本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的方法和系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

正常的受精卵發(fā)育而來(lái)的二倍體細(xì)胞一般含有兩個(gè)染色體組，一組來(lái)自父親(父源)，一組來(lái)自母親(母源)。通過(guò)顯微鏡觀察輔助生殖過(guò)程體外受精后16小時(shí)～18小時(shí)的合子，正常情況下一般具有兩個(gè)原核，一個(gè)雌原核和一個(gè)雄原核，即正常受精胚胎，也稱2PN胚胎。但是同時(shí)存在著1.6％～7.7％的合子只能看到一個(gè)原核，即單原核胚胎，也稱1PN胚胎。對(duì)于1PN胚胎的處理臨床上存在爭(zhēng)議，有個(gè)例報(bào)道認(rèn)為其可以進(jìn)行移植有可能出生正常嬰兒，也有研究認(rèn)為1PN的胚胎有較高比例的染色體異常和低的發(fā)育潛能。目前的普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為1PN胚胎移植風(fēng)險(xiǎn)太大，通常將1PN胚胎認(rèn)為是異常受精產(chǎn)生的，在臨床上視為廢棄胚胎，對(duì)資源造成浪費(fèi)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于此，有必要提供一種在微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的方法和系統(tǒng)。

一種微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的方法，包括以下步驟：

將單原核胚胎樣本體外培養(yǎng)至囊胚，取所述囊胚滋養(yǎng)層消化成單細(xì)胞，收集微量所述單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物；

將所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物與SNP基因芯片雜交，掃描雜交后的所述SNP基因芯片得到SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，根據(jù)所述SNP位點(diǎn)比率及所述雜合型位點(diǎn)比率計(jì)算獲得所述樣本的雜合概率；以及

將獲得的所述樣本的雜合概率與預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)所述樣本的胚胎類型進(jìn)行預(yù)分，獲得所述樣本的胚胎類型，其中，所述胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)包括純合孤雌胚胎和雜合孤雌胚胎。

一種微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：

第一擴(kuò)增裝置，用于將單原核胚胎樣本體外培養(yǎng)至囊胚，取所述囊胚滋養(yǎng)層消化成單細(xì)胞，收集微量所述單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物；

基因雜交裝置，用于將所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物與SNP基因芯片雜交，掃描雜交后的所述SNP基因芯片得到SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，根據(jù)所述SNP位點(diǎn)比率及所述雜合型位點(diǎn)比率計(jì)算獲得所述樣本的雜合概率；以及

分型裝置，將獲得的所述樣本的雜合概率與預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)所述樣本的胚胎類型進(jìn)行預(yù)分，獲得所述樣本的胚胎類型，其中，所述胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)包括純合孤雌胚胎和雜合孤雌胚胎。

上述微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的方法，通過(guò)對(duì)單原核胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞樣本進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，并將擴(kuò)增得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物與SNP基因芯片雜交獲得SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，根據(jù)SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率計(jì)算獲得樣本的雜合概率。然后將樣本的雜合概率與預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)樣本的胚胎類型進(jìn)行預(yù)分，獲得樣本的胚胎類型。通過(guò)上述方法一般僅需3個(gè)～5個(gè)的微量細(xì)胞即可實(shí)現(xiàn)對(duì)單原核胚胎胚胎干細(xì)胞樣本分型，將臨床上鑒定為單原核胚胎而視為廢棄的胚胎更加準(zhǔn)確分為純合孤雌胚胎或雜合孤雌胚胎。其中，純合孤雌胚胎和雜合孤雌胚胎均可用于建立胚胎干細(xì)胞系，兩者是研究印記基因和父母源基因組在發(fā)育過(guò)程中的作用的良好細(xì)胞模型，且在細(xì)胞替代治療中孤雌細(xì)胞系更容易獲得HLA單倍型的細(xì)胞系，在配型上有優(yōu)勢(shì)，另外可用于藥物篩選。純合孤雌胚胎干細(xì)胞兩套染色體完全相同，類似于單倍體，配型上比雜合孤雌胚胎干細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)。上述微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的方法和系統(tǒng)，通過(guò)對(duì)廢棄的胚胎進(jìn)行準(zhǔn)確的分型，提高資源的利用率。

附圖說(shuō)明

圖1為一個(gè)實(shí)方式的微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的方法的流程圖；

圖2為一個(gè)實(shí)方式的微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)框圖；

圖3為一個(gè)實(shí)方式的印記基因表達(dá)分析裝置的結(jié)構(gòu)框圖；

圖4為一個(gè)實(shí)方式的親源性分析裝置的結(jié)構(gòu)框圖；

圖5為實(shí)施例2中的實(shí)驗(yàn)樣本、實(shí)驗(yàn)對(duì)照、空白對(duì)照組經(jīng)印記基因表達(dá)分析后的印記結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面主要結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

一實(shí)施方式的微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的方法如圖1所示，該方法包括以下步驟S110～S130。

S110、將單原核胚胎樣本體外培養(yǎng)至囊胚，取所述囊胚滋養(yǎng)層消化成單細(xì)胞，收集微量單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物。

一般先通過(guò)顯微鏡觀察輔助生殖過(guò)程體外受精后16小時(shí)～18小時(shí)的合子，若合子只能看到一個(gè)原核，一般認(rèn)為是單原核胚胎，也稱1PN胚胎。該胚胎在臨床上一般視為廢棄胚胎。

