本發(fā)明涉及基因重組的測定，具體地說涉及一種alk基因重組的測定方法。
背景技術：
在癌癥中經(jīng)常觀察到遺傳改變導致激酶的組成型激活。1994年morris等首先發(fā)現(xiàn)間變性大細胞淋巴瘤(alcl)中的間變性淋巴瘤激酶(alk)融合到核磷蛋白(npm)。在過去的20年中，發(fā)現(xiàn)大量的蛋白質融合到alk并形成官能嵌合蛋白，例如在許多不同類型的人類癌癥中，包括alcl、彌漫性大b細胞淋巴瘤(dlbcl)、炎性肌纖維母細胞瘤、食管癌、乳腺癌、結腸癌、甲狀腺癌、腎細胞癌和非小細胞肺癌(nsclc)等。這些致癌融合蛋白與染色體易位或倒位相關。
在許多情況下，腫瘤細胞的生長和存活依賴于活化的激酶，使得抑制其活性成為一種有效的抗癌療法。已經(jīng)出現(xiàn)用于癌癥患者的酪氨酸激酶抑制劑(tki)，例如pfizer公司的首個口服alk抑制劑
在全球范圍內(nèi)約5-7％的肺癌腫瘤具有alk重組。所以對新診斷的晚期nsclc建議測試alk的重組狀態(tài)被認為是常規(guī)的臨床實踐。然而，加拿大、日本和德國的晚期nsclc患者中只有不到1/3的患者確定了其alk狀態(tài)，從而可用于一線治療的決策，而與其相比美國確定其alk狀態(tài)的患者超過一半(www.kantarhealth.com/infographics/nsclc)。從最初的咨詢到最終 的測試結果，患者需要等待2-3個星期，而這種等待會延誤癌癥患者的病情確定和治療開始。iv期肺癌患者的中位數(shù)未治療預期壽命為大約16周，因此時間不宜過度花費在等待測試結果上?；蛘?，病人總是選擇在組織學檢查后進行至少一個療程的化療，然后在化療時等待alk雜合狀態(tài)信息。
有幾種檢測alk重組或雜合的商業(yè)化試驗。一種是雅培vysisalk斷裂分離fish探針測試，這被認為是金標準方法。其他方法包括roche集團成員ventanamedicalsystems公司的ventanaalk免疫組織化學(ihc)測定，這種方法已被視為替代篩選方法來選擇用于alkfish檢測的標本。另一種方法是amoydx(中國廈門)的實時pcr方法，其僅在中國被批準用于檢測肺癌患者alk雜合。下一代測序提供了在單次測定中檢測多個分子變化的能力，但它可能需要幾個星期才能完成實驗和數(shù)據(jù)分析。雖然測序技術創(chuàng)新是非常有前途的，但目前該方法的敏感性、特異性和臨床有效性在臨床上沒有足夠的數(shù)據(jù)。已經(jīng)報道克唑替尼療法的臨床反應在少數(shù)情況下與診斷結果不一致。
因此，目前有很大的空間以改善目前的alk重組測試，從而幫助患者更為適宜的治療。
技術實現(xiàn)要素：
在一個方面，本發(fā)明涉及一種測定生物樣品中alk基因重組的方法，所述方法包括測定所述生物樣品中sweyjawbu基因的表達水平，其中sweyjawbu基因的序列如seqidno:1所述或與seqidno:1具有至少90％的同一性。
在本發(fā)明的另一個方面，sweyjawbu基因的序列與seqidno:1具有至少95％、優(yōu)選98％、更優(yōu)選99％的同一性。
在本發(fā)明的另一個方面，sweyjawbu基因的表達水平通過測定rna或cdna的水平來測定。
在本發(fā)明的另一個方面，sweyjawbu基因的表達水平通過pcr測定，優(yōu)選熒光定量pcr，所述pcr使用的引物的序列如seqidno:2和3所述。
在本發(fā)明的另一個方面，sweyjawbu基因的表達水平測定自患者的腫瘤組織，所述腫瘤組織選自手術切除組織、穿刺活檢樣本、胸水樣本、腦脊 液樣本、血液樣本和其它體液樣本。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的方法進一步包括將患者腫瘤組織中的sweyjawbu基因的表達水平與該患者正常組織中的sweyjawbu基因的表達水平相比較，其中腫瘤組織中的sweyjawbu基因表達水平高于正常組織中的sweyjawbu基因表達水平表示該患者腫瘤的alk基因重組陽性。
在本發(fā)明的另一個方面，sweyjawbu基因的表達水平通過δct值測定，δct＝ctsweyjawbu-gm(ctesd,cthprt1)，gm(ctesd,cthprt1)為ctesd和cthprt1的幾何平均數(shù)。在本發(fā)明的另一個方面，δct低于1.8表示alk基因重組陽性。
本發(fā)明的一個方面涉及一種用于檢測alk基因重組的試劑盒，所述試劑盒包括用于測定所述生物樣品中sweyjawbu基因的表達水平的特異性試劑，其中sweyjawbu基因的序列如seqidno:1所述或與seqidno:1具有至少90％的同一性。在本發(fā)明的另一個方面，sweyjawbu基因的序列與seqidno:1具有至少95％、優(yōu)選98％、更優(yōu)選99％的同一性。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的試劑盒包括至少兩份用于測定sweyjawbu基因的表達水平的特異性試劑，所述特異性試劑分別用于相同患者的腫瘤組織和正常組織。在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的試劑盒還包括用于測定esd和hprt1基因的表達水平的特異性試劑。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明的試劑盒還包括標簽，所述標簽具有說明所述試劑盒用于檢測alk基因重組的內(nèi)容。在本發(fā)明的另一個方面，試劑盒的標簽還具有以下內(nèi)容：
