四重育種的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生種子集合的方法，所述種子與它們起于其的雄配子在遺傳上相同，所述方法包括將有限數(shù)目的父本配子置于花的柱頭上，以使母體卵細胞受精，以獲得許多接合子，所述父本配子具有四分體或二分體的形式；并且誘導從接合子的母本染色體的喪失，以獲得含有其中母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合。在優(yōu)選實施方案中，父本植物顯示出在減數(shù)分裂過程中的染色體重組抑制或第二次分裂重構(gòu)（SDR）。
【專利說明】四重育種
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生種子集合的方法，所述種子與它們起于其的雄配子在遺傳上相同。本發(fā)明進一步涉及含有其中母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合，所述集合由遺傳上互補的種子對組成，當由該種子生長的植物雜交時，導致基本上相同的雜種。本發(fā)明還涉及用于提供親本植物集合用于生產(chǎn)植物的方法，所述植物的遺傳構(gòu)成與其雄性祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同。
[0002]發(fā)明背景
[0003]植物育種對應于用于人類利益的植物物種的馴化，以獲得足夠質(zhì)量和數(shù)量的食物、飼料和纖維。植物育種是非常古老的人類工作并且僅在二十世紀的過程中，實用性知識接受科學基礎(chǔ)。植物育種最初基于選擇且繁殖這些植物，所述植物在局部選擇地域中勝出。隨著遺傳規(guī)律的再發(fā)現(xiàn)和統(tǒng)計工具的開發(fā)，植物育種變得基于遺傳學的知識，并且在技術(shù)上由諸如下述方法支持:加倍單倍體(DH)-參見例如，Haploids in Crop Improvement第 II 版；Palmer C, Keller W 和 Kasha K (2005)于 Biotechnology in Agriculture andForestry 第 56 版；Nagata T,LorZ H和 Widholm J.Springer-Verlag Berlin HeidelbergNew York, ISBN3-500-22224-3-和分子標記-參見例如 De Vienne 編輯(2003) MolecularMarkers in Plant Genetics and Biotechnology.Science publishers Inc.Enfield, NHUSA.1SBN1-57808-239-0。 [0004]植物育種傳遞適合特定環(huán)境的遺傳概念，這允許其以經(jīng)濟方式的開發(fā)。植物育種的這個目的通過遺傳變異的有效利用來實現(xiàn)，所述遺傳變異在植物物種的種質(zhì)內(nèi)存在。此類遺傳概念包含在特定環(huán)境中導致希望表型的基因的組合。這意指以生長植物且收獲產(chǎn)物所需的最低可能成本，收獲的植物部分在產(chǎn)量和質(zhì)量方面達到最大。當植物育種在商業(yè)水平上應用時，種子生產(chǎn)也是重要的問題。種子生產(chǎn)旨在借助于有性生殖的植物增殖，其中遺傳組成得到保存。
[0005]此外，商品種子需要具有足夠質(zhì)量以允許有效發(fā)芽。然而，通過有性生殖的遺傳構(gòu)成的保存是矛盾的，因為有性生殖根本在于產(chǎn)生具有新等位基因組合的后代。在有性生殖過程中起作用的遺傳機制已進化為增加遺傳變異，以便增強物種在不斷改變的環(huán)境中的生存機會。減數(shù)分裂重組、獨立的染色體分配和交配系統(tǒng)是在這方面的主要促成因素。通過有性生殖在后代中的一致性因此僅在親本植物完全純合時才能實現(xiàn)。組合此類植物的配子將導致在每個后續(xù)代中親本遺傳組成的確切再現(xiàn)。
[0006]在許多作物中，商品種子來自兩個純合親本系的雜交。這種方法確保Fl雜種對于幾個基因座是雜合的，這可導致雜種優(yōu)勢和均勻性。如果育種者希望改良現(xiàn)有Fl雜種變種或近交變種，則他在傳統(tǒng)上需要制備雜交且經(jīng)歷幾輪經(jīng)驗選擇來實現(xiàn)這個目的。
