本發(fā)明涉及一種提高丁醇產(chǎn)量的重組梭菌、構(gòu)建方法與應(yīng)用，尤其是涉及一種可用于生產(chǎn)丁醇的重組梭菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

人類社會(huì)的發(fā)展與能源的利用密切相關(guān)。在遠(yuǎn)古時(shí)期，人類開始使用火，從而進(jìn)入文明時(shí)代；第一次工業(yè)革命又將人類帶入以煤炭為能源的時(shí)代；第二次工業(yè)革命后，人類開始利用石油等自然。而石油、煤炭等都屬于不可再生能源，儲(chǔ)量有限而且污染嚴(yán)重。能源問題已經(jīng)屬于迫切需要解決的問題。

新型綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的能源，已經(jīng)成為世界各國共同的需求。其中一種理想的可再生資源是生物質(zhì)資源，生物質(zhì)資源具有年產(chǎn)量大，可再生，綠色環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)。利用生物質(zhì)資源進(jìn)行生物燃料的生產(chǎn)則是一種新型的解決能源危機(jī)的方法。

生物燃料主要包括生物乙醇，生物丁醇。其中，生物丁醇比生物乙醇具有更多的優(yōu)點(diǎn)，如能量密度高；可以與汽油任意比例混合；而且運(yùn)輸方便，不需對(duì)現(xiàn)有的運(yùn)輸管道做技術(shù)修改等。實(shí)際上，生物丁醇具有數(shù)十億美元的市場，而且全世界對(duì)丁醇的需求以3％的比例增長，預(yù)計(jì)到2020年具有接近百億美元的市場。利用傳統(tǒng)的化工合成丁醇需要以石油為原料，投資高，設(shè)備技術(shù)復(fù)雜。因此利用生物質(zhì)資源發(fā)酵生產(chǎn)丁醇成為可再生綠色能源開發(fā)利用的熱點(diǎn)。但生物質(zhì)資源存在利用率低的缺點(diǎn)，因此開發(fā)新工藝或研究工程菌株提高對(duì)生物質(zhì)資源的利用以及成為目前的熱點(diǎn)研究。

對(duì)于丁醇發(fā)酵，葡萄糖基、淀粉基的生物質(zhì)資源最易被菌體利用，但價(jià)格較高；而非葡萄糖基的物料，存在諸多問題，如原料利用率低，發(fā)酵周期長，丁醇產(chǎn)量及產(chǎn)率低。在丁醇發(fā)酵生產(chǎn)中，丁醇的產(chǎn)量和產(chǎn)率是評(píng)價(jià)發(fā)酵性能的重要參數(shù)，提高丁醇產(chǎn)量有利于后續(xù)分離操作和降低提純成本，而產(chǎn)率對(duì)資本投入具有很大影響，提高一倍產(chǎn)率，能夠降低20％固定投入。所以，就需要進(jìn)行工藝改造或菌株改造，從而提高丁醇產(chǎn)量，最終滿足工業(yè)化指標(biāo)。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，菌株改造技術(shù)愈來愈成熟，丙酮丁醇梭菌基因組的測序工作也已完成，研究工作者可以對(duì)丁醇發(fā)酵菌株進(jìn)行分子水平調(diào)控。關(guān)于轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)及蛋白組學(xué)的相關(guān)研究進(jìn)展有著廣泛報(bào)道，對(duì)丙酮丁醇梭菌生理代謝途徑以及調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)已經(jīng)取得很大進(jìn)展。但通過菌株改造來提高丁醇發(fā)酵底物利用效率及生產(chǎn)強(qiáng)度的研究進(jìn)展卻不大，主要原因是缺少有效的靶標(biāo)基因進(jìn)行代謝工程的定向改造。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，首先公開一種用于構(gòu)建高產(chǎn)丁醇重組菌的fruc基因片段(locus_tag＝"ca_c0233")，其具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。所述fruc基因編碼的蛋白質(zhì)fruc的氨基酸序列為seqidno.2。其中，該fruc蛋白質(zhì)全長147個(gè)氨基酸，其分子量為16.56kda。

