本發(fā)明涉及腫瘤基因領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測結(jié)直腸癌的引物組及檢測方法。
背景技術(shù)：
：結(jié)直腸癌是一種常見的惡性腫瘤，全世界新診斷的結(jié)直腸癌病例數(shù)接近每年一百萬。隨著經(jīng)濟(jì)水平的升高，飲食結(jié)構(gòu)的改變，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率也日漸增高，已躍居第3～5位；死亡率位居惡性腫瘤死亡譜的第4或第5位。據(jù)預(yù)測，結(jié)直腸癌將成為我國最常見的發(fā)病率上升的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與死亡率在今后很長一段時(shí)期內(nèi)仍將穩(wěn)步上升。morson早在1974年提出“腺瘤—癌變”學(xué)說，認(rèn)為結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展必然要經(jīng)過一個(gè)腺瘤的形成過程，其演變約需10—15年。流行病學(xué)資料也顯示大腸腺瘤性息肉與結(jié)直腸癌的發(fā)生呈正相關(guān)。這一連續(xù)性的病理進(jìn)展需要較長的階段，即存在較長的癌前病變期。術(shù)前無轉(zhuǎn)移者根治后10年生存率可達(dá)半數(shù)以上。因此結(jié)直腸癌早期篩查和診斷非常關(guān)鍵。早期結(jié)直腸癌往往無明顯癥狀，從建立的高危人群中篩查病例，使被動(dòng)接受就診者轉(zhuǎn)為主動(dòng)篩查是早期發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的有效途徑，相關(guān)研究越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。結(jié)直腸癌的確診有賴于腸鏡及其活檢的病理診斷，但內(nèi)鏡屬有創(chuàng)檢查，可能帶來不適和并發(fā)癥，患者接受程度較低。有效的非侵襲性血液檢測可能為發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌的理因此對結(jié)直腸癌的早期診斷十分必要。目前結(jié)直腸癌的診斷方法包括影像學(xué)檢查，細(xì)胞病理學(xué)和組織病理學(xué)診斷。影像學(xué)檢查包括ct掃描、核磁共振檢查等。通常的細(xì)胞和組織病理學(xué)檢測包括細(xì)胞活檢，需要通過外科手術(shù)或者腸鏡的方法從患者上獲取腫瘤組織的檢材，目前在我國，尚沒有普及。目前，臨床常用的監(jiān)測結(jié)直腸癌的腫瘤標(biāo)志物主要有癌胚抗原(cea)、糖鏈蛋白19-9(ca19-9)等，用于病理學(xué)診斷結(jié)直腸癌免疫組化指標(biāo)有環(huán)氧合酶-2(cox-2)、拓?fù)洚悩?gòu)酶ii(topoii)、ki67等。cea由gold和freedman從結(jié)腸腺癌中提出，為較廣譜、非特異性腫瘤標(biāo)記物，屬于人類胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白。cea已經(jīng)被醫(yī)學(xué)界接受并且為國際腫瘤學(xué)協(xié)會(huì)推薦，主要用于腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測。cea在95％的結(jié)直腸、胃和胰腺腫瘤以及多數(shù)的乳腺、肺和頭頸部腫瘤均有升高。也有報(bào)道良性疾病的患者cea水平升高，以及許多結(jié)直腸癌尤其在疾病早期患者cea水平正常近來，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulatingtumorcells，ctcs)檢測的出現(xiàn)給患者的檢測帶來了新的希望。ctcs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細(xì)胞，是惡性腫瘤患者術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導(dǎo)致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學(xué)標(biāo)本如骨髓等相比，外周血標(biāo)本容易獲取，且對患者創(chuàng)傷小，是臨床上常規(guī)檢測較為理想的標(biāo)本來源。ctcs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個(gè)體化治療方案。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，ctcs檢測可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，且對患者沒有副作用。ctc的檢測通常通過抽取一定體積的血液進(jìn)行。檢測分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測和先捕獲(富集)后檢測，其中后者為主流的檢測方法。先捕獲(富集)后檢測的方法也分為兩類，即正選和負(fù)選。正選主要是通過ctc表面標(biāo)志物或細(xì)胞的物理性質(zhì)(大小、密度)進(jìn)行捕獲；前者是基于免疫磁球技術(shù)和微流控芯片技術(shù)，后者是基于過濾、離心的原理。負(fù)選則是通過白細(xì)胞表面標(biāo)志物間接捕獲ctc。然而基于先捕獲(富集)后檢測的方法有著明顯的缺陷。它嚴(yán)重依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)記物的表達(dá)，因此無法捕獲未表達(dá)表面腫瘤標(biāo)記物的ctc細(xì)胞。采用rt-pcr的方法檢測ctc細(xì)胞的特異性基因是ctc細(xì)胞檢測的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集ctcs，然后通過rt-pcr的方式檢測特定基因的mrna，以此判斷ctcs是否存在，并通過檢測ct值的變化給ctcs定量。