本發(fā)明涉及塵螨過(guò)敏原檢測(cè)重組領(lǐng)域，具體是一種屋塵螨過(guò)敏原derp1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增可視化檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：世界變態(tài)反應(yīng)組織（worldallergyorganization，wao）報(bào)告指出，全球變態(tài)反應(yīng)性疾病的總患病率高達(dá)22％，此類(lèi)疾病主要包括過(guò)敏性哮喘(哮喘)、過(guò)敏性鼻炎等，近年來(lái)其發(fā)病率在逐步增高。研究發(fā)現(xiàn)，塵螨是導(dǎo)致呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的最重要因素，居住環(huán)境灰塵中塵螨過(guò)敏原含量是導(dǎo)致性哮喘患者哮喘發(fā)作的重要因素。據(jù)報(bào)道，塵螨抗原皮試陽(yáng)性者的哮喘評(píng)分與居室中derp1含量相關(guān)，當(dāng)室內(nèi)沒(méi)有足夠的塵螨孳生時(shí)患者也不會(huì)出現(xiàn)哮喘癥狀，當(dāng)減少和清除居室環(huán)境孳生的螨類(lèi)時(shí)，患者在低水平（每克室塵中derp1含量低于2g）的塵螨環(huán)境中可減輕患者癥狀和減少發(fā)作。因此，需要建立快速、定量檢測(cè)塵螨過(guò)敏原derp1、derp2濃度的方法可檢測(cè)室塵中塵螨過(guò)敏原含量，監(jiān)測(cè)人群暴露水平，對(duì)過(guò)敏原環(huán)境暴露水平進(jìn)行評(píng)估。因此定量監(jiān)測(cè)環(huán)境中塵螨過(guò)敏原含量，引導(dǎo)人群主動(dòng)回避過(guò)敏原，從而預(yù)防塵螨過(guò)敏性疾病的發(fā)生更有實(shí)用價(jià)值。目前國(guó)內(nèi)僅有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)才進(jìn)行塵螨過(guò)敏原含量檢測(cè)，多數(shù)研究并不檢測(cè)塵螨的主要過(guò)敏原成分。國(guó)外已有以酶聯(lián)免疫方法開(kāi)發(fā)的商品化的試劑盒供應(yīng)，但因?yàn)閮r(jià)格昂貴而未能在我國(guó)廣泛應(yīng)用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種屋塵螨過(guò)敏原derp1的lamp可視化檢測(cè)方法，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)屋塵螨過(guò)敏原derp1環(huán)介導(dǎo)的可視化檢測(cè)，方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果易于觀察。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種屋塵螨過(guò)敏原derp1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增可視化檢測(cè)方法，包括以下步驟：活屋塵螨經(jīng)研缽研碎、組織勻漿器制成勻漿后，提取總rna保存?zhèn)溆茫粌?nèi)引物（fip和bip）各1.6μm，外引物（f3和b3)各0.2μm，1.4mmdntp，0.8m甜菜堿betaine(sigma)，6.0mmmgso4(sigma)，2.5μl10×thermopolii(mg2+-free)reactionbuffer[20mmtris–hcl,10mmkcl,10mm(nh4)2so4,0.1%tritonx-100]，8ubstdna聚合酶大片段（neb），5uamvreversetranscriptasexl(takara),0.5μlrna模板，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μl；將反應(yīng)體系于65℃水浴鍋中反應(yīng)60min，然后80℃水浴10min終止反應(yīng)；在此基礎(chǔ)上，對(duì)mg2+濃度(2,4,6,8,10,and12mm)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)溫度（56,58,60,62,64,and66?c）和時(shí)間（10,20,30,40,50,60,and70min）進(jìn)行優(yōu)化。取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%普通瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1.0μlsybrgreeni(100×)(lifetechnology)染料，并將溶液置于365nm紫外光下觀察有無(wú)熒光產(chǎn)生。如果產(chǎn)生綠色為陽(yáng)性反應(yīng)，淺棕色則為陰性反應(yīng)。進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物和外引物的設(shè)計(jì)和合成步驟如下：參照genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中derp1基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇保守區(qū)域，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件primerexplore4.0進(jìn)行rt-lamp引物設(shè)計(jì)與篩選，每一個(gè)lamp反應(yīng)包括1對(duì)外引物、和1對(duì)內(nèi)引物，引物由寶生物合成。進(jìn)一步的，對(duì)各濃度rna利用one-steprnapcrkit進(jìn)行一步rt—pcr擴(kuò)增：反應(yīng)體系為：2.5μl10×onesteprnapcrbuffer，5mmmgcl2，1.0mmdntpmixture，20urnaseinhibitor，5uamvreversetranscriptasexl，2.5uamvoptimizedtaq,0.2mlamp外引物(f3andb3)，0.5μltemplaterna，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μl；反應(yīng)程序?yàn)椋?0?c反轉(zhuǎn)錄30min,94?c，2min,然后30循環(huán)pcr反應(yīng)(94?c，30s；53?c，30s,72?c，30s).擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%普通瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。本發(fā)明的一種屋塵螨過(guò)敏原derp1的lamp可視化檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)屋塵螨過(guò)敏原derp1環(huán)介導(dǎo)的可視化檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)。本發(fā)明的檢測(cè)方法，簡(jiǎn)單易行，檢測(cè)結(jié)果便于觀察，且靈敏度高。附圖說(shuō)明圖1為derp1基因rt-lamp檢測(cè)瓊脂糖凝膠電泳示意圖；圖2為derp1基因rt-lamp檢測(cè)的特異性熒光第一示意圖；圖3為derp1基因rt-lamp檢測(cè)的特異性熒光第二示意圖；圖4為derp1基因rt-lamp(a-c)和rt-pcr(d)靈敏度檢測(cè)第一示意圖；圖5為derp1基因rt-lamp(a-c)和rt-pcr(d)靈敏度檢測(cè)第二示意圖；圖6為derp1基因rt-lamp(a-c)和rt-pcr(d)靈敏度檢測(cè)第三示意圖；圖7為derp1基因rt-lamp(a-c)和rt-pcr(d)靈敏度檢測(cè)第四示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明提出的一種屋塵螨過(guò)敏原derp1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增可視化檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。在一個(gè)具體的實(shí)施例中，本發(fā)明的一種屋塵螨過(guò)敏原derp1d的lamp可視化檢測(cè)方法包括以下步驟：1材料與方法1.1塵螨本課題組人工培養(yǎng)的屋塵螨（dermatophagoidespteronyssinus）、粉塵螨、熱帶無(wú)爪螨、腐食酪螨，培養(yǎng)設(shè)備為人工氣侯箱(寧波江南儀器廠/rxz-280d)，培養(yǎng)條件為：25℃±1℃，相對(duì)濕度70%±5。屋塵螨、熱帶無(wú)爪螨培養(yǎng)基均為魚(yú)粉、酵母粉按一定比例配制，粉塵螨和腐食酪螨培養(yǎng)基均為飼料為面粉和酵母粉按一定比例配制。取此人工培養(yǎng)螨，用爬盤(pán)法收集活螨約1000只以上，用無(wú)菌生理鹽水洗滌后，置rna樣品保存液中。試劑bstdna聚合酶(大片段)購(gòu)自newenglandbiolabs公司，mgso4和betain購(gòu)自sigma公司。amv反轉(zhuǎn)錄酶、one-steprnapcrkit、dntp購(gòu)自takara公司。trizol和sybrgreeni熒光染料購(gòu)自北京solarbio公司。rna提取試劑reagent購(gòu)自lifetechnology公司。引物的設(shè)計(jì)與合成參照genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中derp1基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)分析，選擇保守區(qū)域，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件primerexplore4.0（http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html）進(jìn)行rt-lamp引物設(shè)計(jì)與篩選，每一個(gè)lamp反應(yīng)包括1對(duì)外引物(f3、b3)和1對(duì)內(nèi)引物(fip、bip)（表1），引物由寶生物合成。表1derp1rt-lamp引物序列引物長(zhǎng)度(nt)序列(5′→3′)f320tcgatacgttgcacgagaacb321agcgtgatagtttggttggtafip44tgggtttgagccaaagcttcacggcacaacgtttcggtatctcabip43gcgctattgccgtcattattggccgcgttgaatgattgttcgg1.4總rna的提取活屋塵螨經(jīng)研缽研碎、組織勻漿器制成勻漿后按trizol說(shuō)明書(shū)提取總rna,于-80℃保存?zhèn)溆谩７磻?yīng)體系及其優(yōu)化內(nèi)引物（fip和bip）各1.6μm，外引物（f3和b3)各0.2μm，1.4mmdntp，0.8m甜菜堿betaine(sigma)，6.0mmmgso4(sigma)，2.5μl10×thermopolii(mg2+-free)reactionbuffer[20mmtris–hcl,10mmkcl,10mm(nh4)2so4,0.1%tritonx-100]，8ubstdna聚合酶大片段（neb），5uamvreversetranscriptasexl(takara),0.5μlrna模板，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μl。將反應(yīng)體系于65℃水浴鍋中反應(yīng)60min，然后80℃水浴10min終止反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)mg2+濃度(2,4,6,8,10,and12mm)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)溫度（56,58,60,62,64,and66?c）和時(shí)間（10,20,30,40,50,60,and70min）進(jìn)行優(yōu)化。取2μl擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%普通瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳?？