本發(fā)明還涉及上述fruc基因片段相關(guān)的生物材料，具體為下述一種：

(1)含有上文所述的fruc基因的表達(dá)盒；

(2)含有上文所述的fruc基因的重組載體或含有(1)所述表達(dá)盒的重組載體；

(3)含有(2)所述重組載體的重組菌。

本發(fā)明還公開了通過在梭菌內(nèi)過表達(dá)fruc基因，來提高重組菌對(duì)果糖、混合糖(葡萄糖：果糖＝1:4)以及菊芋水解液的利用率及提高重組菌的丁醇產(chǎn)量。所述重組梭菌含有核苷酸序列為seqidno.1的fruc基因。

對(duì)于上述技術(shù)方案中所述的高效生產(chǎn)丁醇的重組梭菌，具體的，還含有核苷酸序列為seqidno.3的硫解酶的啟動(dòng)子或其他能使fruc基因在梭菌內(nèi)過表達(dá)的強(qiáng)啟動(dòng)子。

在優(yōu)選的技術(shù)方案中，上文所述梭菌選自產(chǎn)丁醇的丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)，拜氏梭菌(clostridiumbeijerinckii)，糖乙酸多丁醇梭菌(clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)及糖丁酸梭菌(clostridiumsaccharobutylicum)；可以為野生型菌株，也可為將上述所列舉的梭菌經(jīng)過誘變或遺傳改造后的菌株。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種能提高丁醇發(fā)酵果糖、葡萄糖與果糖的混合糖以及菊芋水解液利用率及丁醇產(chǎn)量的梭菌的構(gòu)建方法。具體包括以下步驟：

(1)fruc基因過表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：

將核苷酸序列為seqidno.3的硫解酶的啟動(dòng)子序列經(jīng)psti和sali酶切后與pimp1質(zhì)粒連接，得到載體質(zhì)粒pimp1-pthl，以丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824基因組作為模板，利用pcr擴(kuò)增核苷酸序列為seqidno.1的fruc基因，再將其與pimp1-pthl質(zhì)粒進(jìn)行連接從而構(gòu)建pimp1-pthl-fruc質(zhì)粒；

(2)過表達(dá)重組質(zhì)粒的甲基化：

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入e.colidh10b(pan1)中進(jìn)行甲基化，得到甲基化質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc；

(3)fruc基因過表達(dá)重組菌株的構(gòu)建：

通過電轉(zhuǎn)化法，將步驟(2)所得甲基化質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc轉(zhuǎn)化至丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824中，通過涂布于含有紅霉素抗性的固體tgy培養(yǎng)基上，培養(yǎng)、篩選獲得含有fruc基因過表達(dá)質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc的重組梭菌。

更為具體的，上文所述的fruc基因過表達(dá)重組菌株的構(gòu)建過程如下：厭氧條件下，取50-100ml梭菌活化培養(yǎng)基(tgy)培養(yǎng)的對(duì)數(shù)中期(od6201.0～1.5左右)的丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824細(xì)胞液，4℃、3000rpm離心10min，去除上清液，加入50ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液，洗滌兩次，并重懸至1.5ml的電轉(zhuǎn)緩沖液中，然后取80～100μl轉(zhuǎn)入0.4cm的電轉(zhuǎn)杯中，放置冰浴中用于電轉(zhuǎn)化，加入10～20μl步驟(2)所得甲基化質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc，置于冰浴中2～3min，采用1.8kv脈沖電壓和25μf的電容進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，隨后將電轉(zhuǎn)液加入到梭菌活化培養(yǎng)基tgy中，37℃培養(yǎng)4h，2000～3000rpm離心10min收集菌體細(xì)胞，將收集的細(xì)胞涂布于含有紅霉素抗性的tgy瓊脂平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36～40h后，獲得含有fruc基因過表達(dá)質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc的丙酮丁醇梭菌，命名為丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)。

