本發(fā)明涉及工業(yè)微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體為一種釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
：谷胱甘肽（gsh），廣泛存在于真核、原核生物細(xì)胞內(nèi)的一種三肽抗氧化劑，由l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸組成。由于活性巰基的存在，它可維持細(xì)胞氧化還原電位和防止活性氧（ros）對(duì)細(xì)胞的損傷作用。另外，還可保護(hù)細(xì)胞免受紫外線、重金屬以及多種外源性物質(zhì)侵?jǐn)_。因此，臨床上常用于抗輻射、腫瘤、氧化和衰老等預(yù)防與治療，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品和化妝品等領(lǐng)域。gsh可以通過(guò)提取法、化學(xué)法、酶法和發(fā)酵法等途徑獲取,以酶法和發(fā)酵法為主。酶促法主要是由l-谷氨酸，l-半胱氨酸、甘氨酸和atp在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteinesynthetase，gshⅰ）和谷胱甘肽合成酶（glutathionesynthetase，gshⅱ）催化下合成，而酶和atp價(jià)格都很昂貴，限制了酶促合成gsh的生產(chǎn)應(yīng)用；發(fā)酵法則是發(fā)酵液中添加l-谷氨酸、l-半胱氨酸和甘氨酸等前體氨基酸，利用酵母等微生物的野生型或基因工程菌將其轉(zhuǎn)化成gsh，與其他方法相比具有成本低、簡(jiǎn)便易控和易放大等優(yōu)點(diǎn)，且可直接利用微生物自身產(chǎn)生的atp。因此，發(fā)酵法成為目前最重要的gsh生產(chǎn)方法。發(fā)酵法生產(chǎn)gsh研究多集中在前體氨基酸添加、表面活性劑使用、乙醇濃度控制、葡萄糖流加等發(fā)酵條件和工藝優(yōu)化。葡萄糖流加能夠顯著提高發(fā)酵液中細(xì)胞密度，但發(fā)酵后期，氮源和生長(zhǎng)因子等因素限制生物量積累。通過(guò)氧化刺激對(duì)啤酒酵母發(fā)酵產(chǎn)谷胱甘肽影響研究發(fā)現(xiàn)，向發(fā)酵液中添加kmno4或h2o2，在一定程度上可改善谷胱甘肽產(chǎn)量，但瞬間氧化劑的大量添加，不僅會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，而且會(huì)消耗胞內(nèi)谷胱甘肽用于保護(hù)細(xì)胞，進(jìn)而使得谷胱甘肽產(chǎn)量迅速下降。另外，酵母胞內(nèi)atp水平也是限制gsh積累的因素之一。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽工藝，利用改良o(jì)-media培養(yǎng)基、流加糖蜜和玉米漿進(jìn)行釀酒酵母補(bǔ)料分批發(fā)酵，添加氧化刺激物kmno4緩釋顆粒，維持對(duì)酵母細(xì)胞氧化脅迫同時(shí)緩解其對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響，添加能量輔助物質(zhì)檸檬酸鈉，改善胞內(nèi)atp水平，最終獲得谷胱甘肽，本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝，具體步驟如下：a）從-80℃的凍存甘油管中挑取釀酒酵母（保藏號(hào)cgmccno.2842，該菌種已由中國(guó)專(zhuān)利“一株高產(chǎn)腺苷蛋氨酸的菌種”，專(zhuān)利號(hào)“zl200910028186.0”公開(kāi)），于ypd斜面培養(yǎng)基上劃線接菌，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)20h；然后轉(zhuǎn)接至50mlypd液體培養(yǎng)基中，于30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)20h，獲得酵母菌種培養(yǎng)物，備用；b）將酵母菌種培養(yǎng)物按體積比5%的接菌量轉(zhuǎn)接到10l發