本實(shí)施方式中，將臨床上鑒定為單原核胚胎的樣本體外培養(yǎng)至囊胚階段，活檢后采用激光輔助的方式切割一片滋養(yǎng)層(一般含有3個(gè)～10個(gè)細(xì)胞)，消化成單細(xì)胞，一般可采用消化酶對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行消化，消化酶例如可以是accutase細(xì)胞消化液(購(gòu)于life technology公司)。消化后在體視鏡下用毛細(xì)管玻璃針吸取微量細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體的，微量細(xì)胞一般是指能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞基因組擴(kuò)增的細(xì)胞量。本實(shí)施方式中一般收集3個(gè)～5個(gè)細(xì)胞即可。

具體的，滋養(yǎng)層細(xì)胞樣本消化成單細(xì)胞后，也可將細(xì)胞樣本保存在無(wú)菌管(例如無(wú)菌EP管)中，以便下次使用，樣本可在-20℃下一般可保存一個(gè)月。

具體的，將收集的微量單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，基因組擴(kuò)增是對(duì)樣本gDNA進(jìn)行擴(kuò)增，用于后續(xù)的芯片分析和STR分析。一般可采用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，本實(shí)施方式采用的是sigma公司W(wǎng)GA4Genome-Plex Single Cell Whole Genome Amplification試劑盒。可以理解，其他可實(shí)現(xiàn)胚胎細(xì)胞全基因組擴(kuò)增的試劑盒亦可。

具體的，單原核胚胎樣本還可以通過(guò)對(duì)孤雌胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定獲得。采用人工激活的方法獲得孤雌囊胚，若排出第二極體形成的囊胚為純合孤雌囊胚，若未排出第二極體形成的囊胚為雜合孤雌囊胚，然后分離孤雌囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)可獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系。孤雌胚胎干細(xì)胞系可培養(yǎng)在Matrigel基質(zhì)膠包被細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用mTeSR培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液。

S120、將S110中獲得的第一擴(kuò)增產(chǎn)物與SNP基因芯片雜交，掃描雜交后的SNP基因芯片得到SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，根據(jù)SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率計(jì)算獲得樣本的雜合概率。

SNP(single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態(tài)性)是指在基因組上單個(gè)核苷酸的變異，包括置換、顛換、缺失和插入。從理論上來(lái)看每一個(gè)SNP位點(diǎn)都可以有4種不同的變異形式，但實(shí)際上發(fā)生的基本只有兩種，即轉(zhuǎn)換和顛換。二者之比約為2:1。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為頻繁，而且多是C轉(zhuǎn)換為T(mén)，原因是CG中的C常為甲基化的，自發(fā)地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言,SNP是指變異頻率大于1％的單核苷酸變異。在人類基因組中大概每1000個(gè)堿基就有一個(gè)SNP，人類基因組上的SNP總量大概是3×10⁶個(gè)。第一擴(kuò)增產(chǎn)物與SNP基因芯片雜交后，由于第一擴(kuò)增產(chǎn)物和探針雜交的程度與熒光強(qiáng)度相關(guān)，因此通過(guò)激光掃描，即可根據(jù)熒光強(qiáng)弱測(cè)出被檢測(cè)序列的變異。

本實(shí)施方式中，SNP基因芯片采用的是GeneChip Mapping Nsp I 262K microarray(Affymetrix公司)，其他型號(hào)的芯片亦可。芯片掃描后，采用CNAT4.0軟件對(duì)SNP位點(diǎn)分型結(jié)果進(jìn)行分析。得到SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，再根據(jù)SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率可計(jì)算獲得樣本的雜合概率。

具體的，樣本的雜合概率＝雜合型位點(diǎn)比率/SNP位點(diǎn)比率×100％。

樣本的雜合概率可反應(yīng)樣本中基因的雜合程度，從而用于判斷胚胎樣本的類型。

S130、將S120中獲得的樣本的雜合概率與預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)樣本的胚胎類型進(jìn)行預(yù)分，獲得樣本的胚胎類型，其中，胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)包括純合孤雌胚胎和雜合孤雌胚胎。

具體的，預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)為經(jīng)過(guò)了多次檢測(cè)試驗(yàn)總結(jié)的分型標(biāo)準(zhǔn)。具體而言，預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)如下方法獲得，分別檢測(cè)多組已知胚胎類型的胚胎，獲得多組2PN胚胎的SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，計(jì)算獲得2PN胚胎的雜合概率，以及多組1PN胚胎(包括純合孤雌胚胎以及雜合孤雌胚胎)的SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，計(jì)算獲得純合孤雌胚胎的雜合概率以及雜合孤雌胚胎的雜合概率。根據(jù)多組2PN胚胎的雜合概率總結(jié)得到2PN胚胎的雜合概率范圍、純合孤雌胚胎的雜合概率范圍以及雜合孤雌胚胎的雜合概率范圍，以此作為胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)施例中參見(jiàn)的分型標(biāo)準(zhǔn)源于中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院中進(jìn)行植入前遺傳學(xué)篩查/診斷的滋養(yǎng)層細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)據(jù)。當(dāng)然，根據(jù)鑒別的需要，也可以采用外周血淋巴細(xì)胞或是其他類型細(xì)胞系。

本發(fā)明中分型標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)以及后續(xù)的在微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)了中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院倫理委員會(huì)的討論通過(guò)，并且取得了家屬的知情同意。