這種方法檢測ctcs費(fèi)用低，敏感度高，而且容易自動(dòng)化。目前rt-pcr方法檢測結(jié)直腸癌的ctcs檢測的標(biāo)準(zhǔn)還沒有建立。通過檢測結(jié)直腸癌患者的ctcs特征基因，能夠確定結(jié)直腸癌ctcs的檢測方法和檢測標(biāo)準(zhǔn)。這些方法和標(biāo)準(zhǔn)的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預(yù)后、評估抗腫瘤藥物，包括nk和car-t免疫治療的療效及制定個(gè)體化治療方案。針對上述問題，本發(fā)明開發(fā)一種高靈敏的多基因聯(lián)合檢測的試劑盒，通過聯(lián)合檢測epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck199個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期篩查或診斷。本發(fā)明設(shè)計(jì)運(yùn)用靶向特異性引物組，大幅度提高檢測的靈敏度。該檢測方法的檢出率可達(dá)到95％，同時(shí)具備了靈敏度高，特異性好，快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于檢測結(jié)直腸癌的引物組及檢測方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的,一種用于檢測腸癌的引物組，包含：本發(fā)明的引物組可通過以下兩種方法實(shí)現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的檢測。方法1：pcr方法。(1)將權(quán)利要求1所述的9對引物分別加入到單個(gè)pcr反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、rna酶抑制劑、dna聚合酶、dntp；其中，pcr反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和pcr反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測。方法2：熒光定量pcr方法(1)將權(quán)利要求1所述的9對引物分別加入到單個(gè)pcr反應(yīng)管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、rna酶抑制劑、dna聚合酶、dntp；分別加入2×chamqsybrqpcrmastermix，其中，pcr反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔；(2)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和pcr反應(yīng)，并實(shí)時(shí)檢測熒光；(3)根據(jù)熒光檢測結(jié)果計(jì)算出的ct值，判斷是否有標(biāo)志物靶基因表達(dá)于樣品中。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過設(shè)計(jì)特異性pcr引物，開發(fā)出用于腸癌早期檢測的多基因聯(lián)合檢測方法。此方法：(1)建立的pcr體系可對epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck19基因進(jìn)行聯(lián)合檢測；(2)通過同時(shí)對多個(gè)基因進(jìn)行檢測腸癌檢出率可達(dá)到95％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達(dá)水平均可檢出；(4)特異性強(qiáng)，正常人或非腸癌病人樣本不會(huì)產(chǎn)生非特異性信號；(5)檢測速度快，操作簡單，費(fèi)用低廉。附圖說明圖1為實(shí)施例中健康人外周血樣本檢測陰性pcr圖。圖2為實(shí)施例中乳腺癌患者外周血樣本檢測陰性pcr圖。圖3為實(shí)施例中乳腺癌患者癌組織樣本檢測陰性pcr圖。圖4為實(shí)施例中結(jié)直腸癌患者外周血檢測陽性pcr圖。圖5為實(shí)施例中結(jié)直腸癌患者腸癌組織檢測陽性pcr圖。圖中，m.100bpmarker；1.epcam；2.her2；3.egfr；4.cea；5.muc1；6.cd10；7.ck8；8.ck18；9.ck19；10.b2m。具體實(shí)施方式本發(fā)明針對目前腫瘤中主要的驅(qū)動(dòng)性突變基因，聯(lián)合檢測epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck199個(gè)基因?qū)崿F(xiàn)結(jié)直腸癌的早期篩查或診斷。針對目前檢測方法靈敏度低，檢測過程復(fù)雜繁瑣，檢測所需時(shí)間長，無法滿足臨床檢測的實(shí)際需求。針對上述問題，設(shè)計(jì)出用于檢測上述9個(gè)基因的一整套特異性引物組。根據(jù)上述9個(gè)基因的參考序列設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，其pcr產(chǎn)物長度最優(yōu)是在180-200bp之間，退火溫度不高于60度，gc含量在40-60％之間，符合一般引物設(shè)計(jì)軟件的要求。通過采用實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)檢測體系，實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因聯(lián)合的高靈敏檢測，其檢測方法如下所述。