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵培養(yǎng)基為改良o(jì)-media發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃，初始ph6.0，溶解氧濃度為30%；c）自步驟b）發(fā)酵開(kāi)始起算，發(fā)酵16h后，以恒定速度流向發(fā)酵罐中流加糖蜜（1.5g/l/h）和玉米漿（0.4g/l/h），流加72h（即自發(fā)酵時(shí)起算，第16h開(kāi)始流加，第88h時(shí)停止加入糖蜜和玉米漿）,同時(shí)保持發(fā)酵液ph5.0；待發(fā)酵液中釀酒酵母細(xì)胞濕重達(dá)80g/l時(shí)，加入高錳酸鉀緩釋顆粒，以高錳酸鉀緩釋顆粒中高錳酸鉀計(jì)算，緩釋顆粒的添加量為0.15g/l，同時(shí)向發(fā)酵液中加入終濃度為4-8g/l的檸檬酸鈉；發(fā)酵120h后，發(fā)酵液中細(xì)胞濕重達(dá)到121.4g/l，gsh積累量達(dá)到5.78g/l，結(jié)束發(fā)酵；所述改良o(jì)-media發(fā)酵培養(yǎng)基：向蒸餾水中加入終濃度分別為50g/l的葡萄糖、10g/l的蛋白胨、5g/l的酵母浸粉、4g/l的磷酸二氫鉀、2g/l的磷酸氫二鉀、1.5g/l的硫酸鎂、3g/l的l-蛋氨酸、1.5g/l的l-谷氨酸、1.2g/l的l-半胱氨酸和1.5g/l的甘氨酸，調(diào)節(jié)ph6.0，115℃滅菌30min；ypd液體培養(yǎng)基：向蒸餾水中加入終濃度為20g/l的葡萄糖、10g/l的酵母浸粉和10g/l的蛋白胨，自然ph，115℃滅菌30min，即得；ypd斜面培養(yǎng)基：向ypd液體培養(yǎng)基中加入2%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）瓊脂，分裝與試管中，凝固成斜面，即得。進(jìn)一步，本發(fā)明所述釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝中，步驟c）中分別以1.5g/l/h和0.4g/l/h的速率向發(fā)酵罐中流加糖蜜和玉米漿。進(jìn)一步，本發(fā)明所述釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝中，步驟c）中保持發(fā)酵液ph5.0，是指利用氨水保持發(fā)酵液ph5.0。進(jìn)一步，本發(fā)明所述釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝中，步驟c）中加入檸檬酸鈉的終濃度為6g/l。進(jìn)一步，本發(fā)明所述釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝中，步驟c）所述高錳酸鉀緩釋顆粒是這樣獲得的：向雙蒸水加入終濃度為10-30g/l的kmno4、15-30g/l的硬脂酸、8-20g/l的聚乙二醇及10-20g/l的瓊脂粉，配置成混合液；115℃滅菌30min，無(wú)菌條件下將混合液用醫(yī)用注射器滴入無(wú)菌的冰浴二甲基硅油中，制成粒徑2.5-3mm的顆粒，用無(wú)菌紙吸去顆粒表面的二甲基硅油，即獲得所述高錳酸鉀緩釋顆粒。進(jìn)一步，本發(fā)明所述釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)谷胱甘肽的工藝中，步驟c）所述高錳酸鉀緩釋顆粒是這樣獲得的：向雙蒸水加入終濃度為15g/l的高錳酸鉀、20g/l的硬脂酸、20g/l的聚乙二醇及15g/l的瓊脂粉，配制成混合液；115℃滅菌30min，無(wú)菌條件下將混合液用醫(yī)用注射器滴入無(wú)菌的冰浴二甲基硅油中，制成粒徑3mm左右的顆粒，用無(wú)菌紙吸去顆粒表面的二甲基硅油，即獲得所述高錳酸鉀緩釋顆粒。本發(fā)明提供的高錳酸鉀緩釋顆粒是以硬脂酸、聚乙二醇和瓊脂粉為包覆材料，使得高錳酸鉀在添加到發(fā)酵液中后0-40h間緩慢釋放，起到有效維持長(zhǎng)時(shí)間氧化刺激且緩解對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而促進(jìn)gsh的積累。