光甘草定Schiff堿類衍生物及其制備和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種光甘草定Schiff堿類衍生物及其制備和應(yīng)用，由光草甘定通過DMF、三氯氧磷的處理進行結(jié)構(gòu)改性后與取代苯胺在甲醇中反應(yīng)得到光甘草定Schiff堿類衍生物，并將其應(yīng)用到抗腫瘤藥物的制備，增強了Schiff堿本身具有的抗腫瘤、抗病毒的生物活性，對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，醫(yī)學(xué)意義顯著，并且制備方法簡單可行，制備時間短，實用價值顯著。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[000?]本發(fā)明涉及化合物及其制備，具體的涉及光甘草定SchifT堿類衍生物及其制備和 應(yīng)用。 光甘草定Sch i ff堿類衍生物及其制備和應(yīng)用
【背景技術(shù)】
[0002] 光甘草定是光果甘草中的主要黃酮類成分之一，1976年第一次被分離和鑒定。它 具有抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化、神經(jīng)保護、調(diào)節(jié)能量代謝、抗腫瘤、抗腎炎和皮膚增白 等多種生物活性和藥理活性，被稱為"美白黃金"。據(jù)報道，光甘草定具有很強的抗自由基氧 化作用，能夠明顯抑制體內(nèi)新陳代謝過程中所產(chǎn)生的自由基，可以有效地防止自由基氧化 細胞壁以及低密度脂蛋白（LDL)、DNA等對氧化敏感的生物大分子。
[0003] Schiff堿主要是指含有亞胺或甲亞胺特性基團（一RC = N-）的一類有機化合物， 通常SchifT堿是由胺和活性羰基縮合而成。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，席夫堿具有抑菌、殺菌、抗腫瘤、抗 病毒的生物活性。
[0004]若能夠?qū)飧什荻ǖ慕Y(jié)構(gòu)進行修飾，應(yīng)用于Sch i f f堿類衍生物的合成中去，以增 強其抗腫瘤活性，是很有意義的課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的未有將光甘草定應(yīng)用到Schiff堿類衍生物 的合成中去的問題，本發(fā)明提出了一種對腫瘤細胞有明顯的抑制作用的光甘草定Schiff?堿 類衍生物及其制備和應(yīng)用。
[0006] 技術(shù)方案:為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:光甘草定Schiff 堿類衍生物，通式為：
[0007]
[0008] 式中，R為H、鹵素、甲基、甲氧基。
[0009] 本發(fā)明還提出了上述光甘草定Schiff堿類衍生物的制備，包括以下步驟：
[0010] (1)于20mL DMF中滴加15ml三氯氧磷，冰浴，攪拌Ih后備用，向光甘草定中加入 20mL DMF，混合后緩慢滴入到備用的DMF和三氯氧磷的混合溶液中，100°C加熱回流，反應(yīng)2 小時;反應(yīng)結(jié)束后，加200mL水EA萃取，硅膠柱層析得白色固體：
[0011] 3-(8,8-dimethy1-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-2,6- dihydroxybenzal dehyde，具體反應(yīng)方程式式如下：
[0012]
[0013] (2)取步驟(1)中得到的
[0014] 3-(8,8-dimethy1-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-2,6-dihydroxybenzal dehyde IOOmg和等物質(zhì)的量的取代苯胺加到IOmL甲醇中溶解，室溫下反 應(yīng)4-6小時，析出白色固體，過濾，干燥，無水乙醇重結(jié)晶，即得到光甘草定Schiff堿類衍生 物，反應(yīng)方程式如下：
[0015]
[0016] 更進一步的，取代苯胺為苯胺、氯苯胺、溴苯胺、甲苯胺、甲氧基苯胺、中的一種。
[0017] 本發(fā)明還提出了上述光甘草定Schiff堿類衍生物的應(yīng)用，用于抗腫瘤藥物的制 備。
