一種胞內(nèi)表達(dá)屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過對屋塵螨（Dermatophagoides?pteronyssinus）的主要過敏原Derp2基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化得到優(yōu)化后的基因mderp2，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)過敏原Derp2的重組表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148-ND和重組乳酸乳球菌L.lactis?ND（保藏號為CGMCC?No.8222）。Western?blot結(jié)果表明本發(fā)明的重組乳酸乳球菌L.lactis?ND能成功表達(dá)過敏原Derp2；同時(shí)，動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示口服重組乳酸乳球菌L.lactisND可明顯降低小鼠體內(nèi)由塵螨過敏原Derp2引發(fā)的過敏反應(yīng)。
【專利說明】—種胞內(nèi)表達(dá)屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及遺傳資源工程，具體涉及一種胞內(nèi)表達(dá)屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actis ND及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]過敏性疾病是臨床上的常見病、多發(fā)病，是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問題。其中，在引發(fā)過敏性疾病的眾多吸入性過敏原中，塵螨是導(dǎo)致呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病的重要因素之一。塵螨是一類結(jié)構(gòu)和成分復(fù)雜的生物，目前人們已從塵螨的數(shù)百種蛋白中初步鑒定出幾十種過敏原；過敏原Derp2是其中最為主要的過敏原之一，約80%_90%的塵螨過敏患者對Derp2產(chǎn)生過敏反應(yīng)。特異性免疫治療(SIT)被認(rèn)為是最有效的治療過敏的方法，但成功的免疫治療取決于高質(zhì)量的變應(yīng)原。目前，臨床上用于診斷和治療的塵螨粗提液含有大量非特異性雜質(zhì)，嚴(yán)重阻礙了塵螨過敏原試劑的臨床應(yīng)用。為獲得高質(zhì)量的變應(yīng)原，從天然產(chǎn)物中分離純化過敏原(專利申請?zhí)?200410022961.9)，操作繁復(fù)且純度不高，重復(fù)性較差；利用分子生物學(xué)技術(shù)，在大腸桿菌(專利申請?zhí)?CN201210139240.0)、酵母等表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)過敏原Derp2被認(rèn)為是一種可行的策略，但其安全性及后續(xù)過敏原的純化限制了這些表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用。
[0003]近幾年，隨著對乳酸菌性質(zhì)的不斷研究，其益生特性逐漸被人們所認(rèn)識并接受，特別是在治療一些慢性疾病和自身免疫性疾病，如過敏，腸炎等，具有普通藥物所不具備的優(yōu)勢。以乳酸菌作為表達(dá)系統(tǒng)，使抗原或其他功能性蛋白在粘膜表面進(jìn)行表達(dá)釋放，可以有效的避免傳統(tǒng)表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌)所帶來的安全隱患及后續(xù)抗原的純化問題，同時(shí)避免了在口服過程中蛋白的降解和口服耐受，更能促進(jìn)抗原或功能性蛋白被免疫系統(tǒng)所吸收等。
[0004]有關(guān)乳酸菌疫苗的研究顯示乳酸菌疫苗的效果與所要表達(dá)的蛋白形式存在著密切聯(lián)系，如外源蛋白在乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)能否成功表達(dá)、外源蛋白的表達(dá)位置等。為使塵螨過敏原Derp2在乳酸乳球菌內(nèi)的高效表達(dá)并發(fā)揮較好的預(yù)防效果，我們對Derp2天然基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了一種胞內(nèi)表達(dá)過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actisND ;同時(shí)通過動物實(shí)驗(yàn)對其在預(yù)防塵螨過敏疾病方面的效果進(jìn)行驗(yàn)證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2，提供一種胞內(nèi)表達(dá)基因優(yōu)化后的塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actisND (保藏號為CGMCCN0.8222)，提供將所述過敏原用于預(yù)防屋塵螨過敏疾病的用途，提供將所述重組乳酸乳球菌用于預(yù)防塵螨過敏疾病的用途。