具體的，預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)中，胚胎細(xì)胞的雜合概率小于8％的為單原核胚胎(1PN胚胎)，進(jìn)一步的，胚胎細(xì)胞的雜合概率小于3.5％的為純合孤雌胚胎，胚胎細(xì)胞的雜合概率在3.5％～8％之間的為雜合孤雌胚胎。

當(dāng)然，預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)中還可以包括2PN胚胎雜合概率，一般的，胚胎細(xì)胞的雜合概率在10％～30％之間的為2PN胚胎。

將獲得的樣本的雜合概率與預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果即可對(duì)樣本的胚胎類型進(jìn)行預(yù)分，例如樣本的雜合概率小于8％，可鑒定其為單原核胚胎(1PN胚胎)，進(jìn)一步的，對(duì)該單原核胚胎(1PN胚胎)進(jìn)一步鑒定，若樣本的雜合概率小于3.5％的為純合孤雌胚胎，樣本的雜合概率在3.5％～8％之間的為雜合孤雌胚胎。

上述方法，可將臨床上粗略的通過(guò)顯微鏡觀察劃分成1PN胚胎(廢棄胚胎)進(jìn)一步篩選，判斷其是否為確切的1PN胚胎，并對(duì)1PN胚胎進(jìn)一步鑒定，更加準(zhǔn)確分為純合孤雌胚胎或雜合孤雌胚胎。其中，純合孤雌胚胎和雜合孤雌胚胎均可用于建立胚胎干細(xì)胞系，兩者是研究印記基因和父母源基因組在發(fā)育過(guò)程中的作用的良好細(xì)胞模型，且在細(xì)胞替代治療中孤雌細(xì)胞系更容易獲得HLA單倍型的細(xì)胞系，在配型上有優(yōu)勢(shì)，另外可用于藥物篩選。純合孤雌胚胎干細(xì)胞兩套染色體完全相同，類似于單倍體，配型上比雜合孤雌胚胎干細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)，精確分類提高資源的利用率。

在一個(gè)實(shí)施方式中，該方法還包括將步驟S130中預(yù)分結(jié)果為雜合孤雌胚胎的樣本進(jìn)行，印記基因表達(dá)分析包括以下步驟S141～S143。

S141、獲取微量雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞樣本進(jìn)行微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體的，將單原核胚胎體外培養(yǎng)至囊胚階段，活檢后采用激光輔助的方式切割一片滋養(yǎng)層(一般含有3個(gè)～10個(gè)細(xì)胞)，消化成單細(xì)胞，收集微量單細(xì)胞樣本兩份，一份進(jìn)行步驟S110的全基因組擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物。另一份可用于微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物。

一般可采用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增。微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增一般是對(duì)mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，用于后續(xù)的印記基因表達(dá)分析。雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞樣本的數(shù)量一般是指能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增的細(xì)胞量。本實(shí)施方式中一般收集3個(gè)～5個(gè)細(xì)胞即可。本實(shí)施方式中采用SMART-seq2方法進(jìn)行微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢岳斫猓渌蓪?shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增的方法可行。

S142、向S141中獲得的第二擴(kuò)增產(chǎn)物中分別加入不同的擴(kuò)增引物后進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物。

其中，擴(kuò)增引物包括用于擴(kuò)增母源表達(dá)印記基因的引物和用于擴(kuò)增父源表達(dá)印記基因的引物。

具體的，PCR反應(yīng)也稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種用于放大擴(kuò)增特定的基因片段的分子生物學(xué)技術(shù)。若胚胎細(xì)胞樣本中含有母源表達(dá)印記基因，則在母源表達(dá)印記基因的引物的作用下，其序列可得到擴(kuò)增，從而在后續(xù)表達(dá)印記分析中顯示。同理，若胚胎細(xì)胞樣本中含有父源表達(dá)印記基因，則在父源表達(dá)印記基因的引物的作用下，其序列可得到擴(kuò)增，從而在后續(xù)表達(dá)印記分析中顯示。

具體的，母源表達(dá)印記基因包括NLRP基因及UBE3A基因(泛素蛋白酶基因)，父源表達(dá)印記基因包括SNRPN基因(小核核糖核蛋白多肽N基因)及PEG3基因(父系表達(dá)基因3)。用于擴(kuò)增NLRP基因的正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，用于擴(kuò)增NLRP基因的反向引物的序列如SEQ ID No.2所示。用于擴(kuò)增UBE3A基因的正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，用于擴(kuò)增UBE3A基因的反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。用于擴(kuò)增SNRPN基因的正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，用于擴(kuò)增SNRPN基因的反向引物的序列如SEQ ID No.6所示。用于擴(kuò)增PEG3基因的正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，用于擴(kuò)增PEG3基因的反向引物的序列如SEQ ID No.8所示。

進(jìn)一步的，擴(kuò)增引物還包括用于作為內(nèi)參的引物。本實(shí)施方式中，作為內(nèi)參的引物的基因?yàn)镚APDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的基因，用于擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物的序列如SEQ ID No.9所示，用于擴(kuò)增GAPDH基因的反向引物的序列如SEQ ID No.10所示。

具體的PCR反應(yīng)條件為：95℃1分30秒；30個(gè)循環(huán)(94℃40秒，54℃～64℃40秒，72℃40秒)；72℃延伸7分鐘。

S143、對(duì)S142中獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，獲得樣本的父源表達(dá)印記信息和母源表達(dá)印記信息。