1)說明本發(fā)明試劑盒用于將患者腫瘤組織中的sweyjawbu基因的表達水平與該患者正常組織中的sweyjawbu基因的表達水平相比較，其中腫瘤組織中的sweyjawbu基因表達水平高于正常組織中的sweyjawbu基因表達水平表示該患者腫瘤的alk基因重組陽性；或
2)說明本發(fā)明試劑盒用于測定sweyjawbu基因的表達水平的δct值，其中δct＝ctsweyjawbu-gm(ctesd,cthprt1)，gm(ctesd,cthprt1)為ctesd和cthprt1的幾何平均數(shù)，δct低于1.8表示alk基因重組陽性。
本發(fā)明的一個方面涉及一種檢測患者是否符合alk抑制劑藥物治療標準的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的方法測定所述患者腫瘤中的alk基因重組。如果測定結果表明該患者腫瘤的alk基因重組呈陽性，則該患者 可使用alk抑制劑藥物進行治療。
本發(fā)明的這些和其它內(nèi)容通過以下附圖和具體實施方式以示例的方式說明。
附圖說明
圖1顯示了sweyjawbu基因(上排)和其中的snp位點(下排)，其中y表示c或t，s表示g或c，w表示a或t，r表示a或g。下劃線標出的部分分別對應于seqidno:2或3所示的5’引物和3’引物。
圖2顯示了alk陽性和alk陰性肺癌細胞株之間的sweyjawbu基因相對基因表達(ct)值的差異，圖2a為比較探針242964_at的信號強度，圖2b為sweyjawbu基因相對基因表達(ct)值。探針242964_at的信號強度來自cancercelllineencyclopedia，www.broadinstitute.org/ccle。pcr實驗進行四個重復。
圖3顯示了患者的alk陽性肺癌和alk陰性肺癌之間觀察到的差異，比較了sweyjawbu基因的ct值(a)，alk轉錄物5'部分和3'部分的ct值(b)，以及sweyjawbu基因的ct值+alk轉錄物5'部分和3'部分的ct值(c)。研究納入30個肺腺癌(棕色+黑色)，4個大細胞癌(黑色)，20個鱗狀細胞癌(橙色)，12個正常組織(灰色)。通過fish確認5個腺癌和1個大細胞癌為alk陽性，表現(xiàn)出最低的ct值。整體而言，ctsweyjawbu在alk陽性和alk陰性樣品之間顯示出明顯差異，p值等于4.59e-06。ctalk3'/5'在alk陽性和alk陰性樣品之間顯示出更高的差異，p值等于6.45e-18。在將ctsweyjawbu和ctalk3'/5'相加時觀察到最高的alk陽性和alk陰性樣品之間的差異，p值等于5.99e-20。
具體實施方式
本文中使用的術語“alk基因”是指間變性淋巴瘤激酶或cd246，其是在間變性大細胞淋巴瘤中最初鑒定的核磷酸蛋白(npm)-alk的胰島素受體超家族中的受體酪氨酸激酶(morris等(1994)，science263:1281-1284；morris等(1997)，oncogene14:2175-2188)。隨后的研究已鑒定了彌漫性大b細胞淋巴瘤、惡性組織細胞增生癥、炎性肌纖維母細胞瘤肉瘤、食管鱗狀細胞癌、乳腺癌、結腸直腸癌和非小細胞肺癌亞類中的alk重組(請見webb等 (2009)，expertrevanticancerther9:331-356)。alk多肽為包含細胞外配體結合區(qū)、跨膜結構域和細胞質激酶催化區(qū)的單鏈跨膜蛋白。alk由人體內(nèi)的染色體帶2p23(morris等，(1994)science263:1281-1284；shiota等，(1994)oncogene9:1567-1574)上的基因座編碼。
本文中使用的術語“alk基因重組”是指alk基因與正常染色體的相鄰部分斷裂并與染色體的其它片斷連接，從而導致異常，例如alk的基因組dna擴增、蛋白質過表達以及激活點突變。
本文中使用的術語“sweyjawbu基因”是一種非編碼rna，其位于人2號染色體。該基因在人中低豐度表達，僅相當于數(shù)據(jù)庫中基因平均表達量的5.5％。該基因的序列由來源于5個cdna克隆的7個genbank登錄號確定。
本文中使用的術語“esd基因”是指編碼屬于酯酶d家族的絲氨酸水解酶的基因。該基因所編碼的酶對各種底物有活性，包括o-乙酰化的唾液酸，可能參與唾液酸的再循環(huán)。該基因常常被用作視網(wǎng)膜母細胞瘤和威爾森氏病的遺傳標記。
本文中使用的術語“hprt1基因”是指編碼次黃嘌呤磷酸核苷轉移酶1的基因，該酶通過5-磷酸核糖-1-焦磷酸的5-磷酸基團的轉移而催化次黃嘌呤轉化為肌苷酸和鳥嘌呤轉化為磷酸鳥苷，在嘌呤核苷酸的生成中通過嘌呤補救途徑起中心作用。該基因的突變可導致萊-尼綜合征或痛風。