[0006]一方面，本發(fā)明提供了一種基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2，該過敏原基因mderp2 的序列為 SEQIDN0.1。
[0007]所述基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原基因序列mderp2是通過對來源于屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要過敏原 Derp2 的天然基因序列 SEQ ID N0.2 進(jìn)行基因優(yōu)化后獲得的。
[0008]另一方面，本發(fā)明提供一種胞內(nèi)表達(dá)基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actis ND (保藏號為CGMCC N0.8222)，所述菌株是通過將優(yōu)化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達(dá)質(zhì)粒PNZ8148上，構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)型質(zhì)粒pNZ8148-ND，再將獲得的胞內(nèi)表達(dá)型質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.1actis NZ9000而獲得的。
[0009]另一方面，本發(fā)明提供了將所述過敏原用于預(yù)防屋塵螨過敏疾病的用途。
[0010]再一方面，本發(fā)明提供了將上述乳酸乳球菌用于預(yù)防塵螨過敏疾病的用途。
[0011]本發(fā)明涉及的表達(dá)基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌Lactococcus Iactis ND,于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址100101北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.8222
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1表示屋塵螨過敏原Derp2基因突變位點(diǎn)對照圖。
[0013]圖2表不重組乳酸乳球菌L.1actis ND中Derp2蛋白的western blot檢測。
[0014]如圖:最左側(cè)為蛋白分子Marker ；1號泳道:純化的Derp2,陽性對照；2號泳道:重組菌株L.1actis ND的細(xì)胞破碎液；3號泳道:陰性對照菌株L.1actis8148 (不含Derp2基因)細(xì)胞破碎液
[0015]圖3表示小鼠免疫的過程。
[0016]首先進(jìn)行小鼠塵螨過敏模型的構(gòu)建，具體的構(gòu)建過程分為三個(gè)階段:首先在0-4天及7-11天進(jìn)行灌胃預(yù)防處理(200 Ul菌體或生理鹽水);在第17、24、31天進(jìn)行腹腔注射Derp2/Alum (Pierce,美國)(200 y I)的混合物,使小鼠產(chǎn)生過敏反應(yīng)；最后一個(gè)階段為霧化階段，通過霧化激發(fā)器將Derp2蛋白進(jìn)行霧化，使小鼠通過自然呼吸的方式吸入體內(nèi)。
[0017]圖4表示口服重組乳酸乳球菌L.1actis ND對小鼠體內(nèi)過敏原特異性抗體的影響。Positive:陽性對照組小鼠！Negative:陰性對照組小鼠；8148:灌胃對照菌株L.1actis8148小鼠；ND:灌胃重組菌株L.1actisND小鼠
[0018]圖5-1表示肺部的組織形態(tài)觀察(HE染色)；
[0019]圖5-2表示肺部的組織形態(tài)觀察(甲苯胺藍(lán)染色)；
[0020]A:陽性對照組；B:陰性對照組；C:灌胃L.1actis8148的小鼠；D:灌胃重組菌株L.1actis ND 的小鼠
[0021]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):[0022]目前，臨床使用的塵螨變應(yīng)原制劑多為通過對人工飼養(yǎng)的塵螨進(jìn)行滅活處理后分離純化得到的混合物，其成分復(fù)雜，用于SIT治療存在著無法避免的副作用。本發(fā)明所用的乳酸菌疫苗因?yàn)槿樗峋目墒秤眯?，不用?jīng)過滅活及純化處理即可用于臨床使用。此外，乳酸菌作為一種常見的微生物，培養(yǎng)及后續(xù)操作過程簡單，成本較低，可以通過制成粉狀制劑、膠囊等形式的藥品，攜帶方便，無需特殊條件即可自行服用。相比傳統(tǒng)的皮下注射方式，乳酸菌疫苗的口服方式更易為病人所接受，同時(shí)通過口服方式更容易使機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受，縮短治療時(shí)間。實(shí)施例
