本發(fā)明涉及分子遺傳學領(lǐng)域，具體來說是一種人類Y染色體29個STR基因座的熒光標記復合擴增試劑盒。
背景技術(shù)：
：短串聯(lián)重復序列基因座(ShortTandemRepeat，STR)遺傳標記又稱微衛(wèi)星DNA，其廣泛存在于原核及真核生物基因組中，是一類由2-6個核苷酸為重復單元組成的幾十至一百多個的核苷酸重復序列,不同數(shù)目的核心序列呈中聯(lián)重復排列,而長度呈現(xiàn)多態(tài)性,根據(jù)兩端保守性序列，設(shè)計引物，進行PCR，然后通過聚丙烯酰胺、瓊脂糖凝膠電泳或毛細管電泳等檢測STR遺傳標記的多態(tài)性,STR標記與其他遺傳標記物相比，STR基因座片段小、容易擴增,更適用于微量和降解檢材，各基因座的擴增條件相近而能夠復合擴增,因而具有快速、高效、準確、靈敏、信息量大等優(yōu)點,尤其是在建立DNA數(shù)據(jù)庫方面，與以往RFLP等技術(shù)相比，STR復合擴増技術(shù)具有極大的優(yōu)越性。Y染色體STR遺傳標記是指存在于人類Y染色體非重組區(qū)域的短串聯(lián)重復序列,目前，以各種形式確認并命名的Y-STR基因座己有220多個，將己發(fā)現(xiàn)的Y染色體STR遺傳標記與常染色體STR遺傳標記相比，大多數(shù)Y染色體STR遺傳標記具有復雜重復結(jié)構(gòu)，含有兩種或兩種以上的不同重復單位，群體中個體的核心重復序列或重復次數(shù)不同，形成群體遺傳多態(tài)性,Y染色體STR遺傳標記具有男性特有、父系遺傳及單倍型造傳等三大特征，將其獨特性與STR位點分型檢測的優(yōu)越性相結(jié)合，可進行法醫(yī)學個體識別、親子鑒定及DNA家譜構(gòu)建等。法醫(yī)上將突變率高于1%的基因座稱為快速突變基因座(RapidlyMutatingY-STR),快速突變基因座具有較高的相關(guān)男性區(qū)分能力，而且一般具有較高的多態(tài)性,但基因座突變率較高會干擾某些情況的Y-STR家系排査。目前法醫(yī)上利用Y-STR進行建庫,主要功能是家系排査,縮小嫌疑人范圍，而非認定嫌疑人,在中國,特別是農(nóng)村，主要是家族聚居的方式,在Y-STR建庫的實際操作過程中，往往只對一個大家族中一個或者幾個成員進行采樣建庫,這樣在花費較小的情況下就能利用Y-STR快速縮小偵査范圍，然后通過比對常染色體STR,對嫌疑人進行認定,由于Y-STR建庫釆樣的一個或幾個人即代表了整個家系的Y-STR信息，這就存在一種不利的情況：嫌疑人屬于此家系一員，但與建庫對象Y-STR有3個或更多基因座分型不一致，此時容易將嫌疑人所屬的真實家系排除,如果建庫試劑盒中快速突變基因座較多，那么這種可能性會變得非常高,另一方面，由于Y-STR建庫主要目的不是認定嫌疑人，不需要區(qū)分相關(guān)男性，因而快速突變基因座的優(yōu)勢在這里用處不大,所以，不建議在這種情況下使用快速突變率的基因座,然而，低突變率基因座往往多態(tài)性較低，不利于家系之間的區(qū)分,因此,需要基因座的數(shù)量要多，同時基因座的多態(tài)性要高，以保證Y-STR試劑金具有足夠高的整體多態(tài)性。目前市場上主流的商品化試劑盒通常采用的是五色熒光檢測技術(shù),但隨著Y-STR建庫市場的擴大,現(xiàn)有的Y-STR試劑盒已無法滿足目前市場的需求，市場急需一個的個體別率更高，檢測基因座數(shù)更多的Y-STR試劑盒,是STR熒光檢測試劑盒的必然趨勢。市面上主流試劑盒有Yfiler、YfilerPlus、PowerPlexY23、GoldeneyeY26、STRtyper27Y、AGCUDatabaseY24等熒光檢測試劑盒,基因座數(shù)量分別為17個、27個、23個、26個、27個、24個,法醫(yī)學常用的Yfiler的基因座數(shù)量較少，累積個體識別率較低，Yfiler已被確認在某些特定的人群中具有非常低的多態(tài)性,YfilerP1us、STRtyper27Y、powerplexY23、GoldeneyeY26分別含有7個、7個、2個和3個快速突變基因。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的累積個體識別率較低、具有等位基因越界的風險的缺陷，提供一種人類Y染色體29個STR基因座的熒光標記復合擴增試劑盒來解決上述問題。本發(fā)明公開了一種人類Y染色體29個STR基因座的熒光標記復合擴增試劑盒，其特點在于：所述的試劑盒包含29對STR基因座的特異性擴增引物，其中STR基因座為:DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS458、DYS19、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、YGATAH4、DYS437、DYS438、DYS448、DYS456、DYS390、DYS449、DYS576、DYS481、DYS549、DYS533、DYS570、DYS643、DYS460、DYS627、DYS387a/b、DYS518。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施例中，針對上述29個基因座在其重復序列的側(cè)翼分別設(shè)計特異性熒光標記引物。