[0018] 有益效果:本發(fā)明提供的一種光甘草定Schiff堿類衍生物及其制備和應(yīng)用，由光 草甘定通過DMF、三氯氧磷的處理進行結(jié)構(gòu)改性后與取代苯胺在甲醇中反應(yīng)得到光甘草定 SchifT堿類衍生物，并將其應(yīng)用到抗腫瘤藥物的制備，增強了 SchifT堿本身具有的抗腫瘤、 抗病毒的生物活性，對腫瘤細胞具有明顯的抑制作用，醫(yī)學(xué)意義顯著，并且制備方法簡單可 行，制備時間短，實用價值顯著。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明：
[0020] 實施例1:
[0021]光甘草定Schiff堿類衍生物
[0022] 4-(8,8-dimethy1-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-yI )-2-((phenylimino)met hyl)benzene_l，3_diol的制備：
[0023]
[0024] (1)于20mL DMF中滴加15ml三氯氧磷，冰浴，攪拌Ih后備用，向光甘草定中加入 20mL DMF，混合后緩慢滴入到備用的DMF和三氯氧磷的混合溶液中，100°C加熱回流，反應(yīng)2 小時;反應(yīng)結(jié)束后，加200mL水EA萃取，硅膠柱層析得白色固體：
[0025] 3-(8,8-dimethy1-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-2,6-dihydroxybenzal dehyde，具體反應(yīng)方程式式如下：
[0026]
[0027] (2)取步驟（1)中得到的IOOmg
[0028] 3-(8,8-dimethy1-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-2,6-dihydroxybenzal dehyde和等物質(zhì)的量的苯胺加到IOmL甲醇中溶解，室溫下反應(yīng)4_6h，析 出白色固體，過濾，干燥，無水乙醇重結(jié)晶，得到目標(biāo)化合物，產(chǎn)率95 %，Mp 104-105 °C ; 1H NMR(300MHz,DMS0-d6)：59.37(s,lH,0H),9.11(s,lH,0H),8.36(s,1H,CH),7.97-7.95(dJ = 6.06Hz,lH,ArH),7.75-7.74(d,J=1.23Hz,lH,ArH) ,7.73(m,3H,ArH) ,6.86(d,lH J = 12.5Hz,Ar-H),6.38(d,lH ,J=10Hz,Ar-H),6.55(d,lH ,J=12.5Hz,Ar-H),6.34(d,lH J = 3Hz,Ar-H) ,6.19(dd,lH,J = 3Hz,C = CH) ,5.64(d,lH,J=12.5Hz,C = CH),4.23(d,lH J = 15Hz,CH2) ,3.92(m,lH,CH2) ,2.89(m,lH,CH) ,2.70(m,lH,CH2) ,2.70(m,lH,CH2) ,2.50(m, IH1CH2), 1.32(m, IH1CH3).MS(ESI) ：427.50(C27H25N〇4,[M+H] + ). Anal. Calcd for C27H25NO4： C,75.86；H,5.89；N,3.28%.Found:C,75.63；H,5.93；N,3.47%
[0029] 實施例2:
[0030] 光甘草定Schiff堿類衍生物
[0031 ] 2-(((4-chlorophenyl)imino)methyI)-4-(8,8-dimethy1-3,4-dihydr〇-2H,8H- pyrano[2,3-f]chromen-3-yl)benzene_l, 3-diol的制備
[0032]
[0033] 制備方法同實施例1，以對氯苯胺代替苯胺，得到目標(biāo)化合物，白色粉末，產(chǎn)率 92% ,Mpl74-175〇C；1HNMR(300MHz,DMS0-d6)：59.37(s,lH,0H),9.11(s,lH,0H),8.36(s,lH, CH) ,7.97-7.95(d,J = 6.06Hz,lH,ArH) ,7.75-7.74(d,J=1.23Hz,lH,ArH) ,7.73(m,2H, ArH) ,6.86(d, IH J = 12.5Hz, Ar-H) ,6.38(d, IH J= IOHz , Ar-H) ,6.55(d, IH J = 12.5Hz , Ar-H),6.34(d,lH ,J = 3Hz,Ar-H),6.19(dd,lH ,J = 3Hz,C = CH),5.64(d,lH ,J=12.5Hz,C = CH),4.23(d,lH,J=15Hz,CH2),3.92(m,lH,CH2),2.89(m,lH,CH),2.70(m,lH,CH2),2.70 (m,lH,CH2),2.50(m,lH,CH2),1.32(m,lH,CH3).MS(ESI)：
