本發(fā)明涉及腫瘤基因領域，具體涉及一種用于檢測乳腺癌的引物組及檢測方法。
背景技術：
：乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占到全身各種惡性腫瘤發(fā)病率的7％-10％。乳腺癌的全球發(fā)病率一直呈上升態(tài)勢，每年約有100萬多人被診斷為乳腺癌，約50萬人死于乳腺癌，是一種嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的疾病。乳腺癌有著復雜的實體生物學特性和臨床表現(xiàn)。許多臨床和病理特征已被做為預測療效和預后，其中經(jīng)典的包括：年齡，腫瘤大小，腋窩淋巴結(jié)受累情況，血管淋巴管浸潤，組織學分級，雌激素受體狀態(tài)，孕激素受體狀態(tài)與HER-2/neu基因的表達。隨著乳腺癌的早期診斷篩查得到普及，早診斷早治療明顯改善了乳腺癌患者的預后，提高了乳腺癌患者的生存率，延長了生存時間。但并非所有乳腺癌患者都有明顯的獲益，預后較差的三陰性乳腺癌患者以及復發(fā)轉(zhuǎn)移患者都面臨著治療效果不理想，生存時間短的困境，成為乳腺癌基礎研究和臨床治療面臨的挑戰(zhàn)之一。目前乳腺癌的診斷方法包括影像學檢查，細胞病理學和組織病理學診斷。影像學檢查包括X射線、CT掃描、核磁共振檢查等，但是其效率較低并且檢測準確度不高。通常的細胞和組織病理學檢測包括細胞活檢，需要通過外科手術或者穿刺的方法從患者上獲取腫瘤組織的檢材。不但不方便，而且會對患者造成人體傷害。近來，循環(huán)腫瘤細胞(CirculatingTumorCells，CTCs)檢測的出現(xiàn)給患者的檢測帶來了新的希望。CTCs是從腫瘤病灶脫離并移位至血液中的腫瘤細胞，是惡性腫瘤患者術后復發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移的重要原因，也是導致腫瘤患者死亡的重要因素。與其他組織學標本如骨髓等相比，外周血標本容易獲取，且對患者創(chuàng)傷小，是臨床上常規(guī)檢測較為理想的標本來源。CTCs檢測有助于腫瘤的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物的療效及制定個體化治療方案。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，CTCs檢測可更加敏感地發(fā)現(xiàn)疾病的變化，且對患者沒有副作用。CTCs的檢測通常通過抽取一定體積的血液進行。檢測分為兩類，包括不捕獲(富集)直接檢測和先捕獲(富集)后檢測，其中后者為主流的檢測方法。先捕獲(富集)后檢測的方法也分為兩類，即正選和負選。正選主要是通過CTC表面標志物或細胞的物理性質(zhì)(大小、密度)進行捕獲；前者是基于免疫磁球技術和微流控芯片技術，后者是基于過濾、離心的原理。負選方法通過白細胞表面標志物間接捕獲CTC。然而基于先捕獲(富集)后檢測的方法有著明顯的缺陷。它嚴重依賴于腫瘤細胞表面標記物的表達，因此無法捕獲表面未表達腫瘤標記物的CTCs細胞。采用RT-PCR方法檢測CTCs細胞中特異性基因是CTCs細胞檢測的另外一種方式。首先抽取一定體積的血液，通過密度梯度離心的方式富集CTCs，然后通過RT-PCR的方式檢測特定基因的mRNA，以此判斷CTCs是否存在，并通過檢測CT值的變化給CTCs定量。這種方法檢測CTCs費用低，敏感度高，而且容易自動化。目前采用RT-PCR方法檢測卵巢癌CTCs的標準還沒有完全建立。通過檢測乳腺癌患者的CTCs特征基因，能夠確定乳腺癌CTCs的檢測方法和檢測標準。這些檢測方法和標準的建立有助于腫瘤患者的早期診斷、判斷患者預后、評估抗腫瘤藥物，包括NK和CAR-T免疫治療的療效及制定個體化治療方案。針對上述問題，本發(fā)明開發(fā)一種高靈敏的多基因聯(lián)合檢測的試劑盒，通過聯(lián)合檢測PR、ER、EPCAM、HER2和MUC1等5個基因?qū)崿F(xiàn)腫瘤的早期篩查或診斷。本發(fā)明設計運用靶向特異性引物組，大幅度提高檢測的靈敏度。該檢測方法的檢出率可達到95％，同時具備了靈敏度高，特異性好，快速準確等優(yōu)點。