本發(fā)明涉及一種利用喜樹懸浮細胞生產(chǎn)喜樹堿和10-羥基喜樹堿的方法，屬于醫(yī)藥生物
技術領域：
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背景技術：
：喜樹(camptothecaacuminate)，別名旱蓮、水栗、水桐樹、天梓樹、旱蓮子、千丈樹、野芭蕉、水漠子，是珙桐科、喜樹屬植物。主要分布于中國長江以南地區(qū)。1999年8月，經(jīng)中華人民共和國國務院批準，喜樹被列為第一批國家重點保護野生植物，保護級別為ⅱ級。喜樹具有很好的藥用價值，其果實、樹皮、根、樹枝、葉均可用藥。現(xiàn)代研究表明，喜樹植物中主要藥用活性成分為生物堿。臨床多提取喜樹堿用于治療腫瘤等疾病。同時，喜樹堿類藥物也是目前臨床上常用的三大天然抗癌藥物之一。喜樹堿最早從我國特有植物喜樹(camptothecaacuminata)樹皮中分離獲得，后來陸續(xù)在多種植物中發(fā)現(xiàn)，如夾竹桃科的海木狗牙花(ervatamiaheyneana)、茶茱萸科的臭味假柴龍樹(nothapodytesfoetida)以及茜草科的短小蛇根草(ophiorrhizapumila)等。喜樹堿通過抑制拓撲異構酶i而發(fā)揮抗腫瘤活性。通過對喜樹堿構效關系研究，衍生出一系列化合物用于治療胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、腸癌、子宮頸癌、胃癌和血液腫瘤等疾病，是全球抗腫瘤藥物市場上的主要品種。喜樹堿的來源主要有：1)植物提?。?)化學合成。植物提取喜樹堿是目前采用的主要方式。然而，喜樹堿在植物中的含量較低(一般為0.1-0.2％左右，在新鮮樹葉中含量稍高，達0.4-0.5％)，其提取、分離、純化、制備過程繁瑣；另外產(chǎn)喜樹堿植物的生長周期均較長，并且喜樹堿的積累進程緩慢。單純從植物中提取勢必造成對植物資源和生態(tài)環(huán)境的巨大破壞。此外，提取過程中大量有機溶劑的使用導致環(huán)境污染。喜樹堿的化學合成是通過不同的建環(huán)方法，例如拆分法、不對稱氧化法等，多數(shù)方法存在路線過長，總產(chǎn)率過低等不足，較難實現(xiàn)工業(yè)化。總之，喜樹堿的來源有限，不能滿足市場需求(國際市場每年喜樹堿需求量3000kg，但是全球喜樹堿年產(chǎn)量僅600kg)，需要發(fā)現(xiàn)和研發(fā)替代資源及技術。隨著植物細胞法的建立和運用，目前有很多研究通過該方法獲得目的產(chǎn)物以及高附加值的植物次生代謝產(chǎn)物。植物細胞培養(yǎng)法是在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的組織置于液體培養(yǎng)基中進行震蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖，從而獲得大量細胞群體的一種技術。該方法具有以下優(yōu)勢：1)不受地理、季節(jié)和氣候條件的限制；2)節(jié)省土地，降低成本，生產(chǎn)周期短，可大大提高經(jīng)濟效益；3)可代替整體植株在工廠內連續(xù)生產(chǎn)所需產(chǎn)物；4)可通過添加抑制劑等使生物合成按照人的意志進行；5)可通過誘變篩選，獲得高產(chǎn)細胞株，并且可以進行特定的生物轉化獲得新的有用物質。迄今已有關于通過培養(yǎng)喜樹懸浮細胞產(chǎn)喜樹堿的報道，并且通過不同的方法使喜樹堿含量得到一定的提高，但含量提高倍率較低，通常為3～10倍，如通過添加氮源于喜樹懸浮細胞的方法來提高喜樹堿的方法，提高倍數(shù)最高位3.4倍；或通過紫外照射提高喜樹懸浮細胞中喜樹堿的產(chǎn)量，提高倍數(shù)最高為11倍。這些研究充分表明利用懸浮細胞生產(chǎn)喜樹堿成為一種可能，并且采用懸浮細胞生產(chǎn)喜樹堿無疑是解決喜樹堿原料來源的綠色途徑。但還需尋找一種使喜樹堿、10-羥基喜樹堿含量提高更多的制備方法。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有通過喜樹懸浮細胞生產(chǎn)喜樹堿和10-羥基喜樹堿存在產(chǎn)物含量低的問題，本發(fā)明提供了一種通過在喜樹懸浮細胞的培養(yǎng)過程中添加誘導因子提高喜樹堿和10-羥基喜樹堿產(chǎn)量的方法。