經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，若胚胎細(xì)胞樣本中含有母源表達(dá)印記基因，則在母源表達(dá)印記基因的引物的作用下，其序列可得到擴(kuò)增，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)過(guò)凝膠電泳后，通過(guò)相應(yīng)的母源抗體印記分析可顯示母源表達(dá)印記信息。若胚胎細(xì)胞樣本中含有父源表達(dá)印記基因，則在父源表達(dá)印記基因的引物的作用下，其序列可得到擴(kuò)增，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)過(guò)凝膠電泳后，通過(guò)相應(yīng)的父源抗體印記分析可顯示父源表達(dá)印記信息。一般的，若樣本經(jīng)過(guò)印記基因表達(dá)分析后，同時(shí)含有母源表達(dá)印記基因和父源表達(dá)印記基因，鑒定其可能為實(shí)際上為2PN型胚胎。通過(guò)對(duì)雜合孤雌胚胎的樣本進(jìn)行印記基因表達(dá)分析篩選，對(duì)于經(jīng)過(guò)臨床上鑒定僅有單原核胚胎(1PN胚胎)的人群來(lái)說(shuō)，可降低其胚胎移植的風(fēng)險(xiǎn)。若樣本經(jīng)過(guò)印記基因表達(dá)分析后，僅含有母源表達(dá)印記基因，鑒定其實(shí)際上為孤雌胚胎。若樣本經(jīng)過(guò)印記基因表達(dá)分析后，僅含有父源表達(dá)印記基因，鑒定其實(shí)際上為孤雄胚胎。

通過(guò)上述對(duì)雜合孤雌胚胎的樣本進(jìn)行印記基因表達(dá)分析，可進(jìn)一步鑒定雜合孤雌胚胎的類型，提高鑒定的準(zhǔn)確性。

在一個(gè)實(shí)施方式中，還包括將步驟S130中預(yù)分結(jié)果為雜合孤雌胚胎的樣本進(jìn)行親源性分析。親源性分析包括以下步驟S151～S153。

S151、獲取雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞對(duì)應(yīng)的第一擴(kuò)增產(chǎn)物，并將第一擴(kuò)增產(chǎn)物的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)擴(kuò)增，得到樣本的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息。

具體的，參見(jiàn)步驟S110將雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞對(duì)應(yīng)的第一擴(kuò)增產(chǎn)物。獲取雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞對(duì)應(yīng)的第一擴(kuò)增產(chǎn)物，并將第一擴(kuò)增產(chǎn)物的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)擴(kuò)增，得到樣本的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息。進(jìn)一步采用將全基因組擴(kuò)增得到的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)(STR位點(diǎn))擴(kuò)增，得到樣本的STR位點(diǎn)信息。本實(shí)施方式中采用powerplex16system擴(kuò)增樣本的STR位點(diǎn)。

具體的，進(jìn)行擴(kuò)增的STR位點(diǎn)的基因座可以為D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX以及FGA等。

S152、獲取雜合孤雌胚胎的樣本對(duì)應(yīng)的父源DNA和母源DNA，分別擴(kuò)增父源DNA和母源DNA的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)，得到父源DNA短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息和母源DNA短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息。

一般可采用商業(yè)化試劑盒抽提樣本對(duì)應(yīng)的雙親DNA。然后分別擴(kuò)增雙親DNA的STR位點(diǎn)，采用遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)，并數(shù)據(jù)收集檢測(cè)擴(kuò)增片段。

S153、將S151得到的樣本的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息分別與S152中得到的父源DNA短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息以及母源DNA短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息進(jìn)行比對(duì)，分析樣本的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息來(lái)源于父源或者母源。

將樣本中的STR位點(diǎn)信息分別母源DNA的STR位點(diǎn)信息以及父源DNA的STR位點(diǎn)信息進(jìn)行比對(duì)，判斷樣本中STR位點(diǎn)的雙親來(lái)源。

若經(jīng)過(guò)親源性分析后，若樣本中STR位點(diǎn)信息有部分源自父源DNA，鑒定其可能為實(shí)際上為2PN型胚胎，可將該數(shù)據(jù)作為中間結(jié)果的數(shù)據(jù)參照。若樣本中STR位點(diǎn)信息全部源自母源DNA的STR位點(diǎn)信息，則鑒定其為孤雌胚胎。若樣本中STR位點(diǎn)信息全部源自父源DNA的STR位點(diǎn)信息，則鑒定其為孤雄胚胎。

通過(guò)上述對(duì)雜合孤雌胚胎的樣本進(jìn)行親源性分析，可進(jìn)一步鑒定雜合孤雌胚胎的類型，提高鑒定的準(zhǔn)確性。

需要說(shuō)明的是，可以選擇印記基因表達(dá)分析與親源性分析兩者中的一個(gè)檢測(cè)分析，也可以兩種分析都檢測(cè)。文中的步驟標(biāo)號(hào)只是為了描述上的方便，并不知為了對(duì)步驟流程的限定，例如S151與S152的順序可調(diào)換。

上述方法，可將臨床上粗略的通過(guò)顯微鏡觀察劃分成1PN胚胎(廢棄胚胎)進(jìn)一步篩選，判斷其是否為確切的1PN胚胎，并對(duì)1PN胚胎進(jìn)一步鑒定，更加準(zhǔn)確分為純合孤雌胚胎或雜合孤雌胚胎。其中純合孤雌胚胎可用于建立孤雌胚胎干細(xì)胞系，具有藥物篩選等用途，而雜合孤雌胚胎可作為下一步精確鑒定胚胎類型的材料，提高資源的利用率。進(jìn)一步的，對(duì)于有爭(zhēng)議的胚胎(雜合孤雌胚胎)還可進(jìn)一步進(jìn)行印記基因表達(dá)分析以及親源性分析進(jìn)一步鑒定雜合孤雌胚胎的類型，提高鑒定的準(zhǔn)確性。

