專利名稱：一種使用人工染色體重組技術培育心血管系統(tǒng)熒光轉(zhuǎn)換斑馬魚的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程領域，涉及一種細菌人工染色體的重組工程技術，及應用其構建心血管系統(tǒng)帶有藍色熒光并可轉(zhuǎn)換為黃色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的方法。
背景技術：
心臟是人體的第一個發(fā)育的器官，是所有生命活動的能量供給動力中心。它通過大血管，微血管和血液構建的循環(huán)系統(tǒng)脈沖式的壓迫血流將氧氣和營養(yǎng)供給組織和器官， 同時帶走代謝產(chǎn)物。心血管疾病是死亡率最高的疾病，每年大約有30%的死亡與之有關。 內(nèi)皮細胞是心血管的最內(nèi)層的細胞，具有多種合成和代謝功能，包括調(diào)節(jié)血栓及其溶解，血小板黏附，調(diào)控血管節(jié)律和血流，通過控制白細胞，單核細胞和淋巴細胞調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應。內(nèi)皮細胞的損傷，會導致動脈粥樣硬化和心肌梗死等多種致命心血管疾病。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體/從廣泛分布在整個心血管內(nèi)皮系統(tǒng)，對于模式動物斑馬魚心血管系統(tǒng)flk基因進行熒光標記，可以方便的觀察研究心血管病理進程。Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)在新型基因打靶中獲得廣泛應用，是條件性基因打靶、誘導性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術核心?；趂re-h^系統(tǒng)的熒光轉(zhuǎn)換功能可以對相關基因在心血管的表達進行監(jiān)控，揭示基因與疾病的關系。細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome, BAC)是一種基于細菌質(zhì)粒的系統(tǒng)，被廣泛應用于基因組測序及圖譜繪制，疾病基因的定點克隆，近來開始被用于轉(zhuǎn)基因動物的建立。相對于其他克隆系統(tǒng)而言，BAC系統(tǒng)有著很強的可操作性及應用優(yōu)勢。 BAC攜帶了完整的基因表達啟動子及相應調(diào)控元件，對構建高精度轉(zhuǎn)基因斑馬魚系及其他轉(zhuǎn)基因動物有著極其重要的意義。BAC系統(tǒng)可以被看作一個較大的質(zhì)粒，與所有分子遺傳學的常規(guī)技術兼容。通過重組工程菌SW105進行BAC重組，方便準確的修飾BAC。這種工程菌提供了Beta和Gmfi種功能，fe 保護導入的線性DNA免遭監(jiān)cBO)酶切，￡ro提供了 5’到3’核酸外切活性，ifete與被外切后的單鏈DNA結(jié)合，提供保護。本發(fā)明融合了人工染色體重組，fre-hf系統(tǒng)等多種技術，通過技術優(yōu)化，提高了效率，構建了高精度的心血管系統(tǒng)熒光轉(zhuǎn)換斑馬魚，為后基因組時代心血管疾病與基因功能研究及應用提供了有效工具。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的
本發(fā)明提供一種構建心血管系統(tǒng)帶有藍色熒光并可轉(zhuǎn)換為黃色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型的方法。技術方案
一種使用人工染色體重組技術培育心血管系統(tǒng)熒光轉(zhuǎn)換斑馬魚的方法，其特征在如下步驟實現(xiàn)
3k、flk BAC 導入工程菌 SW105，其中 flk BAC 為 CH211-231B5 ；