作為優(yōu)選，所述的26對STR基因座的特異性擴増引物分為五組:第一組，DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS526、DYS570；第二組，DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a、DYS385b；第三組,DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458；第四組,DYS393、YGATAH4、DYS439、DYS635、DYS570、DYS643；第五組,DYS549、DYS627、DYS387a、DYS387b、DYS518；每對引物中至少一條采用熒光染料標記其5'端。作為優(yōu)選，所述的人類Y染色體29個STR基因座的熒光標記復合擴增試劑盒包括反應(yīng)混合液、26對STR基因座的特異性擴増引物、29個基因座的等位基因、熱啟動Taq酶、DNA標準品、sdH20和熒光分子量內(nèi)標，具體成分為：反應(yīng)混合液含Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTPMix2mlDatabaseY29Primers含29個基因座熒光引物1ml熱啟動Taq酶具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶200ulDNA標準品人類基因組DNA20ulsdH2O超純水1.85mlDatabaseY29AllelicLadder含29個基因座的等位基因25ulMarkerSIZ-500熒光分子量內(nèi)標250ul作為優(yōu)選，所述的反應(yīng)混合液的組成為：MgCl27.5mM，Tris-HCl125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2g/L。作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了采用上述人類Y染色體29個STR基因座的熒光標記復合擴增試劑盒在法醫(yī)鑒定、親權(quán)鑒定和DNA家譜構(gòu)建中的檢測應(yīng)用，具體檢測方法為：將試劑盒內(nèi)試劑與樣品DNA裝入PCR擴増管，置于熱循環(huán)儀上，進行PCR擴增，然后在4℃的條件下進行保溫，得到擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物在遺傳分析儀上進行熒光檢測，再用片段分析軟件GeneMapper分析基因測序儀上進行檢測，即得到檢測結(jié)果。作為優(yōu)選，Y染色體STR基因座的擴増采用聚合酶鏈式反應(yīng)，其擴増產(chǎn)物的檢測采用毛細管電泳、聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，聚合酶鏈式反應(yīng)的擴增程序為：95℃2min，94℃30S、59℃1min、72℃1min，共29個循環(huán)；60℃30min。作為優(yōu)選，所述的樣品DNA包括利用Che1ex法、磁珠提取法或有機抽提法中任意一種方法提取的人基因組DNA，或采用免提取的、濾紙、FTA卡、棉簽、紗布中任意一種裁體收集的人類血液或口腔細胞。作為優(yōu)選，所述的檢材的來源包括人的血液、血痕、精液、唾液、體液、毛發(fā)、肌肉或組織器官。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：（1）ANLONGY29擁有29個低突變率基因座，為市面上基因座數(shù)量最多的Y-STR試劑盒之一；（2）通過五色熒光檢測系統(tǒng)檢測獲得一種具有高分辨率，低突變率且能夠滿足Y-STR建庫運行家系快速排查的需求；（3）ANLONGY29不僅基因座數(shù)量更多，基因座Marker覆蓋的等位基因范圍更大，減少了等位基因越界的風險，而且其他方面的性能也有較大改善。具體實施方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。本發(fā)明公開了一種人類Y染色體29個STR基因座的熒光標記復合擴增試劑盒，其特點在于：所述的試劑盒包含29對STR基因座的特異性擴增引物，其中STR基因座為:DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS458、DYS19、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、YGATAH4、DYS437、DYS438、DYS448、DYS456、DYS390、DYS449、DYS576、DYS481、DYS549、DYS533、DYS570、DYS643、DYS460、DYS627、DYS387a/b、DYS518。作為優(yōu)選，在本發(fā)明的一個實施例中，針對上述29個基因座在其重復序列的側(cè)翼分別設(shè)計特異性熒光標記引物。