此外，如圖2所示，本發(fā)明還提供一種微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的系統(tǒng)10，該系統(tǒng)10包括第一擴(kuò)增裝置110、基因雜交裝置120以及分型裝置130。

第一擴(kuò)增裝置110，用于將單原核胚胎樣本體外培養(yǎng)至囊胚，取囊胚滋養(yǎng)層消化成單細(xì)胞，收集微量所述單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物。

本實(shí)施方式中，將臨床上鑒定為單原核胚胎的樣本體外培養(yǎng)至囊胚階段，活檢后采用激光輔助的方式切割一片滋養(yǎng)層(一般含有3個(gè)～10個(gè)細(xì)胞)，消化成單細(xì)胞，一般可采用消化酶對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行消化，消化酶例如可以是accutase細(xì)胞消化液(購(gòu)于life technology公司)。消化后在體視鏡下用毛細(xì)管玻璃針吸取微量細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體的，用第一擴(kuò)增裝置110進(jìn)行全基因組擴(kuò)增時(shí)，微量細(xì)胞一般是指能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞基因組擴(kuò)增的細(xì)胞量。本實(shí)施方式中一般收集3個(gè)～5個(gè)細(xì)胞即可。

具體的，單原核胚胎的樣本消化成單細(xì)胞后，也可將細(xì)胞樣本保存在無(wú)菌管(例如無(wú)菌EP管)中，以便下次使用，樣本可在-20℃下一般可保存一個(gè)月。

具體的，將收集的微量單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，一般可采用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，本實(shí)施方式采用的是sigma公司W(wǎng)GA4Genome-Plex Single Cell Whole Genome Amplification試劑盒?？梢岳斫?，其他可實(shí)現(xiàn)胚胎細(xì)胞全基因組擴(kuò)增的試劑盒亦可。

具體的，單原核胚胎樣本還可以通過(guò)對(duì)孤雌胚胎干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定獲得。采用人工激活的方法獲得孤雌囊胚，若排出第二極體形成的囊胚為純合孤雌囊胚，若未排出第二極體形成的囊胚為雜合孤雌囊胚，然后分離孤雌囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)可獲得孤雌胚胎干細(xì)胞系。孤雌胚胎干細(xì)胞系可培養(yǎng)在Matrigel基質(zhì)膠包被細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用mTeSR培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換液。

基因雜交裝置120，用于將第一擴(kuò)增產(chǎn)物與SNP基因芯片雜交，掃描雜交后的SNP基因芯片得到SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，根據(jù)SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率計(jì)算獲得樣本的雜合概率。

本實(shí)施方式中，SNP基因芯片采用的是GeneChip Mapping Nsp I 262K microarray(Affymetrix公司)，其他型號(hào)的芯片亦可。芯片掃描后，采用CNAT4.0軟件對(duì)SNP位點(diǎn)分型結(jié)果進(jìn)行分析。得到SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，再根據(jù)SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率可計(jì)算獲得樣本的雜合概率。

具體的，樣本的雜合概率＝雜合型位點(diǎn)比率/SNP位點(diǎn)比率×100％。

樣本的雜合概率可反應(yīng)樣本中基因的雜合程度，從而用于判斷胚胎樣本的類型。

分型裝置130，將獲得的樣本的雜合概率與預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果對(duì)樣本的胚胎類型進(jìn)行預(yù)分，獲得樣本的胚胎類型，其中，胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)包括純合孤雌胚胎和雜合孤雌胚胎。

本實(shí)施例中，分型裝置130內(nèi)部的分型標(biāo)準(zhǔn)源于中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院中進(jìn)行植入前遺傳學(xué)篩查/診斷的滋養(yǎng)層細(xì)胞的檢測(cè)數(shù)據(jù)。當(dāng)然，根據(jù)鑒別的需要，也可以采用外周血淋巴細(xì)胞或是其他類型細(xì)胞系。

本發(fā)明中分型標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)數(shù)據(jù)以及后續(xù)的在微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)了中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院倫理委員會(huì)的討論通過(guò)，并且取得了家屬的同意。

具體的，預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)中，胚胎細(xì)胞的雜合概率小于8％的為單原核胚胎(1PN胚胎)，進(jìn)一步的，胚胎細(xì)胞的雜合概率小于3.5％的為純合孤雌胚胎，胚胎細(xì)胞的雜合概率在3.5％～8％之間的為雜合孤雌胚胎。

當(dāng)然，預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)中還可以包括2PN胚胎雜合概率，一般的，胚胎細(xì)胞的雜合概率在10％～30％之間的為2PN胚胎。

分型裝置130將獲得的樣本的雜合概率與預(yù)設(shè)的胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果即可對(duì)樣本的胚胎類型進(jìn)行預(yù)分，例如樣本的雜合概率小于8％，可鑒定其為單原核胚胎(1PN胚胎)，進(jìn)一步的，對(duì)該單原核胚胎(1PN胚胎)進(jìn)一步鑒定，若樣本的雜合概率小于3.5％的為純合孤雌胚胎，樣本的雜合概率在3.5％～8％之間的為雜合孤雌胚胎。