本文中使用的術語“表達水平”是指基因的轉錄、翻譯所產(chǎn)生產(chǎn)物的量。在調(diào)節(jié)機制控制下，基因經(jīng)歷基因激活、轉錄及翻譯等過程，產(chǎn)生具有生物學功能的蛋白質分子。由于環(huán)境等因素的影響，同一基因在不同個體、甚至相同個體的不同組織中可能具有完全不同的量的轉錄產(chǎn)物或翻譯產(chǎn)物，即具有不同的表達水平。通?；虻谋磉_水平一般通過該基因轉錄的mrna的水平來衡量。
本文中使用的術語“同一性”是指在兩個或多個多核苷酸序列的情況下，比對指定比較窗口的最高一致度時序列中相同的殘基。當采用百分比時，序列同一性百分比是指通過對比較窗口上兩個最佳比對序列進行比較確定的值，其中對于兩個序列的最佳比對而言，與參考序列(不包含添加或缺失)相比，比較窗口中的多核苷酸序列部分可能包含添加或缺失(即，空位)。百分比通過以下計算：確定兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基或氨基酸殘基的位 置數(shù)量以獲得匹配位置的數(shù)量，將匹配位置的數(shù)量除以比較窗口中的位置總數(shù)，并且將結果乘以100以獲得序列同一性百分比。
除非另有規(guī)定，本文提供的序列同一性/相似性值指使用gap版本10及其等效程序，使用以下參數(shù)獲得的核苷酸序列的同一性百分比值：gap起始罰分為50，gap延伸罰分為3，使用nwsgapdna.cmp評分矩陣。“等效程序”意指對于討論中的任兩個序列而言，當與用gap版本10產(chǎn)生的相應比對相比時，產(chǎn)生具有相同核苷酸匹配和相同序列同一性百分比的比對的任何序列比較程序。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明方法可用于具有各種snp的sweyjawbu基因，例如圖1中所示的具有snp的sweyjawbu基因。因此，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明中的sweyjawbu基因的序列與seqidno:1具有至少95％、優(yōu)選至少98％、更優(yōu)選至少99％的同一性。
本文中使用的術語“pcr”是指聚合酶鏈式反應，是通過至少一種聚合酶的作用借助特異性擴增引物產(chǎn)生靶核苷酸片段的多個拷貝的過程。這種擴增反應是本領域技術人員公知的。當擴增是在逆轉錄反應后進行的pcr時，其被稱作rt-pcr。
本文中使用的術語“實時熒光定量pcr”是指在pcr擴增反應的過程中，以熒光化學物質測定每次pcr循環(huán)后產(chǎn)物總量，通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定dna序列進行定量分析的方法。每一輪循環(huán)中pcr的產(chǎn)物量都以熒光信號的形式被pcr儀的光學檢測系統(tǒng)記錄下來，在某一循環(huán)中熒光信號的強度達到預先設定的閾值時，此時的循環(huán)數(shù)稱為ct值(thresholdcycle)。ct值與起始的模板量成反比，即起始的pcr模板量越多，達到閾值的循環(huán)數(shù)即ct值越小。例如，本領域技術人員可理解，ctesd和cthprt1表示esd和hprt1達到閾值的循環(huán)數(shù)。
本文中使用的術語“δct值”是指ct值的差。
本文中使用的術語“生物樣品”是指來源于患者的任何材料，其可能含有能夠檢測基因表達的生物材料。生物樣品可以是患者的血液、血清、唾液、組織或循環(huán)細胞的樣品。這類生物樣品可以通過本領域技術人員已知的任何取樣方式獲得，例如血液樣品可通過抽血獲得。本文中使用的術語“生物材料”表示能夠檢測基因表達的任何材料，例如核酸或蛋白，或其編碼序列。核酸可以尤其是rna(核糖核酸)諸如mrna(信使rna)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選 的實施方案，生物材料是核酸，甚至更優(yōu)選是mrna。從生物樣品提取生物材料可以通過本領域技術人員公知的提取核酸或蛋白的所有方案來實施。
本文中使用的術語“腫瘤組織”是指構成腫瘤的主要部分的組織。通常，腫瘤組織包括實質和間質兩部分，其中腫瘤實質是腫瘤細胞，具有組織來源特異性。腫瘤的間質起支持和營養(yǎng)腫瘤實質的作用，不具特異性，一般由結締組織和血管組成，有時還可有淋巴管。腫瘤組織可從各種來源獲得，包括但不限于手術切除組織、穿刺活檢樣本、胸水樣本、腦脊液樣本和其它體液樣本。
本發(fā)明的方法和試劑盒可用于各種腫瘤，包括但不限于所有形式的癌、黑素瘤、肉瘤、淋巴瘤和白血病，例如肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、腸癌、腎癌、膀胱癌、尿道癌、前列腺癌、肝癌、骨癌、神經(jīng)系統(tǒng)癌癥、子宮癌、卵巢癌、血癌、皮膚癌等。
本文中使用的術語“正常組織”是指具有正常功能和結構的非腫瘤組織。本領域技術人員可理解，同一個體中不同的正常組織可具有不同的基因表達譜。因此，在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的方法或試劑盒使用與腫瘤組織來源相同或相近的正常組織。