[0034] 461.14(C27H24ClN〇4,[M+H] + ).Anal.Calcd for C27H24ClNO4iC,70.20；H,5.24；N, 3.03% .Found：C,70.48；H,5.19；N,3.06%
[0035] 實施例3:
[0036] 光甘草定Schiff堿類衍生物
[0037] 2-(((4-bromophenyl)imino)methyI )-4-(8,8-dimethyI-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-yl)benzene_l, 3-diol的制備
[0038；
[0039]制備方法同實施例1，以對溴苯胺代替苯胺，得到目標(biāo)化合物。白色粉末，產(chǎn)率 91% ,Mpl82-183〇C；1HNMR(300MHz,DMS0-d6)：59.37(s,lH,0H),9.11(s,lH,0H),8.36(s,lH, CH) ,7.97-7.95(d,J = 6.06Hz,lH,ArH) ,7.75-7.74(d,J=1.23Hz,lH,ArH) ,7.73(m,2H, ArH) ,6.86(d, IH J = 12.5Hz, Ar-H) ,6.38(d, IH J= IOHz , Ar-H) ,6.55(d, IH J = 12.5Hz , Ar-H),6.34(d,lH ,J = 3Hz,Ar-H),6.19(dd,lH ,J = 3Hz,C = CH),5.64(d,lH ,J=12.5Hz,C = CH),4.23(d,lHJ=15Hz,CH2),3.92(m,lH,CH2),2.89(m,lH,CH),2.70(m,lH,CH2),2.70(m, IH1CH2) ,2.50(m,IH1CH2) , 1.32(m,IH,CH3).MS(ESI)：505.09(C27H24BrNO 4,[M+H]+ ) .Anal.Calcd for C27H24BrNO4:C,64.04；H,4.78；N,2.77% .Found：C,64.52；H,4.88；N, 2.43%
[0040] 實施例4:
[00411光甘草定Schiff堿類衍生物
[0042] 4-(8,8-dimethy1-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-2-((p-tolylimino)met hyl)benzene_l，3_diol的制備
[0043]
[0044] 制備方法同實施例1，以對甲苯胺代替苯胺，得到目標(biāo)化合物。白色粉末，產(chǎn)率 94% ,Mpl69-170〇C；1HNMR(300MHz,DMS0-d6)：59.37(s,lH,0H),9.11(s,lH,0H),8.36(s,lH, CH) ,7.97-7.95(d,J = 6.06Hz,lH,ArH) ,7.75-7.74(d,J=1.23Hz,lH,ArH) ,7.73(m,2H, ArH) ,6.86(d, IH J = 12.5Hz, Ar-H) ,6.38(d, IH J= IOHz , Ar-H) ,6.55(d, IH J = 12.5Hz , Ar-H),6.34(d,lH ,J = 3Hz,Ar-H),6.19(dd,lH ,J = 3Hz,C = CH),5.64(d,lH ,J=12.5Hz,C = CH),4.23(d,lH,J=15Hz,CH2),3.92(m,lH,CH2),2.89(m,lH,CH),2.70(m,lH,CH2),2.70 (m,1H,CH2),2.50(m,1H,CH2),2.36(s,1H,CH3), 1,32(m,1H,CH3),MS(ESI：441.19 (C28H27NO 4, [M+H] +). Anal. Cal cd for C28H27NO4 :C,76.17；H,6.16；N,3.17%. Found ： C, 76.56；H,6.23；N,3.08% .