B、采用目的片段5，引物5，-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCA GACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ 禾Π
目的片段 3，引物5，-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCA GAGTAGTGAGGAG-3，擴增pPCRBIoxYkanFrt中的熒光轉(zhuǎn)換基因元件；
C、熒光轉(zhuǎn)換基因元件的電擊導入含flk-BAC感受態(tài)細胞，并大量培養(yǎng)；
D、清除插入基因片段所帶篩選抗性；
E、引入Tol/IScel轉(zhuǎn)座位點提高整合效率其中插入位點1引物
上游引物5 '-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’
下游引物5 '-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’
Tol/IScel插入位點2引物
上游引物5 '-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’
下游引物5 ‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3，；
F、斑馬魚胚胎的注射；
G、潛在的成功轉(zhuǎn)基因魚篩選。有益效果
1)對于心血管系統(tǒng)廣泛表達的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體/從進行熒光標記。2)采用完整的flk基因表達啟動子及相應調(diào)控元件以調(diào)節(jié)熒光報告子表達，而非簡單的部分短片段的質(zhì)粒構建。3)主要技術細節(jié)包括d BAC的前期處理，引物設計，感受態(tài)工程菌的準備，溫度誘導重組，d BAC的重組后鑒定及大量提取技術。4)無需分離啟動子，相對于受限于啟動子構建標記的轉(zhuǎn)基因系的技術，很大程度上提高了轉(zhuǎn)基因系構建的廣泛性，為基礎醫(yī)學和應用科學研究提供了自由。5)本專利技術在應用BAC重組工程的同時，融合了近期出現(xiàn)的轉(zhuǎn)座技術，使用 Tb^ 和Zs^/轉(zhuǎn)座子，提高了人工染色體整合到斑馬魚基因組的效率，提高了構建的成功率。6)將重組后的d BAC導入斑馬魚胚胎。包括顯微注射方法，劑量步驟，優(yōu)化的 Fo交配篩選方案。


圖1血管系統(tǒng)標記基因/從BAC克隆CH211-231B5結(jié)構示意圖； 圖2插入到BAC中的藍色變黃色熒光基因序列質(zhì)粒；
圖3插入到BAC中的轉(zhuǎn)座基因序列質(zhì)粒，包括tol2 RIsceI位點； 圖4 cre-lox原理示意圖未加ere的基因只表達藍色熒光，不表達終止信號后片段。 加入ere后可于Iox位點處切割重組，基因因此表達黃色熒光； 圖5細菌人工染色體重組原理示意圖；圖6重組后BAC酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳；
圖7構建好的轉(zhuǎn)基因斑馬魚心血管系統(tǒng)呈藍色熒光，在fre mRNA的作用下轉(zhuǎn)化為黃色熒光；
圖8插入到BAC中的藍色變黃色熒光基因序列質(zhì)粒，其電泳檢測確定PCR結(jié)果的電泳圖。
具體實施例方式實施例1 培育心血管系統(tǒng)帶熒光并可進行熒光顏色轉(zhuǎn)換的斑馬魚轉(zhuǎn)基因系。含flk BAC工程菌的準備 Dflk BAC的來源
/7左基因廣泛分布于心血管系統(tǒng)，其BAC克隆為CH211-231B5 (圖1)，該信息可直接到 zfin.org 查詢。本發(fā)明中使用的 flk BAC 購自 CH0RI-211 文庫(Children’ s Hospital Oakland Research Institute in Oakland, California, USA. http://bacpac. chori. org), BAC 的大小為 156. 559kb，序列詳見 GenBank : BX24796. 6。2、flk BAC 導入工程菌 SW105