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種用于檢測乳腺癌的引物組及檢測方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：一種用于檢測乳腺癌的引物組，包含：本發(fā)明的引物組可通過以下兩種方法實現(xiàn)乳腺癌的檢測。方法1：PCR方法。(1)將權(quán)利要求1所述的5對引物分別加入到單個PCR反應管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；其中，PCR反應的每個循環(huán)的條件為94攝氏度、30s；55攝氏度、30s；72攝氏度、10s；(2)進行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應，用瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。方法2：熒光定量PCR方法(1)將權(quán)利要求1所述的5對引物分別加入到單個PCR反應管中，并均加入核酸提取物、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP；分別加入2×ChamQSYBRqPCRMasterMix，其中，PCR反應的每個循環(huán)的條件為95攝氏度、10s和60攝氏度、30s；40個循環(huán)；每管設立三個復孔；(2)進行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應，并實時檢測熒光；(3)根據(jù)熒光檢測結(jié)果計算出的Ct值，判斷是否有標志物靶基因表達于樣品中。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明通過設計特異性PCR引物，開發(fā)出用于乳腺癌早期檢測的多基因聯(lián)合檢測方法。此方法：(1)建立的PCR體系可對PR、ER、EPCAM、HER2和MUC1基因進行聯(lián)合檢測；(2)通過同時對多個基因進行檢測可使乳腺癌檢出率達到98％；(3)靈敏度高，低至1-5拷貝的基因表達水平均可檢出；(4)特異性強，正常人或非乳腺癌病人樣本不會產(chǎn)生非特異性信號；(5)檢測速度快，操作簡單，費用低廉。附圖說明圖1為實施例中健康人外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖2為實施例中非乳腺癌患者外周血樣本檢測陰性PCR圖。圖3為實施例中非乳腺癌患者癌組織樣本檢測陰性PCR圖。圖4為實施例中乳腺癌患者外周血檢測陽性PCR圖。圖5為實施例中乳腺癌患者組織檢測陽性PCR圖。圖中，M.100bpmarker；1.B2M；2.PR；3.ER；4.EPCAM；5.HER2；6.MUC1。具體實施方式本發(fā)明針對目前乳腺癌中的腫瘤驅(qū)動基因，通過聯(lián)合檢測PR、ER、EPCAM、HER2和MUC15個基因?qū)崿F(xiàn)乳腺癌的早期檢測。針對目前檢測方法靈敏度低，檢測過程復雜繁瑣，檢測所需時間長，無法滿足臨床檢測的實際需求。針對上述問題，設計出用于檢測上述5個基因的一整套特異性引物組。根據(jù)上述5個基因的參考序列設計特異性擴增引物，其PCR產(chǎn)物長度最優(yōu)是在180-200bp之間，退火溫度不高于60度，GC含量在40-60％之間，符合一般引物設計軟件的要求。通過采用實時熒光PCR反應檢測體系，實現(xiàn)多個基因聯(lián)合的高靈敏檢測，其檢測方法如下所述。本發(fā)明結(jié)合附圖和實施例作進一步的說明。如未特別指明之處，可根據(jù)本領域技術人員所熟悉的《分子可隆實驗指南》第三版(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《細胞實驗指南》(科學出版社，北京，中國，2001年)、《RNA實驗技術手冊》(科學出版社，北京，中國，2004年)、《免疫檢測技術》(科學出版社，北京，中國，1991)等實驗手冊以及本文所引用的參考文獻中所列方法來實施。