為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：利用喜樹懸浮細胞生產(chǎn)喜樹堿和10-羥基喜樹堿的方法，包括以下步驟：(1)將喜樹懸浮細胞細胞接種到ms30液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中添加山梨糖醇；(2)收集相應的懸浮細胞和細胞培養(yǎng)液；(3)分離提取喜樹堿和10-羥基喜樹堿。進一步地，在步驟(1)中，添加濃度為10～200g/l的山梨糖醇作為誘導因子，優(yōu)選濃度為50g/l。進一步地，步驟(1)中的ms30液體培養(yǎng)基含有0.2～1mg/lnaa(萘乙酸)、0.2～1mg/lbap(6-芐基氨基嘌呤)、0.05～0.3mg/l2,4-d(2,4-二氯苯氧乙酸)和20-50mmnh4+/no3-，nh4+與no3-的摩爾比為5:1；喜樹懸浮細胞在ms30液體培養(yǎng)基中進行光照搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：光照，搖床100～150rpm，溫度25±3℃，ph5-6.5。優(yōu)選含有0.5mg/l萘乙酸、0.5mg/l6-芐基氨基嘌呤、0.1mg/l2,4-二氯苯氧乙酸和40mmnh4+/no3-的ms30液體培養(yǎng)基，所述nh4+與no3-的摩爾比為5:1；培養(yǎng)條件優(yōu)選：光照25μmolm-2s-l，搖床125rpm，溫度25±0.5℃，ph5-6.5。將收集到的懸浮細胞和細胞培養(yǎng)液混合物按常規(guī)方法分離提取即可得到喜樹堿和10-羥基喜樹堿。將收集到的懸浮細胞和細胞培養(yǎng)液混合物經(jīng)抽濾漏斗過濾至無液體滴出，分別收集濾液與濾紙上的喜樹細胞；所述濾液為細胞培養(yǎng)液，其中含有喜樹堿和10-羥基喜樹堿，將濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取，有機相于40℃減壓濃縮干燥得到培養(yǎng)液提取物；所述濾紙上的喜樹細胞經(jīng)60℃干燥研磨破碎，甲醇浸泡過夜，40℃減壓濃縮得到細胞提取物，提取物用純水溶解，乙酸乙酯萃取，有機相于40℃減壓濃縮干燥得到細胞提取物；培養(yǎng)液提取物和細胞提取物加入乙酸乙酯溶解，經(jīng)針頭過濾器過濾得到喜樹堿和10-羥基喜樹堿粗提物。喜樹懸浮細胞經(jīng)培養(yǎng)制得的喜樹堿和10-羥基喜樹堿粗提物的成分分析顯示，山梨糖醇能大幅度提高喜樹堿和10-羥基喜樹堿的產(chǎn)量，提高倍數(shù)為100～500余倍。本發(fā)明的有益效果：(1)系統(tǒng)性完整地構建了從喜樹種子到無菌幼苗，再到愈傷組織，最后到喜樹懸浮細胞的全過程，并且對不同階段的培養(yǎng)基進行優(yōu)化；(2)在構建好的喜樹懸浮細胞培養(yǎng)液中檢測到喜樹堿、10-羥基喜樹堿的產(chǎn)生；(3)與傳統(tǒng)喜樹堿和10-羥基喜樹堿的制備方法相比，本發(fā)明采用山梨糖醇作為誘導因子能100～500余倍地提高喜樹堿和10-羥基喜樹堿產(chǎn)量。(4)與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所述對象為喜樹懸浮細胞，具有生長繁殖迅速，易培養(yǎng)、發(fā)酵等優(yōu)點；利用喜樹懸浮細胞獲得喜樹堿、10-羥基喜樹堿的方法簡單易控制。具體實施方式以下對本發(fā)明的實施方式進行詳細說明。實施例一：喜樹無菌苗建立1.試驗材料1.1植物材料選取正常健康生長的喜樹果實，按照常規(guī)操作去皮、清洗、消毒。本實施例中采用先去除果實種皮，再依次用5％triton浸泡3min，無菌水反復沖洗，濃度為75％乙醇浸泡1min，1％次氯酸鈉溶液浸泡3min，無菌水沖洗10次，每次1min，最后用無菌濾紙吸除喜樹種子表面水分，待用。1.2培養(yǎng)基1/2ms固體培養(yǎng)基：1/2ms培養(yǎng)基添加0.35％瓊脂(sigmachemical,mo)，ph5.8，121℃高壓滅菌30min。2.