本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子可隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(coldspringharborlaboratorypress)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社，北京，中國，2001年)、《rna實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊》(科學(xué)出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術(shù)》(科學(xué)出版社，北京，中國，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊以及本文所引用的參考文獻(xiàn)中所列方法來實(shí)施。其中，所用的(帶標(biāo)記的)探針、引物可以委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1:基因選擇多項(xiàng)研究表明，單基因篩查敏感度約為20-60％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個(gè)基因檢測，其檢測敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯(lián)合檢測可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準(zhǔn)確度。guya.weiss等人(weissga,samuelst,ustwanioa,etal.circulatingtumorcellsingastrointestinalmalignancies[j].translationalgastrointestinalcancer,2013,2(3).)同時(shí)檢測epcam、her2、egfr、cea基因，結(jié)果表明聯(lián)合檢測三個(gè)基因用于腸癌早期診斷的敏感度為63％，準(zhǔn)確率達(dá)75.2％。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預(yù)后，我們對腸癌組織和正常組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。我們通過大量比對實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck19組成的基因組對腸癌具有較高的檢出率，達(dá)到95％，相對于現(xiàn)有的檢測技術(shù)，產(chǎn)生了意想不到的技術(shù)效果，具有顯著的進(jìn)步。實(shí)施例2:引物篩選(1)設(shè)計(jì)引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3，具體為：利用生物信息學(xué)軟件對靶基因a-i序列進(jìn)行分析，利用序列分析軟件設(shè)計(jì)特異性引物組，利用ncbi引物搜索軟件檢測各配對引物在人基因組中的特異性，分別設(shè)計(jì)出3對特異性擴(kuò)增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3、f1～f3、g1～g3、h1～h3、i1～i3；表1：pcr檢測引物(2)外周血樣品的處理本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)材料是收集某醫(yī)院收治并經(jīng)病理證實(shí)的結(jié)直腸癌患者外周血，清晨7點(diǎn)，空腹，經(jīng)肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4小時(shí)。1.將抗凝管中的全血樣本加入等體積pbs(ph7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.加入等體積氯化銨紅細(xì)胞裂解液(可購自碧云天)，于室溫20rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；3.將下層血細(xì)胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入ficoll分離液，混合液與ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；4.吸棄上清，取細(xì)胞沉淀，洗滌，即得到pbmc；5.取pbmc用于核酸提取，多余的pbmc用rna保護(hù)劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取1.取不多于5×105的pbmc，加入250μlbufferrltplus，吹打混勻；2.將裂解液轉(zhuǎn)移至gdna清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.加入1倍體積的70％乙醇(350μl)至流穿液中，吹打混勻；4.將樣品轉(zhuǎn)移至rneasyminelute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；5.在rneasyminelute離心柱中加入700μlbufferrw1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；6.在rneasyminelute離心柱中加入500μlbufferrpe，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；7.將rneasyminelute離心柱置于新的2ml收集管中，打開蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發(fā)；8.將rneasyminelute離心柱置于新的1.5ml收集管中，加入20μlrnase-freeh2o，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫rna。(4)模板cdna的獲得1.準(zhǔn)確測得樣品rna濃度；2.