其中，所用的引物可以委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1:基因選擇多項研究表明，單基因篩查敏感度約為20-60％，大部分用于腫瘤早期篩查的單個基因檢測，其檢測敏感度或特異度偏低，不能滿足臨床需要。采用多基因聯(lián)合檢測可以有效解決敏感度低的問題，提高腫瘤早期篩查和診斷的準確度。AgustiBarnadas等人(LasaA,GarciaA,AlonsoC,etal.MoleculardetectionofperipheralbloodbreastcancermRNAtranscriptsasasurrogatebiomarkerforcirculatingtumorcells[J].PloSone,2013,8(9):e74079.)同時檢測SCGB2、TFF1、TFF3、Muc1、KRT20五個基因，結(jié)果表明基因聯(lián)合檢測用于乳腺癌早期診斷的敏感度為35％。為了提高早期腫瘤的檢出率，提高腫瘤患者的治愈率，改善病人預后，我們對乳腺癌和正常組織的差異表達基因進行了篩選。我們通過大量比對實驗發(fā)現(xiàn)PR、ER、EPCAM、HER2和MUC1組成的基因組對乳腺癌具有較高的檢出率，達到98％，相對于現(xiàn)有的檢測技術，產(chǎn)生了意想不到的技術效果，具有顯著的進步。實施例2:引物篩選(1)設計引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3，具體為：利用生物信息學軟件對靶基因A-I序列進行分析，利用序列分析軟件設計特異性引物組，利用NCBI引物搜索軟件檢測各配對引物在人基因組中的特異性，分別設計出3對特異性擴增引物a1～a3、b1～b3、c1～c3、d1～d3、e1～e3；表1：PCR檢測引物(2)外周血樣品的處理收集某醫(yī)院收治并經(jīng)病理證實的乳腺癌患者外周血，清晨7點，空腹，經(jīng)肘靜脈采集新鮮血液，存放于抗凝管中，搖勻，常溫下保存≤4hr。2.1將抗凝管中的全血樣本加入等體積PBS(pH7.0)，于室溫3000rpm離心5min，去除上層血漿；2.2加入等體積氯化銨紅細胞裂解液，于室溫200rpm離心8min混勻后，以3000rpm室溫離心5min，棄去上清；2.3將下層血細胞和生理鹽水按照體積比1:2～2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2～2:1，離心力為700g，離心20～40min；2.4吸棄上清，取細胞沉淀，洗滌，即得到PBMC；2.5取PBMC用于核酸提取，多余的PBMC用RNA保護劑重懸，保存于-20度。(3)核酸的提取3.1取不多于5×105的PBMC，加入250μLBufferRLTPlus，吹打混勻；3.2將裂解液轉(zhuǎn)移至gDNA清除離心型柱中，8000×g(10,000rpm)離心30s。收集流穿液，棄離心柱；3.3加入1倍體積的70％乙醇(350μL)至流穿液中，吹打混勻；3.4將樣品轉(zhuǎn)移至RNeasyMinElute離心柱，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.5在RNeasyMinElute離心柱中加入700μLBufferRW1，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.6在RNeasyMinElute離心柱中加入500μLBufferRPE，蓋緊蓋子，8000×g(10,000rpm)離心15s，棄流穿液；3.7將RNeasyMinElute離心柱置于新的2mL收集管中，打開蓋子，全速離心5min，使乙醇揮發(fā)；3.8將RNeasyMinElute離心柱置于新的1.5mL收集管中，加入20μLRNase-freeH2O，蓋緊蓋子，全速離心1min洗脫RNA。