[0023]下面將結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做更詳細(xì)的說明。
[0024]1、根據(jù)乳酸乳球菌基因組數(shù)據(jù)，分析乳酸乳球菌的密碼子偏好性、GC含量等參數(shù)，將來源于屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要過敏原Derp2的天然基因序列該修飾性過敏原的基因序列為SEQ ID N0.2 (genebank:AF276239.1)進(jìn)行密碼子優(yōu)化，得到可以在乳酸乳球菌內(nèi)高效表達(dá)的基因mderp2，該基因的序列為SEQ ID N0.1 ；
[0025]2、將優(yōu)化后的基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達(dá)質(zhì)粒pNZ8148 (中國科學(xué)院鐘瑾研究員惠贈)上，構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)型質(zhì)粒PNZ8148-ND，并將表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.1actis NZ9000 (中國科學(xué)院鐘瑾研究員惠贈)中，得到重組菌株L.1actis ND (保藏號為CGMCC N0.8222)
[0026]3、用Western blot檢測重組乳酸乳球菌L.1actis ND中重組蛋白Derp2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組乳酸乳球菌L.1actis ND可成功表達(dá)過敏原Derp2 ；
[0027]4、動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，相比口服生理鹽水和不含mderp2基因的乳酸乳球菌的陰性對照小鼠，口服重組乳酸乳球菌L.1actis ND可明顯降低實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)Derp2特異性的IgE的水平，并降低肺部炎癥反應(yīng)，抑制過敏疾病的發(fā)生。
[0028]技術(shù)細(xì)節(jié)
[0029]1、塵螨過敏原Derp2天然基因的優(yōu)化
[0030]參照塵螨過敏原D erp2天然基因序列SEQ ID N0.2 (GeneBank:AF276239.1)，基于乳酸乳球菌基因組的特點(diǎn)，根據(jù)GC含量、稀有密碼子使用情況等對其進(jìn)行基因優(yōu)化，得到優(yōu)化后的基因序列mderp2 (SEQ ID N0.1 )，人工合成后克隆到質(zhì)粒pUC57 (生工生物工程(上海)有限公司)上，得到pUC57-mderp2質(zhì)粒。
[0031]塵螨過敏原Derp2基因優(yōu)化后的基因序列mderp2:SEQ ID N0.1。
[0032]塵螨過敏原Derp2的原始基因序列AF276239.1:SEQ ID N0.2。
[0033]塵螨過敏原Derp2的氨基酸序列:SEQ ID N0.3。
[0034]2、乳酸乳球菌胞內(nèi)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0035]以人工合成的質(zhì)粒pUC57-mderp2 為模板，以 8N-F (cgaattcGATCAAGTTGATGTTAAAGATTGTGC)和 8N-R (gtctagaTTAATCACGAATTTTAGCATGAGTAG)為引物，采用 PCR 的方法擴(kuò)增mderp2 基因(PCR 程序?yàn)?95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s, 30 個(gè)循環(huán)；PCR 反應(yīng)體系(50 u I):5 u IdNTPs (2mM)，5 U 110XBuffer, I U ITaqE,上下游引物各 I U I,模板 I U I)并通過 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離回收目的片段，然后以內(nèi)切酶NcoI和XbaI在37°C條件下反應(yīng)3小時(shí)，通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收目的片段-mderp2;將目的片段_mderp2與經(jīng)相同內(nèi)切酶處理的質(zhì)粒片段PNZ8148進(jìn)行連接得到重組質(zhì)粒pNZ8148-ND，電轉(zhuǎn)入乳酸乳球菌NZ9000中，得到重組菌株L.1actis ND (保藏號為CGMCC N0.8222)。該菌株已于2013年9月18日交由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。
[0036]3、重組菌株L.1actis ND中過敏原Derp2的檢測