梢暬瘷z測(cè)在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1.0μlsybrgreeni(100×)(lifetechnology)染料，并將溶液置于365nm紫外光下觀察有無(wú)熒光產(chǎn)生。如果產(chǎn)生綠色為陽(yáng)性反應(yīng)，淺棕色則為陰性反應(yīng)。特異性和靈敏度分析利用優(yōu)化好的rt-lamp反應(yīng)體系，以屋塵螨，粉塵螨,熱帶無(wú)爪螨，腐食酪螨rna為待檢樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)rt-lamp方法的特異性。觀察可視化結(jié)果，并取2μlrt-lamp反應(yīng)產(chǎn)物于2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。將制備的屋塵螨rna按10倍遞增稀釋?zhuān)⒎謩e為1.0μg、1.0×10?1μg、1.0×10?2μg、1.0×10?3μg、1.0×10?4μg、1.0×10?5μg、1.0×10?6μg、1.0×10?7μg和1.0×10?8μg，用rt-lamp方法進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)一步與常規(guī)rt-pcr方法進(jìn)行靈敏度比較分析。擴(kuò)增對(duì)各濃度rna利用one-steprnapcrkit(takara)進(jìn)行一步rt—pcr擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：2.5μl10×onesteprnapcrbuffer，5mmmgcl2，1.0mmdntpmixture，20urnaseinhibitor，5uamvreversetranscriptasexl，2.5uamvoptimizedtaq,0.2mlamp外引物(f3andb3)，0.5μltemplaterna，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μl。反應(yīng)程序?yàn)椋?0?c反轉(zhuǎn)錄30min,94?c，2min,然后30循環(huán)pcr反應(yīng)(94?c，30s；53?c，30s,72?c，30s)。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%普通瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。臨床樣品分析2014年3-6月份，采集85份床塵樣品，并提取rna進(jìn)行derp1基因rt-pcr和rt-lamp檢測(cè)，驗(yàn)證rt—lamp方法的可靠性。結(jié)果2.1derp1基因rt-lamp檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件通過(guò)對(duì)mg2+濃度，反應(yīng)溫度（56-66°c）和反應(yīng)時(shí)間（10-70min）進(jìn)行優(yōu)化，從電泳結(jié)果分析獲得了derp1基因rt-lamp檢測(cè)方法的最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件：內(nèi)引物（prsv-fip和prsv-bip）各1.6μm，外引物（prsv-f3和prsv-b3)各0.2μm，0.8m甜菜堿，8mmmgso4，2.5μl10×thermopolii(mg2+-free)reactionbuffer[20mmtris–hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，0.1%tritonx-100]，8ubstdna聚合酶大片段，5uamvreversetranscriptasexl，0.5μlrna模板，加滅菌雙蒸水補(bǔ)足25μl。將反應(yīng)體系于62°c水浴鍋中反應(yīng)60min，然后80°c水浴10min終止反應(yīng)。特異性檢驗(yàn)利用上述建立的rt-lamp方法進(jìn)行檢測(cè)，只有屋塵螨為陽(yáng)性結(jié)果:瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)特征性梯形條帶（圖1）,肉眼和紫外燈下都觀察綠色熒光（圖1至3），而對(duì)粉塵螨、熱帶無(wú)爪螨、腐食酪螨rna檢測(cè)均為陰性：如圖1所示，瓊脂糖凝膠均沒(méi)有特征性梯形條帶出現(xiàn)，如圖2和3所示，肉眼觀察可見(jiàn)棕色，在紫外燈下無(wú)熒光。圖中，m：d2000dnaladder；1：粉塵螨；2：熱帶無(wú)爪螨；3：腐食酪螨；4：屋塵螨。靈敏度檢驗(yàn)如圖4所示，所建立的rt-lamp對(duì)derp1基因的最小檢測(cè)量為1.0×10?6μg，即肉眼和紫外燈下都觀察到綠色熒光，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)特征性梯形條帶，而常規(guī)rt-pcr方法最小檢測(cè)量為1.0×10?5μg，如圖5至7所示，結(jié)果表面：本試驗(yàn)建立的derp1基因rt-lamp敏感性比常規(guī)rt-pcr高10倍。圖中，m：d2000dnaladder；11：1.0μg；12：1.0×10?1μg；13：1.0×10?2μg；14：1.0×10?3μg；15：1.0×10?4μg；16：1.0×10?5μg；17：1.0×10?6μg；18：1.0×10?7μg;9：1.0×10?8μg。臨床樣品檢驗(yàn)對(duì)85份床塵樣品抽提rna后直接進(jìn)行derp1基因rt-lamp檢測(cè)，結(jié)果有11份為陽(yáng)性，而常規(guī)rt-pcr方法檢出為陰性，表明本試驗(yàn)建立的derp1基因rt-lamp方法更敏感。表285份床塵樣derp1基因rt-lamp檢測(cè)結(jié)果本發(fā)明具體應(yīng)用途徑很多，以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)，這些改進(jìn)也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12