種子接種到培養(yǎng)基將準備好的種子按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將準備好的種子接種到本例1.2節(jié)中的培養(yǎng)基上，25℃避光培養(yǎng)1周，再光照培養(yǎng)。光照培養(yǎng)條件：白光(40μmolm-2s-l)，光周期為16h，溫度25℃，待幼苗長出。實施例二：喜樹愈傷組織建立1試驗材料1.1植物材料實施例一中得到的無菌幼苗。按照常規(guī)無菌操作，用無菌手術刀將葉片切成10mm×10mm小塊，待用。1.2培養(yǎng)基7種以ms30(ms培養(yǎng)基添加30mg/l的蔗糖)為基礎培養(yǎng)基，以及不同組成和濃度的生長調節(jié)因子的固體培養(yǎng)基。如表1：表1培養(yǎng)基a-j組成成分2.無菌葉片接種到培養(yǎng)基將準備好的葉片按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將準備好的葉片接種到表1中相應的培養(yǎng)基上，溫度25℃避光培養(yǎng)5～6周，待愈傷組織長出。不同培養(yǎng)基進行3組平行實驗。3.制備喜樹愈傷組織代謝產(chǎn)物每組實驗分別取2g新鮮的愈傷組織，60℃烘干研磨破碎，甲醇浸泡過夜，過濾收集濾液，40℃減壓濃縮得到愈傷組織提取物。提取物用純水溶解，乙酸乙酯萃取，有機相于40℃減壓濃縮至干燥得到發(fā)酵液提取物，細胞提取物加3ml乙酸乙酯溶解，經(jīng)針頭濾器過濾得到代謝產(chǎn)物粗提物。4.喜樹愈傷組織代謝產(chǎn)物的hplc-dad檢測采用hplc-dad分別檢測喜樹愈傷組織的代謝產(chǎn)物。hplc-dad分析檢測條件：altimacolumnc18柱(5μm,250mm×4.6mm)，流動相a：甲醇，流動相b：水+0.1％甲酸，柱溫：35℃，流速：1ml/min；進樣量：20μl；檢測器：二極管陣列(dad)；檢測波長：254nm、266nm、373nm；梯度洗脫程序如表2所示。表2hplc-dad梯度洗脫條件時間(min)流動相a％流動相b％05951250503080203998245982在上述條件下，喜樹堿標準品的保留時間為：25.39min；10-羥基喜樹堿標準品的保留時間為：23.14min；喜樹愈傷組織提取物中喜樹堿的保留時間為：25.38min；10-羥基喜樹堿的保留時間為：23.15min。hplc-dad結果顯示，b、c培養(yǎng)基中的喜樹愈傷組織有喜樹堿產(chǎn)生，b培養(yǎng)基培養(yǎng)出的愈傷組織中喜樹堿含量較高些，從而篩選出喜樹愈傷組織培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基，結果如表3。表3不同培養(yǎng)基誘導愈傷組織生成5.喜樹愈傷組織繼代培養(yǎng)將上一步的愈傷組織按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將上一步得到的愈傷組織用無菌刀小心切割接種到b固體培養(yǎng)基，光照培養(yǎng)。光照培養(yǎng)條件：白光(40μmolm-2s-l)，光周期為16h，溫度25℃，濕度70％。每20～25天繼代一次。實施例三：喜樹懸浮細胞系建立1試驗材料1.1植物材料實施例二中得到的喜樹愈傷組織，按照常規(guī)無菌操作，用無菌手術刀切成小塊，待用。1.2培養(yǎng)基ms30液體培養(yǎng)基添加0.5mg/lnaa，2mg/lbap。2.喜樹愈傷組織接種到培養(yǎng)基將準備好的愈傷組織按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將愈傷組織接種到100ml液體培養(yǎng)基中，持續(xù)光照培養(yǎng)。光照培養(yǎng)條件：白光(25μmolm-2s-l)，溫度25℃，濕度70％，轉速125rpm。3～5天后，待培養(yǎng)液中有細胞長出，吸取5ml細胞懸浮液轉入100ml新的液體培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)，得到喜樹懸浮細胞，待用。以后每10天繼代一次。實施例四：喜樹懸浮細胞生長研究1.