倒該50毫升離心管數(shù)次使其充分混勻，充分混勻后將該50毫升離心 管放置在70°C的水浴鍋中加熱并用玻璃棒快速攪拌30分鐘，30分鐘后從水浴鍋中取出該 50毫升離心管并在室溫下放置20分鐘，再將該50毫升離心管放在離心機(jī)上并在4000轉(zhuǎn)/ 分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心結(jié)束后將該50毫升離心管的上層溶液吸取并加入到第一 步中的另一 50毫升的三角瓶中存儲、該50毫升離心管中的中層溶液棄掉不要、最后再向該 50毫升離心管中的下層溶液中加入蒸餾水補(bǔ)足體積至10毫升準(zhǔn)備再次使用；第三步，重復(fù)第二步數(shù)次直至將另一 50毫升的三角瓶儲滿刻度為止，存儲滿50毫升的 另一 50毫升三角瓶中的所述上層溶液就是從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提 的脂多糖溶液；⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液將粗提的50毫升脂多糖溶液全部加入到透析袋中，將透析袋放在自來水流水中持續(xù) 沖洗48小時，再將透析袋放入到蒸餾水中浸泡，每6小時浸泡換一次蒸餾水共換蒸餾水8 次，然后將透析袋放入裝有聚乙二醇6000的燒杯中進(jìn)行濃縮，直到透析袋中的50毫升脂多 糖溶液被濃縮到7. 5毫升濃縮液為止，透析袋中所述7. 5毫升濃縮液即為脂多糖濃縮液；⑥用DNA酶和RNA酶來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA將上述⑤中的所述7. 5毫升脂多糖濃縮液倒入10毫升的離心管中，再向該10毫升離 心管中分別加入375微克的DNA酶和RNA酶；將該10毫升離心管放在37°C水浴中放置5 小時，再將該10毫升離心管放在100°C水浴中放置10分鐘，放置10分鐘后從100°C水浴中 取出該10毫升離心管并冷卻至室溫，在室溫條件下將該10毫升離心管放在離心機(jī)上并在 3000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘，離心30分鐘后將該10毫升離心管中的上清液吸取并 倒入另一 100毫升的離心管中備用；⑦制備純化的脂多糖向上述⑥備用的另一 100毫升離心管中加入體積是其上述⑥所述上清液液體6倍的無 水乙醇并用6摩爾/升的NaOH調(diào)節(jié)pH值至9. 0，再將該另一 100毫升離心管在4°C時放置 12小時，然后在離心機(jī)上并在6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，離心15分鐘后將該另 一 100毫升離心管中的液體倒掉、留在該另一 100毫升離心管中的沉淀物即為所制備純化 的脂多糖；⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗在上述⑦另一 100毫升離心管中所制備純化的脂多糖中加入1毫升的超純水進(jìn)行溶解 并得到高濃度的脂多糖溶液，用蒽酮法測定所述脂多糖溶液的濃度，緩慢加入超純水至所 述脂多糖溶液的濃度達(dá)到0. 5毫克/毫升為止；向上述濃度為0. 5毫克/毫升的所述脂多糖溶液中倒入50毫升燒杯中，再向該50毫 升燒杯中加入體積是所述脂多糖溶液體積1. 5倍的弗氏完全佐劑，同時在該50毫升燒杯中 放入一磁力棒并在磁力攪拌器作用下攪拌1小時，攪拌1小時后在該50毫升燒杯中的溶液 就是制作的禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗。
2.如權(quán)利要求1所述從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，其特 征是所述培養(yǎng)平板上包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化鈉、2%的 瓊脂和少量水。
3.如權(quán)利要求1所述從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，其特 征是所述液體培養(yǎng)基包含有1. 5%的胰蛋白胨、0. 5%的大豆蛋白胨、0. 5%的氯化鈉和少量 水。
全文摘要
一種從禽多殺性巴氏桿菌提取脂多糖并制作脂多糖疫苗的方法，經(jīng)過①制備禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液、②從禽多殺性巴氏桿菌培養(yǎng)液中收集禽多殺性巴氏桿菌菌體、③超聲波對禽多殺性巴氏桿菌菌體進(jìn)行破碎、④從超聲波破碎的禽多殺性巴氏桿菌菌體中粗提脂多糖溶液、⑤從粗提的脂多糖溶液中提取脂多糖濃縮液、⑥用DNA酶和RNA酶來酶解脂多糖濃縮液中的DNA和RNA、⑦制備純化的脂多糖和⑧將純化的脂多糖制作成禽多殺性巴氏桿菌脂多糖疫苗共八個步驟。經(jīng)動物免疫實(shí)驗(yàn)和動物攻毒實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明制備出的禽多殺性巴氏桿菌病脂多糖疫苗給雞進(jìn)行三次免疫之后能使被免疫雞有效地預(yù)防禽多殺性巴氏桿菌病。
文檔編號C12N1/20GK102120028SQ201110055100
公開日2011年7月13日 申請日期2011年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月9日
發(fā)明者孫軍杰, 宮強(qiáng), 張敏, 李愛江, 牛明福, 王帥濤, 秦翠麗 申請人:河南科技大學(xué)