a.將含/7左 BAC 克隆的菌株(Children，s Hospital Oakland Research Institute in Oakland, California, USA)在含12. 5 μ g/ml氯霉素抗性的LB培養(yǎng)基平板劃線，37°C 培養(yǎng)過夜。b.挑取4個克隆，在含12.5 μ g/ml氯霉素抗性的5ml LB液態(tài)培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)過夜。c.進行BAC的小量提取，參見下述步驟5。d.使用SpeI 37°C酶切過夜，在0. 7%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測BAC大小是否正確。e. M SW105 ^^ (SW105, ^ g National Cancer Institute at Frederick, USA)在5ml無抗生素的LB培養(yǎng)液中，30°C振搖過夜。次日，1 100稀釋于25ml培養(yǎng)液中， 于30°C振搖4-5小時，直到0D600值為0. 6。f.將菌液在冰中冷卻2min, 5000g，0°C離心3min。g.去上清，加入Iml冰水，在冰中重懸15min。然后加入9ml冰水，重懸。h. 5000g，0°C離心3min，去上清。重懸于Iml冰水。轉(zhuǎn)移ImL重懸菌液至預冷的 Eppendorf管中。臺式小離心機2min 4°C離心14000轉(zhuǎn)，2min離心后，移除900 μ L上清， 重懸沉淀于100 μ L。i.將IOOyL菌液轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)化皿中，設定參數(shù)為25 μ F, 1.75 kV及200 ohms. 電擊后馬上加入ImL室溫SOC至小槽內(nèi)。轉(zhuǎn)移菌液至新的印pendorf管中，32°C搖床培養(yǎng) lh。開始預熱培養(yǎng)板。Ih復壯之后，室溫14000轉(zhuǎn)離心lmin。除去850 μ L上清，重懸于 150yL上清中。將所有150yL涂板。32°C過夜培養(yǎng)。細菌在這一溫度下生長緩慢，所以等待較長時間才能看到克隆。j.挑取4個克隆，在含12. 5 μ g/ml氯霉素抗性的5ml LB液態(tài)培養(yǎng)基37°C培養(yǎng)過夜。進行BAC的小量提取，參見下述步驟5。使用SpeI 37°C酶切過夜，在0. 7%的瓊脂糖凝膠上電泳鑒定BAC是否正確。
5
k.將鑒定正確的菌株保存待用。加入330 μ L60%甘油到ImL菌液中，零下80°C凍存。.用于插入BAC的熒光轉(zhuǎn)換基因元件的準備
1)熒光報告基因質(zhì)粒模板及引物設計
熒光報告基因包含在質(zhì)粒pPCRBloxYkanFrt (見Seq NO. 1)中，使用以下引物將該目的片段擴增(質(zhì)粒模板如圖2)。該質(zhì)粒含有cre-loxp作用位點，工作原理如圖4。目的片段 5，引物5，-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCAGA CGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3，(見 Seq NO. 3)
目的片段 3，引物5，-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCA GAGTAGTGAGGAG-3，(見 Seq NO. 4)
2)目基因片段的擴增與純化
設置 PCR 反應，使用 Failsafe 試劑盒(FaiISafe PCR System，購自 Epicentre biotechnologies, USA)擴增長片段，模板量為1 ng DNA。電泳檢測確定PCR結(jié)果正確后 (如圖8)，使用QIAquick純化，每柱低于400毫克瓊脂糖，洗脫至40 μ L去離子水。每40 μ L 洗脫樣品加入2-3 μ 1 DpnI酶切60 min，去除模板。反應條件如下 160 μ 1 PCR 產(chǎn)物 20 μ 1 IOx buffer 4 10 μ 1 H2O 10 μ 1 DpnI 200 μ 1 總體積