本文中使用的術語“標簽”是指任何與試劑盒相關聯(lián)的、提供試劑盒相關信息的材料。標簽可包括在試劑盒的商業(yè)包裝中，例如作為獨立的說明書，或者可貼在試劑盒內(nèi)的容器上，或者直接打印到容器上，或者可直接印刷在試劑盒的商業(yè)包裝的外表面。標簽可包含任何與試劑盒相關的信息，例如試劑盒的生產(chǎn)商、用途、使用方法、注意事項和/或關于使用此類產(chǎn)品的警告的信息。本發(fā)明的標簽可為任何形式，例如包裝、插頁、印刷材料、多媒體、互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)址、條形碼等。
根據(jù)本發(fā)明的目的，總rna的提取可通過裂解存在于血液樣品中的細胞以釋放出患者細胞所包含的核酸的步驟實現(xiàn)。意在舉例，可使用如在專利申請wo00/05338(其關于混合磁性和機械裂解)、wo99/53304(其關于電裂解)、wo99/15321(其關于機械裂解)中描述的裂解方法。本領域技術人員可使用其它公知的裂解方法，例如熱休克或滲透休克或使用離液劑例如胍鹽的化學裂解(美國專利號5，234，809)。還可能提供額外的步驟，用于從在裂解步驟中釋放的其它細胞成分分離核酸。這通常使?jié)饪s核酸成為可能。 意在舉例，可使用任選地通過吸附或共價作用用寡核苷酸包被的磁性顆粒(在這方面，見美國專利號4,672,040和美國專利號5,750,338)，并由此可通過洗滌步驟純化結合于這些磁性顆粒的核酸。如·果需要隨后擴增所述核酸，此核酸純化步驟是特別有利的。在專利申請wo97/45202和wo99/35500中描述了這些磁性顆粒特別有利的實施方案。
本文中使用的術語”特異性試劑”是指這樣的試劑，當使其與如上述定義的生物學材料接觸時，可與對所述靶基因特異的材料相結合。意在說明，當特異性試劑和生物學材料是核來源時，使特異性試劑與生物學材料接觸可使特異性試劑與對所述靶基因特異的材料雜交。術語“雜交”是指這樣的過程，即在所述過程期間在適當?shù)臈l件下，兩個核苷酸片段以穩(wěn)定和特異的氫鍵結合從而形成雙鏈復合物。這些氫鍵在互補的腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)(或尿嘧啶(u))堿基之間(這被稱為a-t鍵)，或在互補的鳥嘌呤(g)和胞嘧啶(c)堿基之間(這被稱為g-c鍵)形成。兩個核苷酸片段的雜交可為完全的(稱作互補核苷酸片段或序列)，即在此雜交過程中所獲得的雙鏈復合物只包含a-t鍵和c-g鍵。此雜交可為部分的(稱作充分互補核苷酸片段或序列)，即所獲得的雙鏈復合物既包含使得可能形成雙鏈的a-t鍵和c-g鍵，也包含沒有與互補堿基結合的堿基。兩條核苷酸片段之間的雜交取決于所使用的工作條件，特別是嚴格性。嚴格性具體定義為兩個核苷酸片段的堿基組成的函數(shù)并且還由兩條核苷酸片段之間的錯配程度定義。嚴格性還取決于反應參數(shù)，例如存在于雜交溶液中的離子濃度和類型、變性劑的性質和濃度和/或雜交溫度。所有這些數(shù)據(jù)是公知的，并且可由本領域技術人員確定適當?shù)臈l件。一般來說，根據(jù)需要雜交的核苷酸片段的長度，雜交溫度為大約20℃至70℃，特別是35℃至65℃，在濃度大約0.5-1m的鹽溶液中。序列，或核苷酸片段，或寡核苷酸，或多核苷酸，是一系列通過磷酸酯鍵組裝在一起的核苷酸基序，特征為含信息的天然核酸序列，其能夠與核苷酸片段雜交，所述系列可能含有具有不同結構的單體，并可能從天然核酸分子和/或通過遺傳重組和/或通過化學合成獲得?；蚴菃误w的衍生物，所述單體可為核酸的天然核苷酸，其構成元件是糖、磷酸基團和含氮堿基；在dna中，所述糖是脫氧-2-核糖，在rna中，所述糖是核糖；根據(jù)是否涉及dna和rna,含氮堿基選自腺嘌呤、鳥嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；可選地，單體為三種構成元件中的至少一種被修飾的核苷酸；意在 舉例，修飾可發(fā)生在堿基水平(具有修飾的堿基例如肌苷、甲基-5-脫氧胞苷、脫氧尿苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷、二氨基-2,6-嘌呤、溴-5-脫氧尿苷或任何其它能夠雜交的修飾的堿基)，或發(fā)生在糖的水平(例如至少一個脫氧核糖替換為聚酰胺(p.e.nielsen等人，science,254，1497-1500(1991)[3]))，或另外發(fā)生在磷酸基團水平(例如替換為酯，具體選自二磷酸酯、烷基磷酸酯和?；姿狨ヒ约傲虼姿狨?。
根據(jù)本發(fā)明具體的實施方案，所述特異性試劑包括至少一種雜交探針，或至少一種雜交探針和至少一種對靶基因特異的引物，或至少一種雜交探針和兩種對靶基因特異的引物。