嚴(yán)格按照cdna反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系；成分體積5×mix8μlrna500ngrnase-freeh2o至40μl輕柔混勻以上反應(yīng)體系，并利用離心機(jī)短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cdna；(5)普通pcr擴(kuò)增用taqdna聚合酶配置反應(yīng)體系，，用引物為a-i和人內(nèi)參基因(b2m)進(jìn)行pcr擴(kuò)增各樣品，產(chǎn)物1％凝膠檢測；擴(kuò)增體系pcr反應(yīng)條件是95℃預(yù)變性3分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實(shí)時(shí)定量pcr擴(kuò)增根據(jù)設(shè)計(jì)的特異引組a-i，通過熒光定量pcr進(jìn)行擴(kuò)增，體系如下：95℃預(yù)變性20s，1個(gè)循環(huán)；95℃10s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；每管設(shè)立三個(gè)復(fù)孔；根據(jù)步驟5和6的pcr結(jié)果，篩選出以下引物組，作為本發(fā)明用于檢測結(jié)直腸癌的引物組。實(shí)施例3：效果驗(yàn)證根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對100個(gè)腫瘤樣本進(jìn)行檢測。序號多基因聯(lián)合檢測檢出率1epcam、her2、egfr、cea、muc170％2epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd1072％3epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck876％4epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck1879％5epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、ck1998％6epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、htert83％7epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、mage181％8epcam、her2、egfr、cea、muc1、cd10、ck8、ck18、cd9084％其中，htert的正向引物為ctgagctgtactttgtcaag，反向引物為agacgtggctcttgaaggcc，mage1的正向引物為ctctgagtccttgcagctgg，反向引物為ccgccctccattgcaatcat，cd90的正向引物為atgaacctggccatcagcat，反向引物為cttctttgtctcacgggtca。1～8號引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數(shù)量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進(jìn)一步地，通過比較5～8號引物組可以發(fā)現(xiàn)，引物組內(nèi)的組合對于檢出率的高低有重要影響。同時(shí)在相同的檢測基因數(shù)量情況下，5號引物組的檢出率高于6～8號引物組。因此，我們優(yōu)選5號引物組的基因組合用于結(jié)直腸癌的檢測。進(jìn)一步通過研究發(fā)現(xiàn)，5號引物組中，epcam是一種由ga-733-2基因編碼的分子量為40kda的跨膜糖蛋白，作為嗜同種的鈣非依賴性的上皮細(xì)胞間粘附分子在上皮癌變過程中發(fā)揮著作用。cea抗原決定基為糖蛋白，而腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移均與細(xì)胞膜糖蛋白的糖基化改變有關(guān)。egfr二聚后可以激活它位于細(xì)胞內(nèi)的激酶通路，包括y992,y1045,y1068,y1148andy1173等激活位點(diǎn)。這個(gè)自磷酸化可以引導(dǎo)下游的磷酸化，包括mapk，akt和jnk通路,誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。muc1是由muc1基因表達(dá)的一種高糖基化(糖化大于50％)、高分子量(mr＞200×103)蛋白,又稱附膜蛋白，是跨膜分子，它在上皮更新與分化，維持上皮完整性和癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移等方面都起到重要的作用。由上可知，本發(fā)明并不是將9對引物進(jìn)行簡單疊加組合，9對引物相鋪相成，在功能上彼此支持，使得檢出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技術(shù)效果。綜上所述，本發(fā)明中選擇的基因涉及腫瘤的代謝、增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測出結(jié)直腸癌的細(xì)胞生物學(xué)特征。實(shí)施例4：特異性分析根據(jù)實(shí)施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對正常人外周血樣本、非結(jié)直腸癌病人的外周血和腫瘤組織樣本、結(jié)直腸癌病人的外周血和組織樣本進(jìn)行檢測。圖中1-10基因分別為：1.epcam；2.her2；3.egfr；4.cea；5.muc1；6.cd10；7.ck8；8.ck18；9.ck19；10.b2m。檢測結(jié)果如圖1-5所示，從圖中可見所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非結(jié)直腸癌病人的外周血(圖2)和腫瘤組織樣本(圖3)中均未或較弱檢測到基因的表達(dá)。在結(jié)直腸癌病人的外周血(圖4)和組織樣本(圖5)中可檢測到多個(gè)基因的強(qiáng)表達(dá)，分別為5/9和8/9,說明本發(fā)明中所述引物組具有高度的特異性。當(dāng)前第1頁12