酶切后于1%瓊脂糖凝膠電泳分離產(chǎn)物，使用Minelute純化。PCR產(chǎn)物同樣也使用 Minelute柱進行純化。200 yL樣品，加入600 μ 1 QG溶液及200 μ L異丙醇，混勻后上樣。 使用PE溶液清洗兩次，第一次750 μ L第二次250 μ L，至少5次30秒離心除去所有ΡΕ，每次更換新管；完全干燥后洗脫至12 μ L水中。獲得熒光轉(zhuǎn)換基因元件，測定其濃度，正常濃度不低于100 μ g/mL。含/I-BAC感受態(tài)細胞的準備
準備好培養(yǎng)平皿，抗性要正確，準備5mL過夜培養(yǎng)的flk BAC菌液(來自步驟1 )，培養(yǎng)溫度32°C，加入氯霉素抗性和LB培養(yǎng)基。培養(yǎng)過夜，稀釋2mL過夜培養(yǎng)的菌液致25mL，加入氯霉素。600納米處測定OD值，大約為0.015至0.02。打開冷凍離心機，快速冷卻模式。 準備好42°C水浴搖床。準備好IOOmL滅菌水，2個電轉(zhuǎn)化小缸，2個印pendorf管，2個15mL 試管及冰。準備好培養(yǎng)平皿，抗性要正確。25mL培養(yǎng)液達到吸光值約0. 055-0. 066時，轉(zhuǎn)移 12. 5mL培養(yǎng)液到另一個錐形瓶。42°C水浴誘導15min，另外一瓶放入32°C作為未誘導組。 5min后，將兩瓶迅速放置冰上，冷卻大約lOmin。轉(zhuǎn)移10 mL培養(yǎng)菌液置于預冷的14mL管中，零下4°C 5000轉(zhuǎn)離心3min。離心后移除上清。加入ImL冰冷的無菌水，在冰水中搖動重懸沉淀5至lOmin。零下4°C 5000轉(zhuǎn)離心3min。重復3次后，快速冰上重懸菌液。轉(zhuǎn)移 ImL重懸菌液至預冷的Eppendorf管中。臺式小離心機2min4°C離心14000轉(zhuǎn)，2min離心后，移除900 μ L上清，重懸沉淀于100 μ L，獲得含有/"M-BAC感受態(tài)細胞菌液。.熒光轉(zhuǎn)換基因元件的電擊導入
將5μ L熒光轉(zhuǎn)換基因元件加入到重懸的d-BAC細胞菌液中，混勻兩次。轉(zhuǎn)移細胞-DNA混合物至預冷的小槽內(nèi)，確認細胞位于金屬板間。使用1.7 kV電傳孔器。電擊后馬上加入ImL室溫SOC至小槽內(nèi)。轉(zhuǎn)移菌液至新的印pendorf管中，32°C搖床培養(yǎng)lh。開始預熱培養(yǎng)板。Ih復壯之后，室溫14000轉(zhuǎn)離心lmin。除去850 μ L上清，重懸于150 μ L 上清中。將所有150yL涂板。32°C過夜培養(yǎng)。細菌在這一溫度下生長緩慢，所以等待較長時間才能看到克隆。對于成功的重組，可以看到有大于1000個克隆在誘導的板上，但是在未誘導的板上沒有。從誘導板上挑6個克隆，接種于5mL的LB管中，加入相應抗生素，32°C 搖菌過夜。獲得菌液用于接下來的提取及鑒定。反應原理如圖5所示； 5. BAC的小量提取及鑒定
從32°C搖過夜的5mL獲得菌液中取4mL，4500轉(zhuǎn)離心15min。去上清，加入250 μ LPl 溶液(50 mM Tris ‘ Cl, pH 8. 0; 10 mM EDTA, 100 μ g/ml RNase A)，重懸菌液，轉(zhuǎn)移至印pendorf管中。加入 250 μ LP2 (200 mM NaOH, 1% SDS)，室溫靜止5min。加入 250 μ LNl (1. 6 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7.0; 15% isopropanol )，小離心機 14000 離心 5min，上清轉(zhuǎn)移至新的印pendorf管中。重復離心，收集上清。加入750 μ L異丙醇，零下20°C靜置IOmin 以上。最高速離心lOmin，去上清，70%乙醇清洗，干燥，獲得小量的BAC。重懸置40 μ L 酶切反應液中，34 μ L水，4 μ LlOx緩沖液，2 μ L酶。鑒定結(jié)果如圖6所示。6. BAC大量提取