本發(fā)明進(jìn)一步的目的是，提供一種利用上文所述的梭菌在生產(chǎn)丙酮丁醇中的應(yīng)用：

步驟(3)獲得的丙酮丁醇梭菌接種于含有紅霉素抗性的發(fā)酵培養(yǎng)基及菊芋水解液培養(yǎng)基中進(jìn)行厭氧發(fā)酵，發(fā)酵溫度37～38℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph調(diào)至5.5，發(fā)酵72～168h。

對(duì)于上述技術(shù)方案中所述的重組梭菌的構(gòu)建方法，所述電轉(zhuǎn)緩沖液含有270mmol/l蔗糖，5mmol/lnah2po4，ph為7.4。

本發(fā)明中使用的活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任何可實(shí)現(xiàn)丙酮丁醇梭菌所適用的常規(guī)培養(yǎng)基；菊芋水解液培養(yǎng)基應(yīng)理解為實(shí)際物料培養(yǎng)基，除去菊芋水解液外，其他成分均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑。本發(fā)明實(shí)施例中所使用的配方如下：

活化培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，胰蛋白胨30，酵母粉10。

種子培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖70，乙酸銨3.22，酵母粉2.0，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：果糖或混合糖(葡萄糖：果糖＝1:4)70，乙酸銨3.22，酵母粉2，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。

菊芋水解液培養(yǎng)基(g/l)：乙酸銨3.22，酵母粉2，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01；加菊芋水解液(含葡萄糖約15g/l，果糖約60g/l)定容。

菊芋水解液制備：將菊芋塊莖切片曬干，稱量500g至燒杯中，加入純凈水定容至4l；用硫酸調(diào)節(jié)ph為2；用八層紗布封口放入滅菌鍋105℃酸解1h；用紗布濾除殘?jiān)?，得到菊芋水解液，置于冰箱待用?/p>

本發(fā)明另一方面涉及上述高效生產(chǎn)丁醇的重組梭菌的應(yīng)用，即所述重組梭菌在提高丁醇發(fā)酵果糖、混合糖以及菊芋水解液的利用率，以及提高丁醇產(chǎn)量方面的應(yīng)用。

通過本發(fā)明后文所述的具體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將fruc基因在丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824中過表達(dá)能顯著提高菌株的丁醇發(fā)酵果糖、葡萄糖與果糖的混合糖以及菊芋水解液利用率及丁醇產(chǎn)量。由于丁醇對(duì)菌體具有毒害作用，導(dǎo)致丁醇產(chǎn)量十分有限，傳統(tǒng)技術(shù)手段使菌體產(chǎn)丁醇濃度每提高1g/l都顯得十分困難。而重組菌株相比對(duì)照組菌體，糖利用率提高了1.4倍以上，丁醇產(chǎn)量提高了約1.4～3.5倍。丁醇產(chǎn)率以及轉(zhuǎn)化率也有一定量的提高。

附圖說明

圖1為重組質(zhì)粒pimp1-pthl的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為野生型菌株c.acetobutylicumatcc824、空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)、fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)在70g/l果糖中的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線；

圖4為野生型菌株c.acetobutylicumatcc824、空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)、fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)在70g/l混合糖(果糖：葡萄糖＝4:1)中的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線；

圖5為野生型菌株c.acetobutylicumatcc824、空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)、fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)在菊芋水解液中的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

以下實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用的材料、試劑等，無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲取，活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基及發(fā)酵培養(yǎng)基應(yīng)理解為現(xiàn)有技術(shù)中任何可實(shí)現(xiàn)丙酮丁醇梭菌所適用的常規(guī)培養(yǎng)基，菊芋水解液培養(yǎng)基應(yīng)理解為實(shí)際物料培養(yǎng)基，除去菊芋水解液外，其他成分均為常規(guī)實(shí)驗(yàn)試劑。