本文中使用的術語“擴增引物”指核苷酸片段，其包含5-100個核苷酸，優(yōu)選15-30個核苷酸，其使得酶促聚合例如酶促擴增反應起始。術語“酶促擴增反應”是指通過至少一種酶的作用產(chǎn)生多拷貝核苷酸片段的過程。這樣的擴增反應是本領域技術人員公知的，并特別提到下述技術：pcr(聚合酶鏈式反應)(如在美國專利號4,683,195、美國專利號4,683,202和美國專利號4,800,159中描述)，lcr(連接酶鏈式反應)(例如在專利申請ep0201184中公開)，rcr(修復鏈式反應)(在專利申請wo90/01069中描述)，3sr(自主序列復制)(專利申請wo90/06995)，nasba(基于核酸序列的擴增)(專利申請wo91/02818)，tma(轉錄介導擴增)(美國專利號5，399，491)和rt-pcr。
當酶促擴增為pcr時，特異性試劑包括至少兩種靶基因特異的擴增引物，其允許擴增靶基因特異的材料。對靶基因特異的材料則優(yōu)選包含通過反轉錄來自靶基因的信使rna獲得的互補dna(稱作靶基因特異的cdna)或通過轉錄靶基因特異的cdna獲得的互補rna(稱作靶基因特異的crna)。當酶促擴增為反轉錄反應后完成的pcr，稱作rt-pcr。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明的方法和試劑盒可使用序列如seqidno:2和3所述的引物。
本文中使用的術語“雜交探針”是指核苷酸片段，其包含至少5個核苷酸，例如5-100個核苷酸，特別是10-75個核苷酸，例如15-35個核苷酸和60-70個核苷酸，其在給定條件下具有雜交特異性從而與對靶基因特異的材料形成雜交復合物。在本發(fā)明中，對靶基因特異的材料可為包含在源自靶基因的信使rna中的核苷酸序列(稱作靶基因特異的mrna)、包含在通過反轉錄所述信使rna獲得的互補dna中的核苷酸序列(稱作靶基因特異的 cdna)、或另外為包含在通過轉錄如上文描述的所述cdna獲得的互補rna中的核苷酸序列(稱作靶基因特異的crna)。雜交探針可包含用于其檢測的標簽。術語“檢測”是指直接檢測例如計數(shù)方法，或間接檢測，其通過使用標簽的檢測方法。存在許多用于檢測核酸的檢測方法(見，例如，kricka等人,clinicalchemistry,1999,no45(4),453-458頁，或kellerg.h.等人，dnaprobes,2nded.，stocktonpress,1993，第5和第6部分，173-249頁)。術語“標簽”是指能夠產(chǎn)生可被檢測到的信號的示蹤劑。這些示蹤劑的非限制性的列表包括酶(其通過例如比色、熒光或發(fā)光產(chǎn)生可檢測到的信號)，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、3-半乳糖苷酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；發(fā)色團，例如熒光劑、發(fā)光劑或染料化合物；電子致密基團，其可通過電子顯微鏡檢測或可通過它們的電子特性例如電導率由安培法或伏安法或通過阻抗測量檢測；可通過光學方法如衍射、表面等離子體共振或接觸角變化，或通過物理學方法例如原子力光譜，隧道效應等檢測的基團；放射性分子，例如32p、35s或125i。
根據(jù)本發(fā)明的目的，雜交探針可為“檢測”探針。在這種情況下，用標簽對“檢測”探針進行標記。檢測探針可具體為如tyagi和kramer(naturebiotech,1996,14:303-308)所描述的“分子信標”檢測探針。這些“分子信標”在雜交期間變成熒光劑。它們具有莖-環(huán)型結構并包含熒光團和“猝滅”基團。特異的環(huán)序列與其互補靶核酸序列的結合導致莖展開并在適當?shù)牟ㄩL激發(fā)過程中發(fā)出熒光信號。檢測探針可具體為根據(jù)nanostringtm的技術的包含“彩色編碼的條形碼”的“報告探針”。
為了檢測雜交反應，可使用直接地(具體是通過將標簽摻入靶序列)或間接地(具體是使用如上述定義的檢測探針)標記的靶序列。特別地，在雜交步驟之前可能進行標記和/或切割靶序列的步驟，例如在酶促擴增反應過程中使用標記的脫氧核糖核苷三磷酸。所述切割具體可通過咪唑或氯化錳的作用完成。還可根據(jù)例如在文獻wo91/19812中描述的夾心雜交技術通過與檢測探針雜交而在擴增步驟之后標記靶序列。在申請fr2780059中描述了另一具體的標記核酸的優(yōu)選方法。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，檢測探針包含熒光團和猝滅劑。根據(jù)本發(fā)明甚至更優(yōu)選的實施方案，雜交探針在其5’端包含fam(6-羧基熒光素)或rox(6-羧基-x-羅丹明)熒光團并在其3’端包含猝滅劑(dabsyl)。