(4)模板cDNA的獲得4.1準確測得樣品RNA濃度；4.2嚴格按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書在冰上制備反轉(zhuǎn)錄體系；成分體積5×Mix8μLRNA500ngRNase-freeH2O至40μL4.3輕柔混勻以上反應體系，并利用離心機短暫離心，55度20min，85度2min，獲得模板cDNA；(5)普通PCR擴增用TaqDNA聚合酶配置反應體系，用引物為a-e和人內(nèi)參基因(B2M)進行PCR擴增各樣品，產(chǎn)物用1％凝膠檢測；擴增體系如下：成分體積2×Mix10μLcDNA1μL引物-F0.8μL引物-R0.8μLRNase-freeH2O7.4μLPCR反應條件是95℃預變性3分鐘，1個循環(huán)；95℃變性20秒，55℃退火20秒，72℃延伸10秒，35個循環(huán)；72℃延伸7分鐘。(6)熒光實時定量PCR擴增根據(jù)設計的特異引組a-e，通過熒光定量PCR進行擴增，體系如下：成分體積2×ChamQSYBRqPCRMasterMix10μLcDNA2μL引物-F0.4μL引物-R0.4μLRNase-freeH2O7.2μLTotal20μL95℃預變性20s，1個循環(huán)；95℃10s，60℃30s，40個循環(huán)；每管設立三個復孔；根據(jù)步驟5和6的PCR結(jié)果，篩選出以下引物組，作為本發(fā)明用于檢測乳腺癌引物組。實施例3：效果驗證根據(jù)實施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對200個腫瘤樣本進行檢測。序號多基因聯(lián)合檢測檢出率1PR、ER、MUC175％2PR、ER、MUC1、HER280％3PR、ER、MUC1、HER2、EPCAM98％4PR、ER、MUC1、HER2、CK883％5PR、ER、MUC1、HER2、CK1881％6PR、ER、MUC1、HER2、CK1980％7PR、ER、MUC1、HER2、CK2082％其中，CK8的正向引物為CGCCTGGAAGGGCTGACCGA，反向引物為GTTGGCAATATCCTCGTACT；CK18的正向引物為GAGCTAGACAAGTACTGGTC，反向引物為CCTCAGGCTGTTCTCCAAGC；CK19的正向引物為AGCTGGCCTACCTGAAGAAG，反向引物為AGGCTTCAGCATCCTTCCGG；CK20的正向引物為GAAGAACTGAATAAAGACCT，反向引物為AAGGTTCTTCTGGGCCATGA。1～7號引物組的檢出率如上表所示，從表中可以看出，引物組中，隨著引物數(shù)量的增加，在一定程度上可以提高其檢出率。進一步地，通過比較3～7號引物組可以發(fā)現(xiàn)，引物組內(nèi)的組合對于檢出率的高低有重要影響。同時在相同的檢測基因數(shù)量情況下，3號引物組的檢出率高于4～7號引物組。因此，我們優(yōu)選3號引物組的基因組合用于乳腺癌的檢測。進一步通過研究發(fā)現(xiàn)，3號引物組中ER、PR是調(diào)節(jié)性腺組織生長發(fā)育的雌激素和孕激素受體，乳腺癌中ER、PR的檢測對判定患者的預后、指導臨床治療具有重要意義。HER2是一種細胞來源的癌基因，又稱原癌基因，參與細胞生長，分化調(diào)節(jié)，它的高表達與乳腺癌發(fā)生進程呈正相關。MUC1在腫瘤組織中多出現(xiàn)異常表達，在炎癥和腫瘤的進展中起著重要的作用；EPCAM的表達可提示和上皮源性惡性腫瘤細胞。由上可知，本發(fā)明并不是將5對引物進行簡單疊加組合，5對引物相鋪相成，在功能上彼此支持，使得檢出率得到大幅度提升，取得了意想不到的技術效果。綜上所述，本發(fā)明中選擇的基因涉及腫瘤的增殖、侵襲等方面，可較為全面的檢測出乳腺癌的細胞生物學特征。實施例4：特異性分析根據(jù)實施例2的篩選結(jié)果，采用下表所述的引物組對正常人外周血樣本、非乳腺癌病人的外周血和腫瘤組織樣本、乳腺癌病人的外周血和組織樣本進行檢測。圖中1-6基因分別為：1.B2M、2.PR、3.ER、4.EPCAM、5.HER2、6.MUC1。結(jié)果如圖1-5所示，從圖中可見所述的引物組在正常人外周血(圖1)、非乳腺癌病人的外周血(圖2)和腫瘤組織樣本(圖3)中均未檢測到基因的表達。在乳腺癌病人的外周血(圖4)和組織樣本(圖5)中可檢測到多個基因的表達，分別為4/5和5/5，說明本發(fā)明中所述引物組具有高度的特異性。當前第1頁1 2 3