實(shí)施例1

本實(shí)施例包括以下步驟：

(1)fruc基因過表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建

采用sangonbiotech(上海生工)ezup柱式細(xì)菌基因組dna抽提試劑盒(貨號(hào)：b518255)提取丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌c.acetobutylicumatcc824(購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)基因組dna，利用引物：pthl-f：gacacctgcagtttttaacaaaatatattga(劃線部分為psti酶切位點(diǎn))和pthl-r：gacacgtcgacttctttcattctaactaacctc(劃線部分為sali酶切位點(diǎn))擴(kuò)增硫解酶的啟動(dòng)子序列(具體序列見seqidno.3)，將pcr擴(kuò)增的硫解酶啟動(dòng)子dna用psti和sali進(jìn)行雙酶切，與使用psti和sali雙酶切后的pimp1質(zhì)粒[mermelsteinl.d.,welkern.e.,bennettg.n.,papoutsakise.t.expressionofclonedhomologousfermentativegenesinclostridiumacetobutylicumatcc824.naturebiotechnology,1992,10(2):190-5.]載體進(jìn)行連接，從而構(gòu)建載體質(zhì)粒pimp1-pthl；圖1為重組質(zhì)粒pimp1-pthl的結(jié)構(gòu)示意圖；利用引物：fruc-f:5’-cgcggatccatgtcaactaaggatatg(劃線部分為bamhi酶切位點(diǎn))；fruc-r:5’-cggggtaccttattcgaaaactgttat(劃線部分為kpni酶切位點(diǎn))，從基因組dna中進(jìn)行pcr擴(kuò)增930bp的fruc基因(具體序列見seqidno.1)，pcr產(chǎn)物經(jīng)bamhi和kpni進(jìn)行兩次酶切，與使用bamhi和kpni進(jìn)行兩次酶切后的pimp1-pthl質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc；圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc的結(jié)構(gòu)示意圖；

(2)過表達(dá)重組質(zhì)粒的甲基化

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入e.colidh10b(pan1)[mermelstein,l.d.&papoutsakis,e.t.invivomethylationinescherichiacolibythebacillussubtilisphagephi3timethyltransferasetoprotectplasmidsfromrestrictionupontransformationofclostridiumacetobutylicumatcc824.appliedandenvironmentalmicrobiology,1993,59(4),1077-1081.]中進(jìn)行甲基化，得到甲基化重組質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc；

(3)fruc基因過表達(dá)重組菌株的構(gòu)建

厭氧條件下，取50-100ml梭菌活化培養(yǎng)基(tgy)培養(yǎng)的對(duì)數(shù)中期(od6201.0左右)的丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824細(xì)胞液，4℃、3000rpm離心10min，去除上清液，加入50ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液(270mmol/l蔗糖，5mmol/lnah2po4，ph7.4)，洗滌兩次，并重懸至1.5ml的電轉(zhuǎn)緩沖液中，然后取100μl轉(zhuǎn)入0.4cm的電轉(zhuǎn)杯中，放置冰浴中用于電轉(zhuǎn)化，加入10μl步驟(2)所得甲基化質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc，置于冰浴中2min，采用2000v脈沖電壓和25μf的電容進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，隨后將電轉(zhuǎn)液加入到梭菌活化培養(yǎng)基tgy中，37℃培養(yǎng)4h，2000～3000rpm離心10min收集菌體細(xì)胞，將收集的細(xì)胞涂布于含有紅霉素抗性的tgy瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)36h后，獲得含有fruc基因過表達(dá)質(zhì)粒pimp1-pthl-fruc的丙酮丁醇梭菌，命名為丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)。

實(shí)施例2

重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，本實(shí)施例包括以下步驟：

將實(shí)施例1中所得重組菌株丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)和對(duì)照空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)及其出發(fā)野生型菌株c.acetobutylicumatcc824分別接種至活化培養(yǎng)基中(含10μg/ml紅霉素抗性)，置于厭氧環(huán)境中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37.5℃，活化培養(yǎng)20h用于種子培養(yǎng)；將活化的菌種按10％(v/v)接種量接種于種子培養(yǎng)基中(含10μg/ml紅霉素抗性)，置于厭氧環(huán)境中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37.5℃，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)24～30h用于厭氧發(fā)酵培養(yǎng)；采用biotec-3bg-4發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司)進(jìn)行厭氧發(fā)酵，3l發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基(含10μg/ml紅霉素抗性)裝液量為1.1l，發(fā)酵溫度控制在37～38℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，通過添加稀硫酸或氫氧化鉀溶液將接種后發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph調(diào)至5.5，接種前發(fā)酵罐通入n2以除去發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧，發(fā)酵72～168h，期間定時(shí)取樣檢測溶劑(丙酮、乙醇和丁醇)及糖含量。