雜交探針還可為“捕獲”探針。在這種情況下，通過任何適當?shù)姆椒?，即直接地或間接地，例如通過共價或吸附，“捕獲”探針被固定或可能被固定在固體基材上。作為固體基材，可使用合成材料或天然材料(任選地為化學修飾的)，具體為多糖例如基于纖維素的材料例如紙，纖維素衍生物例如醋酸纖維素和硝酸纖維素或葡聚糖，聚合物，共聚物(特別是基于苯乙烯型單體的)，天然纖維例如棉花，和合成纖維例如尼龍；無機材料例如二氧化硅、石英、玻璃或陶瓷；乳膠；磁性顆粒；金屬衍生物、凝膠等。固體基材可為微量滴定板、膜(如在申請wo94/12670中描述的)或顆粒的形式。還可能將若干不同的捕獲探針固定在基材上，每種捕獲探針對一種靶基因特異。具體地，可使用生物芯片作為基材，其上可固定大量探針。術語“生物芯片”是指小體積的固體基材，大量的捕獲探針可在預定的位置連接于其上。生物芯片(或dna芯片)的概念可追溯到1990年代初期。它基于多學科技術，整合了微電子、核酸化學、圖像分析和信息技術。工作原理基于分子生物學的基礎：雜交現(xiàn)象，即兩條dna和/或rna序列通過喊基互補的配對。生物芯片方法基于連接在固體基材上的捕獲探針的使用，直接或間接地標記熒光染料的靶核苷酸片段樣品作用于所述捕獲探針。捕獲探針特異地定位于基材或芯片上，并且每個雜交給出與靶核苷酸片段有關的一條具體信息。所獲得的信息是累積性的，使例如定量一或多個靶基因的表達水平成為可能。然后為了分析靶基因的表達，可制備包含大量探針的基材，所述探針對應于轉錄成mrna的靶基因的全部或部分。為了本發(fā)明的目的，術語“低密度基材”是指包含少于50種探針的基材。為了本發(fā)明的目的，術語“中密度基材”是指包含從50種探針至10000種探針的基材。為了本發(fā)明的目的，術語“高密度基材”是指包含多于10000種探針的基材。
隨后將特異于需要分析的靶基因的cdna或crna與例如特異的捕獲探針雜交。雜交之后，洗滌基材或芯片，并通過與例如熒光染料型標簽結合的高親和性配體顯示標記的cdna或crna/捕獲抗體復合物。用例如掃描儀讀取熒光并通過信息技術進行熒光分析。意在說明，可提到由affymetrix公司開發(fā)的，用于分子診斷的dna芯片(“accessinggeneticinformationwithhigh-densitydnaarrays，，，m.chee等人，science,1996,274,610-614。“l(fā)ight-generatedoligonucleotidearraysforrapiddnasequenceanalysis，，，a.cavianipease等proc.natl.acad.sc1. usa,1994,91,5022-5026)。在此技術中，捕獲探針一般較小，約25個核苷酸。在出版物g.ramsay，naturebiotechnology,1998,no.16,40-44頁；f.ginot,humanmutation,1997,no.10,1-10頁；j.cheng等人，moleculardiagnosis,1996,no.1(3)，183-200頁；t.livache等人，nucleicacidsresearch,1994,no.22(15),2915-2921頁；j.cheng等人,naturebiotechnology,1998，no.16，541-546頁或在美國專利號4,981,783、美國專利號5,700,637、美國專利號5,445,934、美國專利號5,744,305和美國專利號5,807,522中給出了生物芯片其它的實例。固體基材的主要特征應為保持捕獲探針對靶核苷酸片段的雜交特征，而同時產(chǎn)生對檢測方法最小的背景噪音。探針在基材上的固定可區(qū)分為三種主要類型。
首先，存在第一種技術，其在于沉積預先合成的探針。探針的連接通過直接轉移完成，其通過微量移液器(micropipette)或微點(microdot)或通過噴墨裝置。此技術允許連接大小范圍從幾個堿基(5-10)至相對大的60堿基(打印法)至數(shù)百堿基(微沉積法)的探針。
打印法是對噴墨打印機使用的方法的改變。其基于以可達到4000滴/秒的速率推進非常小的液球(體積〈1nl)。打印法不涉及釋放液體的系統(tǒng)與液體沉積于其上的表面之間的任何接觸。微沉積法特征在于將數(shù)十至數(shù)百堿基的長探針連接到玻璃載片的表面。這些探針通常提取自數(shù)據(jù)庫并為經(jīng)擴增及經(jīng)純化的產(chǎn)物形式。此技術使生產(chǎn)稱為微陣列的芯片成為可能，所述芯片在略小于4平方厘米的表面積(稱為識別區(qū)域)上攜帶大約一萬個dna點。然而，不應忘記尼龍膜(稱為“巨陣列(macroarray)”)的用途，其以最大25點/平方厘米的密度攜帶直徑0.5-1mm的擴增后產(chǎn)物(一般通過pcr)。許多實驗室都使用這種非常靈活的技術。在本發(fā)明中，生物芯片考慮包括后一種技術。然而，如專利申請wo00/71750和fr00/14896的情況下，可將一定體積的樣品沉積在微量滴定板每個孔的底部，或根據(jù)另一個專利申請fr00/14691，可將一定數(shù)量彼此分離的液滴沉積于同一個無菌培養(yǎng)皿底部。
第二種用于將探針連接于基材或芯片的技術稱作原位合成。此技術導致在芯片表面直接地產(chǎn)生短探針。其基于原位寡核苷酸合成(具體見wo89/10977和wo90/03382)并且基于寡核苷酸合成儀方法。其在于沿玻璃表面移動反應室，在所述反應室中發(fā)生核苷酸延伸反應。