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)o-media發(fā)酵培養(yǎng)基改良、糖蜜和玉米漿流加，提高發(fā)酵液細(xì)胞密度；以硬脂酸、聚乙二醇和瓊脂粉為包覆材料，使得高錳酸鉀在添加到發(fā)酵液中后0-40h間緩慢釋放，將該kmno4緩釋顆粒添加發(fā)酵液中，起到有效維持長(zhǎng)時(shí)間氧化刺激同時(shí)緩解其對(duì)酵母生長(zhǎng)的影響，進(jìn)而促進(jìn)gsh的積累；通過(guò)能量輔助物質(zhì)檸檬酸鈉添加，改善胞內(nèi)atp水平，最終顯著改善谷胱甘肽積累量，降低生產(chǎn)成本。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明工藝流程圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例發(fā)酵工藝流程圖（附圖1），對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而非全部實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。實(shí)施例中涉及的培養(yǎng)基：改良o(jì)-media發(fā)酵培養(yǎng)基：向蒸餾水中加入終濃度分別為50g/l的葡萄糖、10g/l的蛋白胨、5g/l的酵母浸粉、4g/l的磷酸二氫鉀、2g/l的磷酸氫二鉀、1.5g/l的硫酸鎂、3g/l的l-蛋氨酸、1.5g/l的l-谷氨酸、1.2g/l的l-半胱氨酸和1.5g/l的甘氨酸，調(diào)節(jié)ph6.0，115℃滅菌30min；ypd液體培養(yǎng)基：向蒸餾水中加入終濃度為20g/l的葡萄糖、10g/l的酵母浸粉和10g/l的蛋白胨，自然ph，115℃滅菌30min；ypd斜面培養(yǎng)基：向ypd液體培養(yǎng)基中加入2%（質(zhì)量百分?jǐn)?shù)）瓊脂，分裝與試管中，凝固成斜面，即得；傳統(tǒng)o-media培養(yǎng)基：向蒸餾水中分別加入終濃度依次為50g/l的葡萄糖、10g/l的蛋白胨、5g/l的酵母浸粉，4g/l的磷酸二氫鉀、2g/l的磷酸氫二鉀、1.5g/l的硫酸鎂、3g/l的l-蛋氨酸，用磷酸調(diào)ph6.0，115℃滅菌30min。實(shí)施例中高錳酸鉀緩釋顆粒制備方法：向雙蒸水中加入終濃度分別為20g/l的硬脂酸、20g/l的聚乙二醇、15g/l的瓊脂粉及15g/l的kmno4，攪拌均勻，115℃滅菌30min，無(wú)菌條件下將混合液用注射器滴入無(wú)菌的冰浴二甲基硅油中，制成粒徑3mm的顆粒，用無(wú)菌紙吸去顆粒表面的二甲基硅油，即獲得高錳酸鉀緩釋顆粒。實(shí)施例中使用的釀酒酵母的保藏號(hào)為cgmccno.2842（該菌種已由中國(guó)專(zhuān)利“一株高產(chǎn)腺苷蛋氨酸的菌種”，專(zhuān)利號(hào)“zl200910028186.0”公開(kāi)）。實(shí)施例中酵母菌種培養(yǎng)物是這樣獲得的：將釀酒酵母接種于ypd斜面培養(yǎng)基中，30℃倒置培養(yǎng)20h；然后轉(zhuǎn)接至ypd液體培養(yǎng)基中，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)20h，即獲得酵母菌種培養(yǎng)物，備用。實(shí)施例中涉及的原料：糖蜜購(gòu)自蘇州富邦化工科技有限公司；玉米漿購(gòu)自aladdin公司。實(shí)施例1利用o-media培養(yǎng)基分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)本實(shí)施例采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法：首先將酵母菌種培養(yǎng)物按照體積比5%接種到裝有傳統(tǒng)o-media培養(yǎng)基的發(fā)酵罐（10l）中進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件：培養(yǎng)溫度30℃，初始ph6.0，溶解氧濃度為30%；自發(fā)酵時(shí)起算，發(fā)酵120h時(shí)，檢測(cè)發(fā)酵液中釀酒酵母細(xì)胞濕重達(dá)到45.9g/l，gsh積累量達(dá)到0.47g/l。