試驗材料1.1植物材料喜樹懸浮細胞液。1.2培養(yǎng)基ms30液體培養(yǎng)基添加0.5mg/lnaa，2mg/lbap。2.喜樹懸浮細胞接種到培養(yǎng)基將準備好的喜樹懸浮細胞按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將喜樹懸浮細胞接種到100ml本例1.2節(jié)所述的培養(yǎng)基中，持續(xù)光照培養(yǎng)。光照培養(yǎng)條件：白光(25μmolm-2s-l)，溫度25℃，濕度70％，轉速125rpm。3.喜樹懸浮細胞重量測定和代謝產(chǎn)物制備每天收集2瓶喜樹懸浮細胞培養(yǎng)液，采集天數(shù)總共為19天。培養(yǎng)液經(jīng)抽濾漏斗過濾至無液體滴出。分別收集濾液與濾紙上的喜樹細胞；將濾紙上的細胞稱重，得到細胞鮮重；所述濾液經(jīng)乙酸乙酯萃取，有機相于40℃減壓濃縮至干得到培養(yǎng)液提取物；所述細胞經(jīng)60℃干燥稱重，得到細胞干重；將干燥的細胞研磨破碎，甲醇浸泡過夜，40℃減壓濃縮得到細胞提取物，提取物用純水溶解，乙酸乙酯萃取，有機相于40℃減壓濃縮至干得到細胞提取物；培養(yǎng)液提取物或細胞提取物加入乙酸乙酯溶解，經(jīng)針頭過濾器過濾得到喜樹堿和10-羥基喜樹堿粗提物。4.喜樹懸浮細胞代謝產(chǎn)物的hplc-dad檢測方法同實施例二喜樹愈傷組織代謝產(chǎn)物的hplc-dad檢測方法。實施例五：喜樹懸浮細胞培養(yǎng)基篩選1.試驗材料1.1植物材料實施例三中得到的喜樹懸浮細胞。1.2培養(yǎng)基10種不同組分的液體培養(yǎng)基，如表4：表4ms30培養(yǎng)基(a-g)和b5、ls、ds液體培養(yǎng)基添加相應的植物生長調節(jié)因子編號培養(yǎng)基植物生長調節(jié)因子(mg/l)ams30naa(0.5)+6-bap(2)bms30naa(0.5)+6-bap(2)+sorbitol(5g)cms30naa(0.3)+6-bap(0.8)+2,4-d(0.2)dms30naa(0.5)+6-bap(0.5)+2,4-d(0.1)+40mm(nh4+/no3-5:1)ems30naa(10.74μm)fms30iaa(1)+6-bap(0.5)+artemisinicacid(10)gms30naa(2)+iaa(2)+kinetin(0.1)+(nh4)2so4(2g)hb5naa(0.5)ilsnaa(0.19)+2,4-d(0.22)+thiamine(0.4)+inositol(100)+50mmβ-cdsjdsnaa(10)+kinetin(1)其中：6-bap為6-芐基氨基嘌呤；sorbitol為山梨糖醇；artemisinicacid為青蒿酸；thiamine為硫胺；inositol為肌醇；kinetin為激動素。2.喜樹懸浮細胞接種到培養(yǎng)基將準備好的喜樹懸浮細胞按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將喜樹懸浮細胞2ml分別接種到100ml表4中相應液體培養(yǎng)基a-j中，持續(xù)光照培養(yǎng)。光照培養(yǎng)條件：白光(25μmolm-2s-l)，溫度25℃，濕度70％，轉速125rpm。3.喜樹懸浮細胞重量測定和代謝產(chǎn)物制備方法同實施例四，喜樹懸浮細胞重量測定和代謝產(chǎn)物制備。4.喜樹懸浮細胞代謝產(chǎn)物的hplc-dad檢測檢測方法同實施例二，喜樹愈傷組織代謝產(chǎn)物的hplc-dad檢測方法，最后篩選得到喜樹懸浮細胞最優(yōu)的培養(yǎng)基組成為：ms30培養(yǎng)基添加0.5mg/lnaa，0.5mg/lbap，0.1mg/l2,4-d，40mmnh4+/no3-(nh4+/no3-的摩爾比為5:1)，即d培養(yǎng)基。實施例六：誘導因子添加1.試驗材料1.1植物材料實施例三中得到的喜樹懸浮細胞。