本實(shí)施例中所涉及培養(yǎng)基分別按照如下方法制備：

活化培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，胰蛋白胨30，酵母粉10。

種子培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖70，乙酸銨3.22，酵母粉2.0，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：果糖70，乙酸銨3.22，酵母粉2，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。

溶劑(丙酮、乙醇和丁醇)含量測定：發(fā)酵樣品10000×g離心5min，取上清液，上清液組分濃度采用氣相色譜法測定，色譜分離條件：色譜柱：毛細(xì)管色譜柱agilenthp-innowax(30m×0.25mm×0.50μm)；柱溫：100℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；fid檢測器溫度：300℃；h2流速：40ml/min；空氣流速：400ml/min；載氣n2流速：30ml/min；進(jìn)樣量：0.2μl；分流比：50:1；采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，內(nèi)標(biāo)物使用異丁醇。

果糖含量測定：發(fā)酵樣品10000×g離心5min，取上清液，上清液果糖濃度稀釋至小于2g/l，采用dns法測定，通過計(jì)算得出發(fā)酵液中果糖濃度。

圖3為野生型菌株c.acetobutylicumatcc824、空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)、fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)在70g/l果糖中的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線；結(jié)果表明空載菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)生產(chǎn)丁醇3.4g/l，野生型菌株生產(chǎn)丁醇4.5g/l。fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)對(duì)果糖的利用率、丁醇產(chǎn)量增加，丁醇產(chǎn)量達(dá)到9.6g/l。相比空載對(duì)照組菌體，果糖利用率提高約2.8倍，丁醇產(chǎn)量提高了約3.5倍。

發(fā)酵結(jié)果如下表1所示：

表1重組菌株、對(duì)照菌株及野生菌株果糖發(fā)酵性能比較

本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明將fruc基因在丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824中過表達(dá)能顯著提高菌株對(duì)果糖的利用率以及丁醇產(chǎn)量。

實(shí)施例3

重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，本實(shí)施例包括以下步驟：

將實(shí)施例1中所得重組菌株丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)和對(duì)照空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)及其出發(fā)野生型菌株c.acetobutylicumatcc824分別接種至活化培養(yǎng)基中(含10μg/ml紅霉素抗性)，置于厭氧環(huán)境中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37.5℃，活化培養(yǎng)20h用于種子培養(yǎng)；將活化的菌種按10％(v/v)接種量接種于種子培養(yǎng)基中(含10μg/ml紅霉素抗性)，置于厭氧環(huán)境中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37.5℃，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)24～30h用于厭氧發(fā)酵培養(yǎng)；采用biotec-3bg-4發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司)進(jìn)行厭氧發(fā)酵，3l發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基(含10μg/ml紅霉素抗性)裝液量為1.1l，發(fā)酵溫度控制在37～38℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，通過添加稀硫酸或氫氧化鉀溶液將接種后發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph調(diào)至5.5，接種前發(fā)酵罐通入n2以除去發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧，發(fā)酵72～120h，期間定時(shí)取樣檢測溶劑(丙酮、乙醇和丁醇)及糖含量。

本實(shí)施例中所涉及培養(yǎng)基分別按照如下方法制備：

活化培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，胰蛋白胨30，酵母粉10。

種子培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖70，乙酸銨3.22，酵母粉2.0，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/l)：混合糖(葡萄糖：果糖＝1:4)70，乙酸銨3.22，酵母粉2，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。