上述系統(tǒng)10，可將臨床上粗略的通過(guò)顯微鏡觀察劃分成1PN胚胎(廢棄胚胎)進(jìn)一步篩選，判斷其是否為確切的1PN胚胎，并對(duì)1PN胚胎進(jìn)一步鑒定，更加準(zhǔn)確分為純合孤雌胚胎或雜合孤雌胚胎。其中純合孤雌胚胎可用于建立孤雌胚胎干細(xì)胞系，具有藥物篩選等用途，而雜合孤雌胚胎可作為下一步精確鑒定胚胎類型的材料，提高資源的利用率。

具體的，系統(tǒng)10還包括印記基因表達(dá)分析裝置140，印記基因表達(dá)分析裝置140用于將預(yù)分結(jié)果為雜合孤雌胚胎的樣本進(jìn)行印記基因表達(dá)分析。其中，如圖3所示，印記基因表達(dá)分析裝置140包括第二擴(kuò)增裝置141、PCR反應(yīng)裝置142以及凝膠電泳分析裝置143。

其中，第二擴(kuò)增裝置141，用于獲取微量雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞樣本進(jìn)行微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體的，第二擴(kuò)增裝置141可采用SMART-seq2的方法進(jìn)行微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，得到第二擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢岳斫?，其他可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增的方法可行。

PCR反應(yīng)裝置142，用于向第二擴(kuò)增產(chǎn)物中分別加入不同的擴(kuò)增引物后進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到PCR反應(yīng)產(chǎn)物，其中，擴(kuò)增引物包括用于擴(kuò)增母源表達(dá)印記基因的引物和用于擴(kuò)增父源表達(dá)印記基因的引物。

擴(kuò)增引物包括用于擴(kuò)增母源表達(dá)印記基因的引物和用于擴(kuò)增父源表達(dá)印記基因的引物。具體的，母源表達(dá)印記基因包括NLRP基因及UBE3A基因(泛素蛋白酶基因)，父源表達(dá)印記基因包括SNRPN基因(小核核糖核蛋白多肽N基因)及PEG3(父系表達(dá)基因3)基因。用于擴(kuò)增NLRP基因的正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，用于擴(kuò)增NLRP基因的反向引物的序列如SEQ ID No.2所示。用于擴(kuò)增UBE3A基因的正向引物的序列如SEQ ID No.3所示，用于擴(kuò)增UBE3A基因的反向引物的序列如SEQ ID No.4所示。用于擴(kuò)增SNRPN基因的正向引物的序列如SEQ ID No.5所示，用于擴(kuò)增SNRPN基因的反向引物的序列如SEQ ID No.6所示。用于擴(kuò)增PEG3基因的正向引物的序列如SEQ ID No.7所示，用于擴(kuò)增PEG3基因的反向引物的序列如SEQ ID No.8所示。

進(jìn)一步的，擴(kuò)增引物還包括用于作為內(nèi)參的引物。本實(shí)施方式中，作為內(nèi)參的引物的基因?yàn)镚APDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)的基因，用于擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物的序列如SEQ ID No.9所示，用于擴(kuò)增GAPDH基因的反向引物的序列如SEQ ID No.10所示。

經(jīng)驗(yàn)證，上述引物SEQ ID No.1～SEQ ID No.10，使得對(duì)應(yīng)的基因片段擴(kuò)增效率較高。

具體的PCR反應(yīng)裝置142用于反應(yīng)時(shí)，PCR反應(yīng)條件為：95℃1分30秒；30個(gè)循環(huán)(94℃40秒，54℃～64℃40秒，72℃40秒)；72℃延伸7分鐘。

凝膠電泳分析裝置143，用于對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，獲得樣本的父源表達(dá)印記信息和母源表達(dá)印記信息。

通過(guò)印記基因表達(dá)分析裝置140，可進(jìn)一步鑒定雜合孤雌胚胎的類型，提高鑒定的準(zhǔn)確性。

在一個(gè)實(shí)施方式中，系統(tǒng)10還包括親源性分析裝置150，親源性分析裝置150用于將預(yù)分結(jié)果為雜合孤雌胚胎的樣本進(jìn)行親源性分析。其中，如圖4所示親源性分析裝置150包括第三擴(kuò)增裝置151、父源和母源序列獲取裝置152以及比對(duì)裝置153。

其中，第三擴(kuò)增裝置151，用于獲取雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞對(duì)應(yīng)的第一擴(kuò)增產(chǎn)物，并將第一擴(kuò)增產(chǎn)物的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)擴(kuò)增，得到樣本的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息。

具體的，第一擴(kuò)增裝置S110雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞對(duì)應(yīng)的第一擴(kuò)增產(chǎn)物。第三擴(kuò)增裝置151將第一擴(kuò)增產(chǎn)物的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)擴(kuò)增，得到樣本的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息。進(jìn)一步采用將全基因組擴(kuò)增得到的第一擴(kuò)增產(chǎn)物的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)(STR位點(diǎn))擴(kuò)增，得到樣本的STR位點(diǎn)信息。本實(shí)施方式中采用powerplex16system擴(kuò)增樣本的STR位點(diǎn)。

具體的，進(jìn)行擴(kuò)增的STR位點(diǎn)的基因座可以為D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX以及FGA等。

父源和母源序列獲取裝置152，用于獲取雜合孤雌胚胎的樣本對(duì)應(yīng)的父源DNA和母源DNA，分別擴(kuò)增父源DNA和母源DNA的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)，得到父源DNA短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息和母源DNA短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息。