[0045] 實施例5:
[0046] 光甘草定Schiff堿類衍生物
[0047] 4-(8,8-dimethyl-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-yl)-2-(((4-methoxyphen yI) imino)methyI )benzene_l, 3-diol的制備
[0048]
[0049] 制備方法同實施例1，以對甲氧基苯胺代替苯胺，得到目標(biāo)化合物。白色粉末，產(chǎn)率 92% ,Mpl89-190〇C；1HNMR(300MHz,DMS0-d6)：59.37(s,lH,0H),9.11(s,lH,0H),8.36(s,lH, CH) ,7.97-7.95(d,J = 6.06Hz,lH,ArH) ,7.75-7.74(d,J=1.23Hz,lH,ArH) ,7.73(m,2H, ArH) ,6.86(d, IH J = 12.5Hz, Ar-H) ,6.38(d, IH J= IOHz , Ar-H) ,6.55(d, IH J = 12.5Hz , Ar-H),6.34(d,lH ,J = 3Hz,Ar-H),6.19(dd,lH ,J = 3Hz,C = CH),5.64(d,lH ,J=12.5Hz,C = CH)，4.23(d，lH，J=15Hz，CH2)，3.92(m，lH，CH2)，3.16(s，3H，0CH 3)，2.89(m，lH，CH),2.70 (m, IH1CH2), 2.70(m, IH1CH2), 2.50(m, IH1CH2), 1.32(m,lH, CH3).MS(ESI：
[0050] 457.19 (C28H27NO5, [M+H] + ) .Anal .Calcd for C28H27NO5: C, 73.51 ；H, 5.95 ；N, 3.06% .Found：C,73.57；H,5.86；N,3.08% .
[0051 ] 實施例6:
[0052]光甘草定Schiff堿類衍生物對腫瘤抑制活性的研究：
[0053] 采用MTT[3-(4,5)_雙甲基-2-噻唑_(2,5)_苯基溴化四氮唑藍]法來測定光甘草定 Schiff堿類化合物對H印G2、Hela、A549的半抑制濃度，即IC50。
[0054] (1)培養(yǎng)液（以每L計算)的配制：
[0055] ①懸浮細胞:RPMI-1640培養(yǎng)粉一袋（10.4g)，新生牛血清100mL，青霉素溶液(20萬 U/mL)0.5mL，鏈霉素溶液(20萬U/mL)0.5mL，加三蒸水溶解后，用5.6 %的NaHCO3溶液調(diào)PH值 至7.2-7.4，最后定容至1000 ml，過濾滅菌；
[0056] ②貼壁細胞：培養(yǎng)液配制方法同上，同時再加入NaHC03 2.00g，HEPES 2.388。（2) D-Hanks緩沖液（以每L計算）的配制：NaC18.00g，KCl 0.40g，Na2HP〇4 · 12H2〇0.06g，KH2P〇4 0.06g，NaHC〇3 0.35g，高壓滅菌。
[0057] (3)胰蛋白酶液的配制：利用D-Hanks緩沖液配成濃度為0.5%胰蛋白酶液，過濾除 菌。
[0058] (4)測試藥液的配制:將測試樣品實施例1-5的光甘草定Schiff堿類衍生物化合物 用三蒸水溶解配成測試藥液，按實驗最高濃度的10倍配，根據(jù)化合物溶解性不同，可用三蒸 水直接溶解，或用少量DMSO助溶，再加三蒸水溶解，DMSO在培養(yǎng)液中的濃度不宜過大，加藥 后的每孔細胞懸液中DMSO的終濃度一般不超過0.05% - 0.1%，測試藥液配制完畢后保存 于-20 C冰箱中備用。
[0059] (5)細胞的培養(yǎng):為貼壁生長細胞，常規(guī)培養(yǎng)于上述貼壁細胞培養(yǎng)液內(nèi)，置37°C、 5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天傳代一次。傳代時先棄去原培養(yǎng)液，再用D-Hanks緩沖液洗 滌;然后用〇. 5 %胰蛋白酶液消化30秒左右，加入少量新鮮培養(yǎng)液終止消化;吹打，使貼壁細 胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落下來;移取適量至新鮮培養(yǎng)瓶中，再補充新鮮培養(yǎng)液至原體積(培養(yǎng)液 體積約為培養(yǎng)瓶容量的1/10)。
[0060] (6)細胞孵育：取對數(shù)生長期的上述腫瘤細胞，調(diào)細胞懸液濃度為2 X IO4個/ml。在 96孔培養(yǎng)板中每孔加細胞懸液100μΙ，置37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)24h后，分別按 設(shè)計加入藥液。