溶劑(丙酮、乙醇和丁醇)含量測定：發(fā)酵樣品10000×g離心5min，取上清液，上清液組分濃度采用氣相色譜法測定，色譜分離條件：色譜柱：毛細(xì)管色譜柱agilenthp-innowax(30m×0.25mm×0.50μm)；柱溫：100℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；fid檢測器溫度：300℃；h2流速：40ml/min；空氣流速：400ml/min；載氣n2流速：30ml/min；進(jìn)樣量：0.2μl；分流比：50:1；采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，內(nèi)標(biāo)物使用異丁醇。

葡萄糖及果糖含量測定：發(fā)酵樣品10000×g離心5min，取上清液，葡萄糖及果糖濃度采用waters1525高效液相色譜測定。色譜分離條件：色譜柱：有機(jī)酸分析柱aminexhpx-87h(300mm×7.8mm；bio-rad，hercules)；流動(dòng)相：5mmol/lh2so4；流速：0.5ml/min；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：50℃；pda檢測器檢測波長：210nm。

圖4為野生型菌株c.acetobutylicumatcc824、空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)、fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)在70g/l混合糖中的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線；結(jié)果表明野生型c.acetobutylicumatcc824消耗30.6g/l的混合糖，產(chǎn)生5.3g/l丁醇，空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)消耗混合糖45.9g/l，產(chǎn)生丁醇5.6g/l，fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)對(duì)果糖的利用率及丁醇產(chǎn)量更高，至發(fā)酵結(jié)束利用了65.8g/l的混合糖，產(chǎn)生丁醇13.1g/l；相比空載對(duì)照組菌體，混合糖利用率提高了接近1.8倍，丁醇產(chǎn)量提高了約2.3倍，丁醇的產(chǎn)率與轉(zhuǎn)化率也分別提高約1.4、1.3倍。

發(fā)酵結(jié)果如下表2所示：

表2重組菌株、對(duì)照菌株及野生菌株混合糖發(fā)酵性能比較

本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明將fruc基因在丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824中過表達(dá)能顯著提高菌株混合糖利用率及丁醇發(fā)酵產(chǎn)量。

實(shí)施例4

重組菌株發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，本實(shí)施例包括以下步驟：

將實(shí)施例1中所得重組菌株丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)和對(duì)照空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)及其出發(fā)野生型菌株c.acetobutylicumatcc824分別接種至活化培養(yǎng)基中(含10μg/ml紅霉素抗性)，置于厭氧環(huán)境中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37.5℃，活化培養(yǎng)20h用于種子培養(yǎng)；將活化的菌種按10％(v/v)接種量接種于種子培養(yǎng)基中(含10μg/ml紅霉素抗性)，置于厭氧環(huán)境中搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37.5℃，轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)24～30h用于厭氧發(fā)酵培養(yǎng)；采用biotec-3bg-4發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備工程有限公司)進(jìn)行厭氧發(fā)酵，3l發(fā)酵罐培養(yǎng)時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)基(含10μg/ml紅霉素抗性)裝液量為1.1l，發(fā)酵溫度控制在37～38℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，通過添加稀硫酸或氫氧化鉀溶液將接種后發(fā)酵培養(yǎng)基初始ph調(diào)至5.5，接種前發(fā)酵罐通入n2以除去發(fā)酵培養(yǎng)基中的溶氧，發(fā)酵80～104h，期間定時(shí)取樣檢測溶劑(丙酮、乙醇和丁醇)及糖含量。

本實(shí)施例中所涉及培養(yǎng)基分別按照如下方法制備：

活化培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖20，胰蛋白胨30，酵母粉10。

種子培養(yǎng)基(g/l)：葡萄糖70，乙酸銨3.22，酵母粉2.0，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01。

菊芋水解液培養(yǎng)基(g/l)：乙酸銨3.22，酵母粉2，mgso4·7h2o0.2，kh2po40.5，k2hpo40.5，feso4·7h2o0.01，mnso4·7h2o0.01，生物素0.01，對(duì)氨基苯甲酸0.01；加菊芋水解液(含葡萄糖約15g/l，果糖約60g/l)定容。