一般的，源和母源序列獲取裝置152中包括商業(yè)化試劑盒，采用商業(yè)化試劑盒抽提樣本對(duì)應(yīng)的雙親DNA。然后分別擴(kuò)增雙親DNA的STR位點(diǎn)，采用遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)，并數(shù)據(jù)收集檢測(cè)擴(kuò)增片段。

比對(duì)裝置153，用于將樣本的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息分別與父源DNA短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息以及母源DNA短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息進(jìn)行比對(duì)，分析樣本的短串聯(lián)重復(fù)序列位點(diǎn)信息來(lái)源于父源或者母源。

比對(duì)裝置153將樣本中的STR位點(diǎn)信息分別母源DNA的STR位點(diǎn)信息以及父源DNA的STR位點(diǎn)信息進(jìn)行比對(duì)，判斷樣本中STR位點(diǎn)的雙親來(lái)源。

若經(jīng)過(guò)親源性分析后，若樣本中STR位點(diǎn)信息有部分源自父源DNA，鑒定其可能為實(shí)際上為2PN型胚胎，可將該數(shù)據(jù)作為中間結(jié)果的數(shù)據(jù)參照。若樣本中STR位點(diǎn)信息全部源自母源DNA的STR位點(diǎn)信息，則鑒定其為孤雌胚胎。若樣本中STR位點(diǎn)信息全部源自父源DNA的STR位點(diǎn)信息，則鑒定其為孤雄胚胎。

通過(guò)親源性分析裝置150可進(jìn)一步鑒定雜合孤雌胚胎的類型，提高鑒定的準(zhǔn)確性。

上述系統(tǒng)10，可將臨床上粗略的通過(guò)顯微鏡觀察劃分成1PN胚胎(廢棄胚胎)進(jìn)一步篩選，判斷其是否為確切的1PN胚胎，并對(duì)1PN胚胎進(jìn)一步鑒定，更加準(zhǔn)確分為純合孤雌胚胎或雜合孤雌胚胎。其中，純合孤雌胚胎和雜合孤雌胚胎均可用于建立胚胎干細(xì)胞系，兩者是研究印記基因和父母源基因組在發(fā)育過(guò)程中的作用的良好細(xì)胞模型，且在細(xì)胞替代治療中孤雌細(xì)胞系更容易獲得HLA單倍型的細(xì)胞系，在配型上有優(yōu)勢(shì)，另外可用于藥物篩選。純合孤雌胚胎干細(xì)胞兩套染色體完全相同，類似于單倍體，配型上比雜合孤雌胚胎干細(xì)胞更有優(yōu)勢(shì)。進(jìn)一步的，上述系統(tǒng)10還包括印記基因表達(dá)分析裝置140及親源性分析裝置150，可用于對(duì)于有爭(zhēng)議的胚胎(雜合孤雌胚胎)還可進(jìn)一步進(jìn)行印記基因表達(dá)分析以及親源性分析進(jìn)一步鑒定雜合孤雌胚胎的類型，提高鑒定的準(zhǔn)確性。

以下為具體實(shí)施例。

如無(wú)特別說(shuō)明，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件。

主要實(shí)驗(yàn)儀器及用品：

主要儀器：電泳槽(北京六一生物科技有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(VILBER LOURMET)、基因芯片系統(tǒng)(Affymetrix，Scanner 3000 7G)、二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Forma公司)、倒置DIC顯微鏡TS 100、生物安全柜(海爾公司)、離心機(jī)(Eppendorf)、PCR儀(Eppendorf)；毛細(xì)玻璃管。

培養(yǎng)基：mTeSR培養(yǎng)基(上海拜力生物科技有限公司(StemCell公司)產(chǎn)品)、Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司產(chǎn)品)；

實(shí)施例1

建立胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)

分別檢測(cè)多組已知胚胎類型的胚胎，獲得多組2PN胚胎的SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，計(jì)算獲得2PN胚胎的雜合概率，以及多組1PN胚胎(包括純合孤雌胚胎以及雜合孤雌胚胎)的SNP位點(diǎn)比率及雜合型位點(diǎn)比率，計(jì)算獲得純合孤雌胚胎的雜合概率以及雜合孤雌胚胎的雜合概率。具體的SNP基因芯片采用的是GeneChip Mapping Nsp I 262K microarray(Affymetrix公司)，其他型號(hào)的芯片亦可。芯片掃描后，采用CNAT 4.0軟件對(duì)SNP位點(diǎn)分型結(jié)果進(jìn)行分析。雜合概率＝雜合型位點(diǎn)比率/SNP位點(diǎn)比率×100％。根據(jù)多組2PN胚胎的雜合概率總結(jié)得到2PN胚胎的雜合概率范圍、純合孤雌胚胎的雜合概率范圍以及雜合孤雌胚胎的雜合概率范圍，以此作為胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)。部分檢測(cè)結(jié)果如表1所示。