1.2培養(yǎng)基實施例五中的d培養(yǎng)基，誘導因子如表5：表5誘導因子誘導因子單位c1c2c3氯化鈷cobaltchloride(co)μm5.02550硝酸銀silvernitrate(ag)μm5.02550氯化鎘cadmiumchloride(cd)μm5.02550氯化鈣calciumchloride(ca)μm5.02550硫酸銅cuso4.5h2oμm5.02550硫酸鋰li2so4.h2oμm5.02550硫酸錳mnso4.h2oμm5.02550硝酸鈰銨ce(nh4)2(no3)6μm1005001000水楊酸(salicylicacid(sa))μm1050100茉莉酮酸甲酯(methyljasmonate(mj))μm1050100茉莉酸(jasmonicacid(ja))μm1050100酵母膏(yeastextract(ye))mgl-150100200殼聚糖(chitosan(ch))mgl-150100200山梨糖醇(sorbitol(so))gl-152550色胺(tryptamine)μm50250500斷馬錢子甙(secologanin)μm502505002.喜樹懸浮細胞接種到培養(yǎng)基及產(chǎn)物制備和測定將準備好的喜樹懸浮細胞按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將喜樹懸浮細胞2ml接種到100ml表4中的d培養(yǎng)基中，持續(xù)光照培養(yǎng)。光照培養(yǎng)條件：白光(25μmolm-2s-l)，溫度25℃，濕度70％，轉速125rpm。第3天添加表5中相應的誘導因子和對應的濃度，3組實驗。第9天、15天檢測細胞鮮重、培養(yǎng)液中喜樹堿、10-羥基喜樹堿的含量，方法同實施例四：喜樹懸浮細胞重量測定和代謝產(chǎn)物制備。結果：山梨糖醇能很好地提高喜樹懸浮細胞中喜樹堿、10-羥基喜樹堿的產(chǎn)量，分別能達到3.05mg/l和0.688mg/l，與對照組相比提高300～500倍。實施例七：不同山梨糖醇濃度對喜樹懸浮細胞中喜樹堿產(chǎn)量的影響1.試驗材料1.1植物材料實施例三中得到的喜樹懸浮細胞。1.2培養(yǎng)基采用實施例五中的d培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，誘導因子為山梨糖醇。2.喜樹懸浮細胞接種到培養(yǎng)基及產(chǎn)物制備和測定將準備好的喜樹懸浮細胞按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將6組喜樹懸浮細胞2ml分別接種到100mld培養(yǎng)基中，按實施例五的培養(yǎng)條件進行持續(xù)培養(yǎng)。第3天6組培養(yǎng)基中依次添加濃度為0、5、25、50、100和200g/l的山梨糖醇。第15天檢測細胞鮮重、培養(yǎng)液中喜樹堿、10-羥基喜樹堿的含量，方法同實施例四：喜樹懸浮細胞重量測定和代謝產(chǎn)物制備。結果：山梨糖醇添加濃度為0時為對照組，喜樹堿的產(chǎn)量為1.23μg/l，10-羥基喜樹堿的產(chǎn)量為0.57μg/l。山梨糖醇添加濃度分別為5g/l、25g/l、50g/l、100g/l和200g/l時，分別對應喜樹堿的產(chǎn)量為1.1μg/l、272μg/l、537μg/l、167μg/l和1.7μg/l，10-羥基喜樹堿的產(chǎn)量為1.35μg/l、212μg/l、294μg/l、144μg/l和6.4μg/l。實施例八：不同山梨糖醇濃度對喜樹懸浮細胞中喜樹堿產(chǎn)量的影響1.試驗材料1.1植物材料實施例三中得到的喜樹懸浮細胞。1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件如表6所示。2.喜樹懸浮細胞接種到培養(yǎng)基及產(chǎn)物制備和測定將準備好的喜樹懸浮細胞按常規(guī)無菌操作方法接種培養(yǎng)。將5組喜樹懸浮細胞2ml分別接種到100ml表6所示培養(yǎng)基、植物生長調節(jié)因子中，按表6所示培養(yǎng)條件進行持續(xù)培養(yǎng)。第3天5組培養(yǎng)基中依次添加不同濃度的山梨糖醇。第15天檢測細胞鮮重、培養(yǎng)液中喜樹堿、10-羥基喜樹堿的含量，方法同實施例四：喜樹懸浮細胞重量測定和代謝產(chǎn)物制備。實驗結果見表6。表6不同培養(yǎng)條件下添加不同濃度山梨糖醇的濃度時，喜樹堿及10-羥基喜樹堿的產(chǎn)量當前第1頁12