gsh測(cè)定方法：色譜條件：gsh測(cè)定采用hplc法，高效液相色譜儀（島津lc10a），反相c18色譜柱(hanbonsci.&tech)。磷酸鹽緩沖溶液與甲醇以體積比9:1混合作為流動(dòng)相,流量1ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。樣品制備與測(cè)定：取待測(cè)樣品溶液3.0ml,于-20℃冰柜冷凍過(guò)夜,第二天沸水浴凍融10min,取出,以5000rpm轉(zhuǎn)速離心2min,取上清液作為hplc待測(cè)樣品(根據(jù)實(shí)際濃度可適當(dāng)稀釋)。（具體參見(jiàn)“發(fā)酵液中谷胱甘肽含量測(cè)定方法的比較.理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)”，陳龍等，2010,46:8.）實(shí)施例2利用改良o(jì)-media培養(yǎng)基分批發(fā)酵試驗(yàn)在實(shí)施例1基礎(chǔ)上，將發(fā)酵罐中傳統(tǒng)o-media培養(yǎng)基換成改良o(jì)-media培養(yǎng)基，其他發(fā)酵條件與實(shí)施例1相同。發(fā)酵120h時(shí)，檢測(cè)發(fā)酵液中釀酒酵母細(xì)胞濕重達(dá)到41.5g/l，gsh積累量達(dá)到0.83g/l。實(shí)施例3糖蜜補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)施例2的發(fā)酵過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中的碳源濃度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行16h，葡萄糖消耗殆盡時(shí)，因此本實(shí)施例在實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在發(fā)酵開(kāi)始后16h，向發(fā)酵液中以恒定速度流加糖蜜，流加時(shí)間為72h（即發(fā)酵開(kāi)始后88h，停止流加），其他發(fā)酵條件同實(shí)施例2。實(shí)驗(yàn)分三組，糖蜜的流加量分別為0.5g/l/h、1.5g/l/h和2.0g/l/h，依次編號(hào)1-3，發(fā)酵進(jìn)行120h后，檢測(cè)發(fā)酵液中釀酒酵母細(xì)胞濕重和gsh積累量，結(jié)果如表1所示：表1糖蜜補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號(hào)細(xì)胞濕重（g/l）gsh積累量（g/l）193.42.342101.72.92389.12.45由表1可見(jiàn)，與0.5g/l/h或2.0g/l/h的糖蜜流加速度相比，1.5g/l/h的糖蜜流加速度顯著改善發(fā)酵液中生物量和gsh積累。實(shí)施例4玉米漿補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)在實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)2（即糖蜜的流加量為1.5g/l/h）基礎(chǔ)上，進(jìn)行玉米漿補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)，在發(fā)酵開(kāi)始后16h，向發(fā)酵液中以恒定速度流加玉米漿，流加時(shí)間72h即發(fā)酵開(kāi)始后88h，停止流加，即與糖蜜同時(shí)流加，同時(shí)停止），同時(shí)以氨水控制發(fā)酵液ph5.0，其他發(fā)酵條件同實(shí)施例3.實(shí)驗(yàn)分三組，玉米漿的流加量分別為0.2g/l/h、0.4g/l/h和0.6g/l/h，依次編號(hào)1-3，待發(fā)酵進(jìn)行120h后，檢測(cè)發(fā)酵液中釀酒酵母細(xì)胞濕重和gsh積累量，結(jié)果如表2所示：表2玉米漿補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號(hào)細(xì)胞濕重（g/l）gsh積累量（g/l）1119.83.272128.43.573115.13.42由表2可見(jiàn)，與0.2g/l/h和0.6g/l/h的玉米漿流加速度相比，0.4g/l/h的玉米漿流加速度顯著改善發(fā)酵液中生物量和gsh積累。