[0061 ] ( 7 )加藥:將測試藥液按照100μΜ，10μΜ，ΙμΜ，0 . ΙμΜ的濃度梯度分別加入到各個孔 中，每個濃度設(shè)6個平行孔;實驗分為藥物試驗組(分別加入不同濃度的測試藥液）、對照組 (只加培養(yǎng)液和細胞，不加測試藥液)和空白組（只加培養(yǎng)液，不加細胞和測試藥液）。將加藥 后的96孔板置于37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
[0062] (8)存活細胞的測定：在培養(yǎng)了48h后的96孔板中，每孔加 MTT 40μ1(用40yiroS配 成2.5mg/ml的MTT)。在37°C放置4h后，移去上清液。每孔加100μ1提取液（10%SDS-5%異丁 醇-0 . OlM HCl)。37°C孵育過夜，最后，利用自動酶標(biāo)儀在570nm波長處檢測各孔的光密度 咖值)。
[0063]抑制率的計算:細胞生長的抑制率按照下列公式計算：
[0064] 生長抑制率=(1-存活率）X100% = [1-(0D實驗-OD空白）/(0D對照-OD空白）]X 100% (0D實驗表示測試藥物組的平均光密度，OD對照表示對照組的平均光密度，OD空白表 示對照組的平均光密度）。
[0065]半數(shù)抑制濃度（IC5q)定義為當(dāng)50%的腫瘤細胞存活時的藥物濃度。根據(jù)測定的光 密度(0D值），制作細胞生長抑制率的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得其對應(yīng)的藥物濃度。 [0066] 實施例1-5的光甘草定Schiff堿類衍生物對HepG2、Hela、A549細胞增值的抑制作 用與目前的臨床藥物厄洛替尼的對比數(shù)據(jù)如表1所示，其中實施例1-5的光甘草定Schiff堿 類衍生物通式如下：
[0067]
[0068]
[0069]
[0070]從表1中可知，光甘草定Schiff堿類衍生物對Hela細胞和A549細胞有較好的抑制 活性，對HepG2細胞抑制不明顯。其中當(dāng)R取代基是甲氧基時對Hela細胞和A549細胞抑制活 性最好，究其原因是甲氧基是較強的給電子基團增加了光甘草定的抗癌活性，而Cl、Br、H、 均是給電子基團，因而活性較差。與臨床藥物厄洛替尼相比，實施例1-5的Schiff堿類衍生 物相對HepG2細胞、Hela細胞和A549細胞抑制活性均具有明顯的優(yōu)勢。
[0071]應(yīng)當(dāng)指出，以上【具體實施方式】僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，在 閱讀了本發(fā)明之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明的各種等價形式的修改均落于本申請所附權(quán) 利要求所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. 光甘草定Schiff堿類衍生物，通式為：式中，R為H、|^素、甲基、甲氧基。2. 如權(quán)利要求1所述的光甘草定Schiff堿類衍生物的制備，其特征在于包括以下步驟： (1) 于20mL DMF中滴加15ml三氯氧磷，冰浴，攪拌lh后備用，向光甘草定中加入20mL DMF，混合后緩慢滴入到備用的DMF和三氯氧磷的混合溶液中，100°C加熱回流，反應(yīng)2小時； 反應(yīng)結(jié)束后，加200mL水EA萃取，硅膠柱層析得白色固體： 3-(8,8-dimethyl-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-y1)-2,6-dihydroxybenzal dehyde，具體反應(yīng)方程式式如下：(2) 取步驟(1)中得到的 3-(8,8-dimethyl-3,4-dihydr〇-2H,8H-pyrano[2,3-f]chromen-3-y1)-2,6-dihydroxybenzal dehyde lOOmg和等物質(zhì)的量的取代苯胺加到10mL甲醇中溶解，室溫下反 應(yīng)4-6小時，析出白色固體，過濾，干燥，無水乙醇重結(jié)晶，得到即得到光甘草定Schiff堿類 衍生物，反應(yīng)方程式如下：3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的光甘草定Schiff堿類衍生物的制備，其特征在于取代苯胺為 苯胺、氯苯胺、溴苯胺、甲苯胺、甲氧基苯胺中的一種。4. 如權(quán)利要求1所述的光甘草定Schiff堿類衍生物的應(yīng)用，其特征在于用于抗腫瘤藥 物的制備。
【文檔編號】C07D493/04GK105859736SQ201610299250
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月6日
【發(fā)明人】石璐, 王陳茹, 袁繼文, 鐘慧, 易銘, 魏元剛, 楊永安
【申請人】江蘇耐雀生物工程技術(shù)有限公司