最后，第三種技術稱為光蝕刻技術，其為affymetrix開發(fā)的用于生物芯片的方法。其也是原位合成。光蝕刻技術源于微處理器技術。通過連接光不穩(wěn)定(可被光活化)化學基團來修飾芯片表面。一旦被光照，這些基團能夠與寡核苷酸的3’端反應。通過用限定形狀的避光罩保護此表面，就可能選擇性地光照并因此活化期望連接四種核苷酸之一或其它核苷酸的區(qū)域。連續(xù)使用不同的避光罩使得可能交替進行保護/反應循環(huán)并因此在大約數(shù)十平方微米(pm2)的點上生產(chǎn)寡核苷酸探針。此分辨率使得可能在數(shù)平方厘米(cm2)的表面積上產(chǎn)生多至數(shù)十萬個點。光蝕刻技術具有優(yōu)點：批量平行，它使得可能僅經(jīng)4乘n個循環(huán)產(chǎn)生n聚體芯片。所有這些技術可用于本發(fā)明。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，如上述定義的步驟b)的至少一種特異性試劑包括至少一種雜交探針，其優(yōu)選固定于基材上。此基材優(yōu)選為如上述定義的低、高或中密度基材。
為了提高靶遺傳材料的量，可在包含大量探針的基材上的這些雜交步驟之前進行如上述定義的酶促擴增反應步驟。
可通過本領域技術人員已知的任何方案完成中靶基因表達水平的確定?？偟膩碚f，可通過檢測在給定時刻從靶基因轉錄的mrna(信使rna)來分析靶基因的表達。
本發(fā)明優(yōu)選涉及通過根據(jù)本領域技術人員公知的任何方案檢測源自靶基因的mrna來確定靶基因的表達水平。根據(jù)本發(fā)明具體的實施方案，通過檢測若干不同的mrna(每種mrna源自一個靶基因)，可同時確定若干靶基因的表達水平。
靶基因的表達可以如下確定：
1)從生物樣品提取總rna后，如前所述進行逆轉錄階段，以便獲得與生物樣品中最初存在的各種信使rna互補的各種dna(或cdna)；
2)特異性擴增cdna。在這種情況下，使用的特異性試劑包括至少一個如前所述的對靶基因特異的擴增引物。尤其可以通過pcr類型的擴增反應或通過任何其他合適的擴增技術來進行這個階段；
3)通過定量cdna來測定靶基因的表達。尤其可以通過使用進行到飽和的擴增反應獲得的量化范圍來定量cdna?？紤]到不同階段(逆轉錄，pcr等)觀察到的酶促效力的變化，可以通過同時測定所謂的持家基因(其表達在不同組的患者中是相似的)的表達來將不同組患者的靶基因表達標準化。通 過測定靶基因表達與持家基因表達的比值，可以校正不同實驗之間的任何變異性。
靶基因的表達還可以如下確定:
1)從生物樣品提取總rna后，如前所述進行逆轉錄階段，以便獲得與生物樣品中最初存在的各種信使rna互補的各種dna(或cdna)；
2)將cdna固定到膜上；
3)通過將cdna與先前標記的對靶基因特異的雜交探針進行雜交來測定靶基因的表達。這些雜交技術是本領域技術人員公知的，我們尤其提及的是northern印跡。尤其當基因是弱表達時，在與靶基因的信使rna互補的dna的特異性擴增階段后進行這種雜交反應。
在本發(fā)明中，可以通過給定時間轉錄的mrna的表達來測定sweyjawbu、esd和hprt1基因的表達。在這種情況下，生物材料是核酸，并且特異性試劑可以是如前所述的擴增引物或雜交探針。
在本發(fā)明的一個方面，為了減少或消除個體間差異對于檢測結果的影響，將患者腫瘤組織中的sweyjawbu基因的表達水平與該患者正常組織中的sweyjawbu基因的表達水平相比較。優(yōu)選地，本發(fā)明使用與腫瘤組織來源相同或相近的正常組織。當腫瘤組織中的sweyjawbu基因表達水平高于正常組織中的sweyjawbu基因表達水平時，可以認為該患者的腫瘤為alk基因重組陽性。
在本發(fā)明的另一個方面，還可以直接通過δct值來判定sweyjawbu基因的表達水平。如本文所述，δct＝ctsweyjawbu-gm(ctesd,cthprt1)，gm(ctesd,cthprt1)為ctesd和cthprt1的幾何平均數(shù)。當檢測結果的δct低于1.8時，可認為該患者的腫瘤為alk基因重組陽性。
本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，sweyjawbu基因的表達與alk的轉錄高度相關，相關系數(shù)達到0.9以上。sweyjawbu基因的表達在alk陽性細胞系中高度上調(diào)。在不同類型的腫瘤細胞中，sweyjawburna表達與alk基因擴增或易位狀態(tài)相關。例如可從數(shù)據(jù)集中抽取4個肺癌細胞株的信號強度作為實例。sweyjawbu基因僅在alk陽性細胞中顯示陽性表達，而在alk陰性細胞中低于背景水平(圖2a)。實時pcr實驗也顯示，alk陽性細胞和alk陰性細胞之間的sweyjawburna表達水平相差超過100倍(圖2b)。
因此，根據(jù)本發(fā)明，將患者腫瘤組織中的sweyjawbu基因的表達水平與該患者正常組織中的sweyjawbu基因的表達水平相比較。腫瘤組織中的sweyjawbu基因表達水平高于正常組織中的sweyjawbu基因表達水平即表示該患者腫瘤的alk基因重組陽性。例如，根據(jù)本發(fā)明，腫瘤組織中的sweyjawbu基因表達水平可高于正常組織中的sweyjawbu基因表達水平的2倍，此時腫瘤組織中的δct值比正常組織中的δct值大1。類似地，腫瘤組織中的sweyjawbu基因表達水平可高于正常組織中的sweyjawbu基因表達水平的4倍、8倍、16倍、32倍、64倍或128倍。也就是說，腫瘤組織中的δct值比正常組織中的δct值大2、3、4、5、6或7。