實(shí)施例5高錳酸鉀補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)在實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)2（即糖蜜流加量為1.5g/l/h，玉米漿流加量為0.4g/l/h）基礎(chǔ)上，在發(fā)酵液中釀酒酵母細(xì)胞濕重達(dá)80g/l時(shí)，向發(fā)酵液中一次性添加終濃度為0.1g/l和0.15g/l的高錳酸鉀（非緩釋顆粒），其他發(fā)酵條件同實(shí)施例4。待發(fā)酵進(jìn)行120h時(shí)，檢測(cè)發(fā)酵液中細(xì)胞濕重分別達(dá)到104.7g/l和98.3g/l，gsh積累量分別達(dá)到3.85g/l和3.23g/l?？梢?jiàn)，向發(fā)酵液中添加低濃度kmno4（如0.1g/l），可改善谷胱甘肽產(chǎn)量，但kmno4濃度過(guò)高（如0.15g/l），不僅會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)，而且會(huì)消耗胞內(nèi)谷胱甘肽用于保護(hù)細(xì)胞，進(jìn)而使得谷胱甘肽產(chǎn)量迅速下降。實(shí)施例6高錳酸鉀緩釋顆粒補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)在實(shí)施例4實(shí)驗(yàn)2（即糖蜜的流加量為1.5g/l/h，玉米漿的流加量為0.4g/l/h）的基礎(chǔ)上，在細(xì)胞濕重達(dá)80g/l時(shí)，向發(fā)酵液中一次性添加高錳酸鉀緩釋顆粒（添加量以高錳酸鉀計(jì)，添加量為0.15g/l），其他發(fā)酵條件同實(shí)施例4。待發(fā)酵進(jìn)行120h時(shí)，檢測(cè)發(fā)酵液中細(xì)胞濕重達(dá)到115.7g/l，gsh積累量達(dá)到4.92g/l。實(shí)施例7檸檬酸鈉補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)：在實(shí)施例6基礎(chǔ)上，在細(xì)胞密度達(dá)到80g/l時(shí)，向發(fā)酵液中一次性添加檸檬酸鈉，實(shí)驗(yàn)分三組進(jìn)行，所添加的檸檬酸鈉終濃度分為為4g/l、6g/l和8g/l，依次編號(hào)1-3，其他發(fā)酵條件同實(shí)施例6。待發(fā)酵進(jìn)行120h時(shí)，檢測(cè)發(fā)酵液中釀酒酵母細(xì)胞濕重和gsh積累量，結(jié)果如表3所示：表3高錳酸鉀緩釋顆粒補(bǔ)料分批實(shí)驗(yàn)結(jié)果序號(hào)細(xì)胞濕重（g/l）gsh積累量（g/l）1122.35.482121.45.783114.75.21由表3可見(jiàn)，檸檬酸鈉是作為一種能量輔助物質(zhì)添加到發(fā)酵液中。檸檬酸鈉添加量為終濃度6g/l時(shí)，顯著改善發(fā)酵液中g(shù)sh積累量。在具體的實(shí)施過(guò)程中，高錳酸鉀的緩釋顆粒還可以通過(guò)如下方法制備：向雙蒸水加入終濃度為10-30g/l的高錳酸鉀、15-30g/l的硬脂酸、8-20g/l的聚乙二醇及10-20g/l的瓊脂粉，配制成混合液；115℃滅菌30min，無(wú)菌條件下將混合液用醫(yī)用注射器滴入無(wú)菌的冰浴二甲基硅油中，獲得粒徑2.5-3mm的顆粒，用無(wú)菌紙吸去顆粒表面的二甲基硅油，獲得高錳酸鉀緩釋顆粒。在上述混合液闡明的各原料范圍內(nèi)，均可獲得本發(fā)明所述高錳酸鉀緩釋顆粒，實(shí)現(xiàn)發(fā)明之目的。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，如本實(shí)施例使用保藏號(hào)為cgmccno.2842的釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，具體實(shí)施過(guò)程中也可以使用其他株系的釀酒酵母，這些修改和替換均屬于本發(fā)明技術(shù)方案所保護(hù)的范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12