[0037]重組乳酸乳球菌L.1actis ND活化后，按1:50接種于50mlGM17培養(yǎng)基(1000ml培養(yǎng)基:胰蛋白胨5g,大豆蛋白胨5g,牛肉膏5g,酵母粉2.5g, ^ -磷酸甘油二鈉19g,維生素 C0.5g，IM MgSO4Iml,葡萄糖 5g)中(含 10 u g/ml 的氯霉素)，在 30°C培養(yǎng)至 OD600=0.5，jjPA nisin (Sigma-Aldrich)至終濃度 10ng/ml,誘導(dǎo)培養(yǎng) 6 小時(shí)后；8000rpm 離心 5min,
收集菌體。
[0038]胞內(nèi)表達(dá)蛋白的處理:50ml菌體用IOmlPBS重懸，采用超聲破碎的方法(超聲功率為300w),超2s,停8s,超聲時(shí)間為15min左右，13000rpm離心IOmin,最后米用真空濃縮的方法進(jìn)行蛋白樣品的濃縮，最后濃縮至50倍(50ml菌體到Iml懸浮液)，加入適量2xloadingbuffer 煮沸；
[0039]所有樣品取15 U I上樣，經(jīng)5-12%SDS_PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF(Millipore公司，美國)膜上，分別用Derp2特異性多克隆抗體(一抗)(京天成生物技術(shù)(北京)有限公司)及HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(二抗)(Thermo，美國)雜交后，加入eECL顯色液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)避光顯色，檢測結(jié)果如圖2所示。
[0040]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1號泳道可檢測到蛋白信號(陽性對照)，分子量大小17KDa左右；2號泳道可在相同的位置出檢測到明顯的信號，與預(yù)期的分子量大小類似，同時(shí)在3號泳道檢測不到信號 ；
[0041]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明重組乳酸乳球菌L.1actisND可以特異性表達(dá)過敏原Derp2。
[0042]4、動物實(shí)驗(yàn)
[0043]參見圖3，進(jìn)行小鼠塵螨過敏模型的構(gòu)建，具體的構(gòu)建過程分為三個(gè)階段:首先在0-4天及7-11天進(jìn)行灌胃預(yù)防處理(200 Ul菌體或生理鹽水)；在第17、24、31天進(jìn)行腹腔注射Derp2/Alum (Pierce，美國)(200 yl)的混合物，使小鼠產(chǎn)生過敏反應(yīng)；最后一個(gè)階段為霧化階段，通過霧化激發(fā)器將Derp2蛋白進(jìn)行霧化，使小鼠通過自然呼吸的方式吸入體內(nèi)。
[0044]小鼠灌胃乳酸乳球菌的制備:乳酸乳球菌活化后，按照1:50的比例接入GM17培養(yǎng)基中(加入10 U g/ml氯霉素)進(jìn)行培養(yǎng)，至OD=0.5左右，然后加入nisin至終濃度IOng/ml, 30°C培養(yǎng)6h后,8000rpm5min離心收集菌體,用預(yù)冷的滅菌的生理鹽水洗漆2遍后,加入一定體積的生理鹽水，調(diào)整菌落數(shù)為lxl01(lCFU/ml，取200iil進(jìn)行小鼠灌胃。
[0045]實(shí)驗(yàn)組的設(shè)計(jì):
[0046]陽性模型組:灌胃生理鹽水，然后腹腔注射
[0047]ND模型組和8148模型組:分別用重組菌株L.1actis ND和L.1actis8148 (空質(zhì)粒)進(jìn)行灌胃，并且進(jìn)行腹腔注射處理；
[0048]陰性模型組:灌胃生理鹽水，腹腔注射生理鹽水。
[0049]5、過敏原Derp2特異性抗體的測定
[0050]在實(shí)驗(yàn)結(jié)束處死小鼠時(shí)，取小鼠血液，然后室溫靜置2h，4000rpm離心lOmin，取上層血清，采用ELISA方法測定其中過敏原特異性抗體的濃度。
[0051]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:發(fā)現(xiàn)口服重組乳酸乳球菌L.1actisND可明顯降低小鼠體內(nèi)Derp2特異性IgE的濃度(參見圖4A)，同時(shí)提高特異性IgG2a濃度(參見圖4B)；
[0052]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明口服重組乳酸乳球菌L.1actisND可通過調(diào)整血清中特異性抗體的濃度抑制過敏反應(yīng)。
[0053](I)包被:用包被緩沖液(1000ml 含 Na2CO3L 59g ；NaHC032.93g，ph 調(diào)至 9.6)將提取的Derp2蛋白稀釋到10 y g/ml，每孔加入100 后4°C包被過夜。次日棄去孔內(nèi)液體，用PBST (1000ml0.1M的PBS緩沖液中加入lmlTween20)洗滌3次，每次3min。[0054](2)封閉:酶標(biāo)板加樣孔干燥后每孔加入IOOiU封閉液(Ig牛血清蛋白溶解到100ml的0.1MPBS緩沖液中)，37°C封閉2h，然后用同樣方法洗滌3次。