將上述鑒定正確的菌株，32°C過夜培養(yǎng)。5500轉(zhuǎn)離心20min。在50mLPl中加入200 μ L RNA酶溶液，重懸菌液。加入50mL P2溶液，翻轉(zhuǎn)4_6次，室溫靜置5min。加入50mLP3溶液 (3.0 M potassium acetate, pH 5. 5)，翻轉(zhuǎn)4-6次，用濾紙漏斗過濾。使用Qia的大提結(jié)合柱，結(jié)合DNA，60mL清洗液清洗。5次每次3mL65°C預熱的洗脫溶液，進行洗脫回收。加入 10. 5mL異丙醇，混勻后置于高壓滅菌的corex玻璃離心管中。12，500轉(zhuǎn)4°C高速離心30min 后，使用70%乙醇清洗。讓沉淀物干燥，并觀察。重懸沉淀到200-400 μ L 7jC中。離心lmin， 轉(zhuǎn)移上清至ImL管中即可獲得大量的BAC。加入330μ L60%甘油到ImL菌液中，零下80°C 凍存。清除插入基因片段所帶篩選抗性
因為插入的熒光轉(zhuǎn)換基因元件含/^—Α/Ζ^ 反應位點(如圖2所示)，并且SW105菌株含有阿拉伯糖誘導的啟動子控制/^7/7表達。對于步驟5鑒定好的克隆，培養(yǎng)單克隆于5mL LB培養(yǎng)基中，32°C過夜。第二天取 ImL該SW105菌株稀釋至IOmL溶液。32°C 2_3h振動培養(yǎng)至600納米吸光度為0. 5。加入 1001^10%左旋1^(+)阿拉伯糖(Sigma A-3256)，使誘導/^7/71個小時。然后涂到板上鑒定， 10_4到10_6稀釋。平板分含有氯霉素及卡那霉素抗性。正確的敲除應該在氯霉素平板看到克隆，卡那霉素沒有克隆。挑菌落小提鑒定，獲得清除插入基因片段所帶篩選抗性的簡潔的 BAC片段。弓丨入Tol/IScel轉(zhuǎn)座位點提高整合效率
Y)龜有Tol/IScel序列(見Seq N0. 2)的質(zhì)粒模板如圖3所示，使用特異性引物將 Tol/IScel轉(zhuǎn)座元件擴增。2)引物設計
插入位點1引物
上游引物5 '-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’ (見 Seq NO. 5)
下游引物5 '-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3，(見 Seq NO. 6) Tol/IScel插入位點2引物
上游引物5 '-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3，(見 Seq NO. 7)
下游引物5 ‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3， (見 Seq NO. 8)
3)設置PCR反應，使用Failsafe試劑盒擴增長片段，模板量為1 ng DNA。電泳檢測確定PCR結(jié)果正確后，使用QIAquick純化。4 )將5 μ L Tol/IScel元件PCR產(chǎn)物加入到步驟7所得的/HAC細胞菌液中， 混勻兩次。轉(zhuǎn)移細胞-DNA混合物至預冷的小槽內(nèi)，確認細胞位于金屬板間。使用1. 7 kV電傳孔器。電擊后馬上加入ImL室溫SOC至小槽內(nèi)。轉(zhuǎn)移菌液至新的印pendorf管中，32°C 搖床培養(yǎng)lh。開始預熱培養(yǎng)板。Ih復壯之后，室溫14000轉(zhuǎn)離心lmin。除去850 μ L上清， 重懸于150 μ L上清中。將所有150 μ L涂板。32°C過夜培養(yǎng)。挑6個克隆，接種于5mL的 LB管中，加入相應抗生素，32°C搖菌過夜。獲得菌液進行BAC提取及鑒定。引入轉(zhuǎn)座位點提高整合效率的意義在于大幅提高基因重組的成功率，縮短構建周期。斑馬魚胚胎的注射