作為優(yōu)選，所述的26對STR基因座的特異性擴増引物分為五組:第一組，DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS526、DYS570；第二組，DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a、DYS385b；第三組,DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458；第四組,DYS393、YGATAH4、DYS439、DYS635、DYS570、DYS643；第五組,DYS549、DYS627、DYS387a、DYS387b、DYS518；每對引物中至少一條采用熒光染料標記其5'端。作為優(yōu)選，所述的人類Y染色體29個STR基因座的熒光標記復合擴增試劑盒包括反應(yīng)混合液、26對STR基因座的特異性擴増引物、29個基因座的等位基因、熱啟動Taq酶、DNA標準品、sdH20和熒光分子量內(nèi)標，具體成分為：反應(yīng)混合液含Tris-HCl、MgCl2、KCl和dNTPMix2mlDatabaseY29Primers含29個基因座熒光引物1ml熱啟動Taq酶具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶200ulDNA標準品人類基因組DNA20ulsdH2O超純水1.85mlDatabaseY29AllelicLadder含29個基因座的等位基因25ulMarkerSIZ-500熒光分子量內(nèi)標250ul作為優(yōu)選，所述的反應(yīng)混合液的組成為：MgCl27.5mM，Tris-HCl125mM，KCl125mM，dNTPs7.5mM，BSA2g/L。作為優(yōu)選，本發(fā)明還公開了采用上述人類Y染色體29個STR基因座的熒光標記復合擴增試劑盒在法醫(yī)鑒定、親權(quán)鑒定和DNA家譜構(gòu)建中的檢測應(yīng)用，具體檢測方法為：將試劑盒內(nèi)試劑與樣品DNA裝入PCR擴増管，置于熱循環(huán)儀上，進行PCR擴增，然后在4℃的條件下進行保溫，得到擴增產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物在遺傳分析儀上進行熒光檢測，再用片段分析軟件GeneMapper分析基因測序儀上進行檢測，即得到檢測結(jié)果。作為優(yōu)選，Y染色體STR基因座的擴増采用聚合酶鏈式反應(yīng)，其擴増產(chǎn)物的檢測采用毛細管電泳、聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，聚合酶鏈式反應(yīng)的擴增程序為：95℃2min，94℃30S、59℃1min、72℃1min，共29個循環(huán)；60℃30min。作為優(yōu)選，所述的樣品DNA包括利用Che1ex法、磁珠提取法或有機抽提法中任意一種方法提取的人基因組DNA，或采用免提取的、濾紙、FTA卡、棉簽、紗布中任意一種裁體收集的人類血液或口腔細胞。作為優(yōu)選，所述的檢材的來源包括人的血液、血痕、精液、唾液、體液、毛發(fā)、肌肉或組織器官。實施例1Y染色體STR基因座的篩選通過對DYS392、DYS389I、DYS389II、DYS531、DYS630、DYS447、DYS438、DYS527a、DYS527b、DYS522、DYS391、DYS456、DYS19、DYS622、DYS388、DYS448、DYS385a、DYS385b、DYS443、DYS446、DYS552、DYS510、DYS630、DYS587、DYS481、DYS437、DYS390、DYS460、DYS533、DYS458、DYS393、YGATAH4、DYS439、DYS635、DYS444、DYS643、DYS549、DYS557、DYS643、DYS607、DYS525、DYS576、DYS520DYS557、YGATA-A10共45個Y染色體短串聯(lián)重復序列基因座及其等位基因遺傳特征進行了深入研究，篩選出29個Y染色體短串聯(lián)重復序列基因座：DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS458、DYS19、DYS385a/b、DYS393、DYS391、DYS439、DYS635、DYS392、YGATAH4、DYS437、DYS438、DYS448、DYS456、DYS390、DYS449、DYS576、DYS481、DYS549、DYS533、DYS570、DYS643、DYS460、DYS627、DYS387a/b、DYS518。這29個Y染色體短串聯(lián)重復序列基因座在人群中具有較低的遺傳多態(tài)性盒良好的的等位基因頻率分布，符合本發(fā)明對于位點的要求。實施例2本試劑盒因為需要滿足不同檢材的適應(yīng)性及不同退火溫度的耐受性,所以需要測試不同的擴増程序,保證不同檢材在較寬的溫度范圍內(nèi)均能得到正確的DNA分型。首先,循環(huán)數(shù)測試：分別測試了28個循環(huán),29個循環(huán),30個循環(huán),31個循環(huán),最佳循環(huán)為29；其次,退火溫度測試：分別測試了56℃，57℃，58℃，59℃，60℃，62℃，最佳溫度為59度。最終擴增程序為：95℃2min，94℃30S，59℃1min,72℃1min29循環(huán)；60℃30min，4℃延伸。本試劑盒檢測擴增產(chǎn)物的方法為采用毛細管遺傳分析儀或凝膠電泳進行測定。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。當前第1頁1 2 3