溶劑(丙酮、乙醇和丁醇)含量測定：發(fā)酵樣品10000×g離心5min，取上清液，上清液組分濃度采用氣相色譜法測定，色譜分離條件：色譜柱：毛細(xì)管色譜柱agilenthp-innowax(30m×0.25mm×0.50μm)；柱溫：100℃；進(jìn)樣口溫度：250℃；fid檢測器溫度：300℃；h2流速：40ml/min；空氣流速：400ml/min；載氣n2流速：30ml/min；進(jìn)樣量：0.2μl；分流比：50:1；采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，內(nèi)標(biāo)物使用異丁醇。

葡萄糖及果糖含量測定：發(fā)酵樣品10000×g離心5min，取上清液，葡萄糖及果糖濃度采用waters1525高效液相色譜測定。色譜分離條件：色譜柱：有機(jī)酸分析柱aminexhpx-87h(300mm×7.8mm；bio-rad，hercules)；流動(dòng)相：5mmol/lh2so4；流速：0.5ml/min；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：50℃；pda檢測器檢測波長：210nm。

圖5為野生型菌株c.acetobutylicumatcc824、空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)、fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)在菊芋水解液(葡萄糖約15g/l，果糖約60g/l)中的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線；結(jié)果表明野生型c.acetobutylicumatcc824利用糖34.7g/l，生產(chǎn)丁醇5.0g/l，空載質(zhì)粒菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1)利用糖35.1g/l，生產(chǎn)丁醇5.4g/l。fruc基因過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)對(duì)菊芋水解液中糖的利用率以及丁醇產(chǎn)量均有較高提升。發(fā)酵終止，過表達(dá)重組菌株c.acetobutylicumatcc824(pimp1-fruc)利用了50.1g/l糖，產(chǎn)生7.7g/l的丁醇；相比空載對(duì)照組菌體，糖利用率提高了約1.4倍，丁醇產(chǎn)量提高了1.4倍以上，丁醇的產(chǎn)率提高約1.4倍。

發(fā)酵結(jié)果如下表3所示：

表3重組菌株、對(duì)照菌株及野生菌菊芋水解液發(fā)酵性能比較

本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明將fruc基因在丙酮丁醇梭菌c.acetobutylicumatcc824中過表達(dá)能顯著提高菌株對(duì)菊芋水解液中糖的利用率及丁醇發(fā)酵產(chǎn)量。

序列表

<110>大連理工大學(xué)

<120>一種fruc基因過表達(dá)的重組梭菌、其構(gòu)建方法及應(yīng)用

<130>2011

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>444

<212>dna

<213>fruc基因的核苷酸序列

<400>1

atgtcaactaaggatatgttttcaaaagaaagggtcacatttaatcttaaagctaaaact60

aaggaagaagccataaatgagcttatagaaattttatataatgacggaaaggttactgat120

aaggaagaattaaaaagagctgtattaaaaagagaagaggaattctctactggtataggt180

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ggattaagcaaagagggaatagactatcagtcaatggatgataaaccagcgcatttattc300

tttttaatagctgttccagaagaatctagtgacatacatcttaaggctttaagtgaaata360

tcaagaaaacttatgcatacagaagtaagagaaaaaataaagaatgcccaaagttttgaa420

gagtttataacagttttcgaataa444

<210>2

<211>147

<212>protein

<213>fruc基因編碼的蛋白質(zhì)fruc的氨基酸序列

<400>2

mstkdmfskervtfnlkaktkeeainelieilyndgkvtdkeelkravlkreeefstgig60

mgiaiphgkcsavkeaaitfglskegidyqsmddkpahlffliavpeessdihlkalsei120

srklmhtevrekiknaqsfeefitvfe147

<210>3

<211>153

<212>dna

<213>硫解酶的啟動(dòng)子基因的核苷酸序列

<400>3

tttttaacaaaatatattgataaaaataataatagtgggtataattaagttgttagagaa60

aacgtataaattagggataaactatggaacttatgaaatagattgaaatggtttatctgt120

taccccgtatcaaaatttaggaggttagttaga153