實施例
實施例1腫瘤細胞株和臨床樣品
使用alk陽性細胞系nci-h2228(腺癌，非小細胞肺癌)和三個alk陰性細胞系，nci-h1975(腺癌，非小細胞肺癌)，nci-h460(大細胞癌，非小細胞肺癌)和nci-h1703(鱗狀細胞癌，非小細胞肺癌)。atcc細胞nci-h2228、nci-h1975、nci-h460和nci-h1703用補充有10％fbs和2mml-谷氨酰胺的rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)與6厘米培養(yǎng)皿，用rnaprotect細胞試劑盒(qiagen)收集并約1×106個細胞。用qiashredder離心柱(qiagen)均質化裂解物后，用rneasy+迷你試劑盒(qiagen)提取rna。
將54非小細胞肺癌患者的腫瘤樣本(包括30個腺癌，4個大細胞癌和20個鱗狀細胞癌)，以及12個非腫瘤肺組織用于分析。已從所有參與者獲得知情同意書。該研究經(jīng)中國復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準。冷凍的腫瘤組織和正常組織研缽和杵在液氮存在條件下研碎，再溶于trizol中。用rneasy+迷你試劑盒(qiagen)提取rna。
由總rna電泳檢查rna的量，隨后用溴化乙錠染色。使用分光光度計測定各rna在260nm和280nm處的吸光度，獲得rna量和純度。
實施例2引物設計
使用beacondesigner軟件(premierbiosoft，帕洛阿爾托，加利福尼亞州)設計引物對。將引物的序列與ucscsnp數(shù)據(jù)庫的已知單核苷酸多態(tài)性(snp)的信息相比較。引物和帶有雜合子區(qū)的模板質粒由金斯瑞有限公司(南 京，中國)合成。合成的質粒作為模板來檢驗引物擴增效率。在反應管中每個引物的終濃度等于0.3μm。引物對導致有效放大，保留單熔融曲線用于進一步的分析。
實施例3pcr測定
為檢測來自細胞系或組織樣品的模板，用quantitect逆轉錄試劑盒(qiagen)從1μgrna合成cdna。使用quantifast的sybrgreenpcr試劑盒(qiagen)，在abi7900ht儀器上進行定量實時pcr檢測。在95℃5分鐘的初始激活后，使用95℃10秒和60℃30秒的兩步驟循環(huán)進行40個循環(huán)，隨后進行熔解曲線分析。hprt1和esd基因作為基因表達的內(nèi)參基因。實施例4患者的alk重組狀態(tài)的確認
根據(jù)指南，所選患者的alk重組狀態(tài)通過fish實驗(abbott)或ihc實驗(roche)檢查。fish陽性病例被定義為兩個陽性alk重組模式。陽性病例被定義為在50個腫瘤細胞中超過15％的斷裂信號或者分離的紅色信號。fish陰性病例定義為在腫瘤細胞中存在紅色和綠色信號(淡黃)的重疊，表明alk未重組。ihc染色由兩個病理醫(yī)生共同如下評分：在10％以上的腫瘤細胞中，0(無染色)；1(弱，細胞質染色)；2(適度，均勻細胞質染色)；3(強，顆粒狀細胞質染色)。
本發(fā)明的方法得到了與參考方法相同的alk狀態(tài)結果(圖3)。如圖3所示，其中δct＝ctsweyjawbu-gm(ctesd,cthprt1)，gm(ctesd,cthprt1)為ctesd和cthprt1的幾何平均數(shù)。fish確認的alk陽性樣品(5個腺癌和1個大細胞癌)均顯示出低于1.8的δct值。因此，本發(fā)明的方法將δct低于1.8定為表示alk基因重組陽性。
本發(fā)明納入了30個腺瘤樣品，包括5個fish確認alk陽性的樣品。樣品的alk陽性狀態(tài)由ihc研究和amoydxpcr進一步證實。alk陽性患者中的δctsweyjawbu根據(jù)樣品中alk陽性細胞的百分比而變化。此外，研究還包括4個大細胞癌和20個鱗狀細胞癌。
在本發(fā)明之前沒有關于sweyjawbu基因的詳細報道，該基因在體內(nèi)功能是未知的。基因alk在2號染色體反向鏈上，從序列30144451到序列29415634(ncbi37，2010年8月)，而基因sweyjawbu也位于2號染色體反 向鏈上，從2序列9414340到序列29413859。在染色體上這兩個基因之間只有1294bp的距離。sweyjawbu的表達在alk重組陽性細胞和alk重組陰性細胞之間表現(xiàn)出顯著差異。
alk轉錄物的斷裂并融合至到另一個融合配偶體可以驅動alk激酶結構域的強表達，并導致alk轉錄物5'和3'部分的不平衡表達。根據(jù)之前的報道，研究中設計了引物對，用于檢查alk轉錄物5'和3'部分的不平衡表達，以有效地區(qū)分alk重組陽性樣品從alk重組陰性樣品。此外，加入sweyjawbu表達差異可提供協(xié)同效應。
本領域技術人員可理解，以上說明書僅僅通過舉例而非限制性的方式說明了本發(fā)明。本發(fā)明的所有實施方式的各種等同方案都包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。