將野生型AB斑馬魚配置于小交配缸中，中間插有隔板過夜，次日早晨取出隔板，小魚開始交配產(chǎn)卵。收集魚卵，使用E3溶液清洗。去除未受精的魚卵。盡快將魚卵在注射盤中排列好，設置好注射器。注射溶液配方為=(IOyL)終濃度80納克/微升引入轉(zhuǎn)座子的 BAC, IxDanio緩沖液，Ix酚紅溶液，1微升轉(zhuǎn)座酶，相應量的水。注射1納升至一細胞期的胚胎細胞中。將注射好的胚胎放于28. 5°C孵箱中，48h后觀察熒光。將表達正確的馬賽克魚挑出，第五天時轉(zhuǎn)入小魚保姆區(qū)養(yǎng)大。潛在的成功轉(zhuǎn)基因魚篩選
當斑馬魚長至2. 5-3個月后，開始篩選。首先使用群內(nèi)交配，標記好胚胎與對應的親代魚。親代的魚最好單獨養(yǎng)到每個缸里，做好標記。每對魚看過100個胚胎，如果都呈陰性， 可說明親代陰性。使用表格做好記錄，不斷排除陰性魚。通常BAC有1-2%的幾率找到一條轉(zhuǎn)基因魚。插入Tol/IScel轉(zhuǎn)座子的BAC這一幾率有較大提高約8%，而且具有較強的啟動子表達，見圖6，圖7。
權利要求
1. 一種使用人工染色體重組技術培育心血管系統(tǒng)熒光轉(zhuǎn)換斑馬魚的方法，其特征在如下步驟實現(xiàn)k、flk BAC 導入工程菌 SW105，其中 flk BAC 為 CH211-231B5 ；B、采用目的片段5，引物5，-CATACGAGTATCATTCGGGGTTATTTTAACAG ACAAAATTAATTCA GACGCGCAAGTTTGTACAAAAAAGAGGCT-3’ 禾Π目的片段 3，引物5，-ATAACACAAAAAGCGACACTTACCATGTGAAA TACAACGGCTAGTCTTTCCA GAGTAGTGAGGAG-3，擴增pPCRBIoxYkanFrt中的熒光轉(zhuǎn)換基因元件；C、熒光轉(zhuǎn)換基因元件的電擊導入含flk-BAC感受態(tài)細胞，并大量培養(yǎng)；D、清除插入基因片段所帶篩選抗性；E、引入Tol/IScel轉(zhuǎn)座位點提高整合效率其中插入位點1引物上游引物5 '-ACCCAATTCACCTGTAGCGCATGGACTAGAGATGAAGCTTGG TACCGAGCTCGGATCCACTAGTACGGC-3’下游引物5 '-GATCTGCAGCATATCATGCGTGTAATATGAGAGACGAGCTC GGATCCGAACAAACGACCC-3’Tol/IScel插入位點2引物上游引物5 '-GGGCATCGGTGAGCTTGACATTGTAGGACTATATTGCTCG AGCGGCCG CCAGTGTGATGG-3’下游引物5 ‘-CTGTTCCTGCGCCCGAAGAGTCTTGTGGTAAGTTTGTGCAGG CGGCCGCATTCCC-3，；F、斑馬魚胚胎的注射；G、潛在的成功轉(zhuǎn)基因魚篩選。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種使用人工染色體構建轉(zhuǎn)基因斑馬魚的技術及其輔助質(zhì)粒。本專利使用這一技術構建了藍色熒光轉(zhuǎn)換黃色熒光的心血管系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因系。步驟包括1)特異性人工染色體獲得及目的基因的構建2)人工染色體重組插入目的基因3)重組的人工染色體導入斑馬魚受精卵4)陽性轉(zhuǎn)基因系篩選。本技術發(fā)明是一種具有國際領先水平的細菌人工染色體重組工程技術，極大的提高了轉(zhuǎn)基因構建效率，將為我國生物醫(yī)學基礎研究和藥物研究提供有力的工具。
文檔編號A01K67/033GK102250951SQ20111014140
公開日2011年11月23日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權日2011年5月30日
發(fā)明者吉貴祥, 周勇, 顧愛華 申請人:南京醫(yī)科大學