[0055](3)加樣:加IOOul適度稀釋的小鼠血清于已包被的反應(yīng)孔中，分別設(shè)置空白對照和陰性對照(PBS對照組血清)，37°C保溫1h后同樣方法洗滌。
[0056](4)加酶標(biāo)二抗:每孔加入100 μl新鮮稀釋的酶標(biāo)二抗(IgE和IgG2a)(SouthernBiotech，美國)，37°C保溫lh，用PBST洗滌2次，最后用不含Tween-20的PBS洗漆一次。
[0057](5)加底物液顯色:向每孔中加入新鮮配置的TMB底物溶液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，每孔100 μl，室溫暗處靜置反應(yīng)15min。
[0058](6)終止反應(yīng)及檢測:向各反應(yīng)孔中加入2MH2S0450 U 1，輕敲酶標(biāo)板使其均勻混合以終止反應(yīng)，然后在15min內(nèi)將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀(Thermo，美國)上，于450nm處讀取各孔的OD值。
[0059]6、肺部的組織切片
[0060]取新鮮的小鼠肺部，用生理鹽水沖洗掉多余的血液，然后放入10%的多聚甲醛中保存過夜，然后用大量的清水沖洗，將多聚甲醛沖洗干凈，然后用75%的乙醇保存，然后經(jīng)脫水、包埋及切片染色后，用光學(xué)顯微鏡觀察肺部的組織形態(tài)。
[0061]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過HE染色和甲苯胺藍(lán)染色，我們發(fā)現(xiàn)服用重組乳酸乳球菌L.1actisND的實(shí)驗(yàn)小鼠肺部內(nèi)的炎癥細(xì)胞和肥大細(xì)胞的數(shù)目要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽性對照組，參見圖5-1和5-2;
[0062]實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明口服重組乳酸乳球菌L.1actis ND可抑制炎癥細(xì)胞在炎癥部位的聚集。
[0063]結(jié)論:
[0064]動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，口服本發(fā)明的重組乳酸乳球菌L.1actis ND可通過降低小鼠血清中Derp2特異性IgE的水平及炎癥細(xì)胞在發(fā)炎部位的聚集的方式降低實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)的塵螨過敏反應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1.一種基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2，該過敏原基因mderp2的序列為SEQ ID N0.1。
2.如權(quán)利要求1所述的基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2，其特征在于所述過敏原序列是通過對來源于屋塵螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的主要過敏原Derp2的天然基因序列SEQ ID N0.2進(jìn)行基因優(yōu)化后獲得的。
3.一種胞內(nèi)表達(dá)基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌LactococcusIactis ND，于2013年9月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址100101北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCCN0.8222。
4.如權(quán)利要求3所述的胞內(nèi)表達(dá)基因優(yōu)化的屋塵螨過敏原Derp2的重組乳酸乳球菌L.1actis ND，其特征在于所述菌株是通過將優(yōu)化后的過敏原基因mderp2克隆到乳酸乳球菌的表達(dá)質(zhì)粒PNZ8148上，構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)型質(zhì)粒PNZ8148-ND，再將獲得的胞內(nèi)表達(dá)型質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入宿主菌株L.1actis NZ9000而獲得的。
5.將權(quán)利要求1或2中任意一項(xiàng)所述的過敏原用于預(yù)防屋塵螨過敏疾病的用途。
6.將權(quán)利要求3或4中任意一項(xiàng)所述的乳酸乳球菌用于預(yù)防屋塵螨過敏疾病的用途。
【文檔編號】C12N15/74GK103642813SQ201310646020
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月4日
【發(fā)明者】張秋香, 陳衛(wèi), 艾春青, 王剛, 田豐偉, 劉小鳴, 趙國忠, 趙建新, 張灝, 郭敏 申請人:江南大學(xué)