表1：不同類型胚胎通過(guò)SNP檢測(cè)得到的雜合概率

注意表1中僅列出部分樣本SNP001～SNP0217的檢測(cè)結(jié)果，實(shí)際建立胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)的過(guò)程中還可進(jìn)行更多樣本的測(cè)試，以提高可信度。本申請(qǐng)中雜合度信息所用的樣本SNP001～SNP0217來(lái)源于中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院中進(jìn)行植入前遺傳學(xué)篩查/診斷的滋養(yǎng)層細(xì)胞。由表1可知，正常受精2PN樣本雜合性SNP位點(diǎn)所占百分比范圍為18.44％±4.18％，而純合單性生殖的樣本為2.60％±0.80％，雜合單性生殖的樣本為6.78±1.00％，三者之間有顯著性差異。本建立胚胎分型標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)胚胎細(xì)胞的雜合概率小于8％的為單原核胚胎(1PN胚胎)，進(jìn)一步的，胚胎細(xì)胞的雜合概率小于3.5％的為純合孤雌胚胎，胚胎細(xì)胞的雜合概率在3.5％～8％之間的為雜合孤雌胚胎。胚胎細(xì)胞的雜合概率在10％～30％之間的為2PN胚胎。

實(shí)施例2

印記基因表達(dá)分析

收集3個(gè)～5個(gè)經(jīng)SNP檢測(cè)預(yù)分結(jié)果為雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞樣本SNP0215，取其對(duì)應(yīng)的由滋養(yǎng)層消化獲得的單細(xì)胞，采用SMART-seq2技術(shù)進(jìn)行微量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組擴(kuò)增，擴(kuò)增以后采用PCR的方法進(jìn)行印記基因表達(dá)分析。PCR擴(kuò)增時(shí)加入分別加入不同的擴(kuò)增引物后進(jìn)行PCR反應(yīng)。具體為用于擴(kuò)增母源表達(dá)印記基因NLRP2的正反引物，用于擴(kuò)增UBE3A的正反引物。用于擴(kuò)增父源表達(dá)印記基因SNRPN的正反引物，用于擴(kuò)增PEG3的正反引物。以及作為內(nèi)參的GAPDH的正反引物。PCR反應(yīng)條件：95℃1分30秒；30個(gè)循環(huán)(94℃40秒，54℃-64℃40秒，72℃40秒)；72℃延伸7分鐘。將獲得的PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分析，分別加入相應(yīng)的母源抗體、父源抗體以內(nèi)參抗體進(jìn)行印記分析，凝膠成像系統(tǒng)顯示得到結(jié)果如圖5所示。其中，標(biāo)號(hào)1的垂直對(duì)下去的條帶表示本實(shí)施例中樣本的印記，標(biāo)號(hào)2的垂直對(duì)下去的條帶表示實(shí)驗(yàn)對(duì)照(采用正常2PN胚胎擴(kuò)增后)的印記，標(biāo)號(hào)3的垂直對(duì)下去的條帶表示空白對(duì)照(無(wú)DNA底物擴(kuò)增后)的印記。從圖5以看出，通過(guò)印記基因表達(dá)分析其表達(dá)母源表達(dá)印記基因，不表達(dá)父源表達(dá)印記基因，因此進(jìn)一步鑒定其為該1PN胚胎樣本為孤雌樣本。

實(shí)施例3

STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)位點(diǎn)親源性分析

收集3個(gè)～5個(gè)經(jīng)SNP檢測(cè)預(yù)分結(jié)果為雜合孤雌胚胎的單細(xì)胞樣本SNP0215取其對(duì)應(yīng)地采用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行全基因組擴(kuò)增獲得的第一擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行STR位點(diǎn)擴(kuò)增。用試劑盒(qiagen，51304)抽提樣本對(duì)應(yīng)的雙親DNA。本文中采用powerplex16system擴(kuò)增STR位點(diǎn)，分別對(duì)以下16個(gè)基因座基因(D3S1358、TH01、D21S11、D18S51、Penta E、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、Amelogenin、vWA、D8S1179、TPOX以及FGA)進(jìn)行擴(kuò)增。使用ABI3130型遺傳分析儀進(jìn)行檢測(cè)。進(jìn)一步使用version3.0版本數(shù)據(jù)收集軟件，檢測(cè)擴(kuò)增片段，結(jié)果如表2所示。

表2：母源、父源以及樣本的STR位點(diǎn)分析結(jié)果

其中/代表未獲得相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果

如表2為采用雜合度判斷兩性生殖的樣本，進(jìn)行STR分析發(fā)現(xiàn)其共擴(kuò)增出來(lái)的12個(gè)STR，其中D21S11,vWA和D7S820這3個(gè)位點(diǎn)明確僅存在母本來(lái)源的STR，該結(jié)果提示該1PN樣本極有可能不含父本來(lái)源的STR，可能實(shí)際上為1PN雜合型胚胎。

以上實(shí)施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡(jiǎn)潔，未對(duì)上述實(shí)施例中的各個(gè)技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說(shuō)明書(shū)記載的范圍。

以上實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南光琇高新生命科技有限公司

<120> 微量細(xì)胞水平鑒別單原核胚胎類型的方法和系統(tǒng)

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增NLRP基因的正向引物

<400> 1

tggaactgcg acataacta 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增NLRP基因的反向引物

<400> 2

cacaaccaca gacatctca 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增UBE3A基因的正向引物

<400> 3

ccacagtatg tcgtcttca 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增UBE3A基因的反向引物

<400> 4

gcaataggct tgactacca 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增SNRPN基因的正向引物

<400> 5

gatactggca ttgctcgggt 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增SNRPN基因的反向引物

<400> 6

tccagcaata ctggcagtcg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增PEG3基因的正向引物

<400> 7

tccccaccat ccaaagacat a 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增PEG3基因的反向引物

<400> 8

gcacaccaat ggagacacac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增GAPDH基因的正向引物

<400> 9

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增GAPDH基因的反向引物

<400> 10

ccaccaccct gttgctgta 19