[0007]因為與植物生長和發(fā)育有關(guān)的基因功能的知識仍是有限的，所以育種者在很大程度上仍依賴表型選擇。因為尤其是在早代過程中，在近交過程中許多基因處于雜合狀態(tài)，所以負責賦予個體植物一些的表型值的基因的等位基因變體可以容易地喪失。這是由于下述事實:在有性生殖和近交的過程中，雜合性和特定基因相互作用喪失。因此，在植物育種中，尤其在其中已鑒定遺傳上雜合的植物具有高農(nóng)藝、園藝或觀賞價值的那些情況下，這些機制可以反效果起作用。有性生殖將導致所需等位基因的分離。
[0008]因此，存在關(guān)于技術(shù)的強烈需要，所述技術(shù)有效允許在具有高農(nóng)藝、園藝或觀賞價值的植物的有性生殖過程中的遺傳構(gòu)成的保存。
[0009]延續(xù)植物同時保存遺傳構(gòu)成的一個可能性是通過營養(yǎng)繁殖。這允許遺傳組成的完全保存，因為增殖唯一地通過有絲分裂而發(fā)生。植物已進化出營養(yǎng)繁殖的自然機制，這允許它們很快占據(jù)棲息地。例如，營養(yǎng)繁殖可以通過塊莖、鱗莖或根莖的形成而發(fā)生。備選方法是使用體外或體內(nèi)培養(yǎng)技術(shù)，以產(chǎn)生扦插。當與通過種子繁殖相比較時，營養(yǎng)繁殖技術(shù)的商業(yè)缺點是下述事實:它是勞動密集的且因此是昂貴的。此外，難以將植物貯存更長時間段，這造成物流問題，并且與其中植物材料通過種子繁殖的情況相比較，植物材料由病原體樣病毒感染的危險大得多。[0010]備選地，營養(yǎng)繁殖可以通過無性種子的形成而實現(xiàn)，這一般被稱為無融合生殖。這個現(xiàn)象在許多物種中自然發(fā)生，并且它可以通過基因工程在有性繁殖的植物物種中誘導。在理論上，這可以通過利用特定基因來實現(xiàn)，所述特定基因自然誘導無融合生殖的三個不同步驟，即不完全減數(shù)分裂、孤雌生殖和自主胚乳發(fā)育。然而，在實踐中，負責不同步驟的基因尚未得到鑒定，并且它們的相互作用可能是相當復雜的。
[0011]另一方面，無融合生殖組分的人工改造可能是相當可行的。例如，通過修飾在減數(shù)分裂過程中的不同步驟，已顯示減數(shù)分裂可以基本上轉(zhuǎn)換成有絲分裂。這個所謂的“MiMe方法”利用突變的組合，所述突變抑制雙鏈斷裂(spoll-1)、在減數(shù)分裂I期過程中誘導姐妹染色單體分離(rec8)且跳過第二次減數(shù)分裂細胞分裂(osdl)。組合這種方法與孤雌生殖和自主胚乳形成可以最終導致經(jīng)改造的無融合生殖(d’Erfurth等人:Turning meiosisinto mitosis ；PLoS Biology2009 ;TO/2010/079432)。盡管很長時間以來，無融合生殖技術(shù)用于植物育種的潛力已得到廣泛公認，但概念證明仍無法獲得。
[0012]作為另外一種備選方法，可以利用反向育種技術(shù)(W003/017753)。反向育種基于通過基因工程或化學干擾的減數(shù)分裂重組的抑制，和源自含有未重組親本染色體的孢子的加倍單倍體植物(DH)的后續(xù)產(chǎn)生。這些DH僅由于在減數(shù)分裂過程中發(fā)生的獨立的親本染色體分配存在其遺傳重組不同。因此，足以利用一個共顯性、多態(tài)性標記/染色體，以測定哪些源自其的DH或系應通過雜交組合，以重構(gòu)原始起始植物的遺傳組成。像這樣，反向育種技術(shù)的應用允許任何可育選擇植物通過種子的遺傳保存，即使它的遺傳組成是未知的。
[0013]這種技術(shù)的缺點在于下述事實:減數(shù)分裂重組的完全抑制導致交叉的不存在。這可以導致在減數(shù)分裂I期過程中的不適當?shù)娜旧w分離，這可以導致配子的非整倍性且因此導致減少的配子活力和性能。當在減數(shù)分裂I期過程中未形成交叉時，每一條染色體都具有移動到極中任一個的獨立的50%機會。這意味著制備具有完全染色體組成的孢子的理論機會為(1/2) n，其中η代表單倍染色體數(shù)目。平衡配子的頻率因此隨增加的單倍染色體數(shù)目而降低。盡管許多作物物種具有相對低的染色體數(shù)目(例如，黃瓜具有7條染色體/單倍體基因組；菠菜僅具有6條)，但還存在經(jīng)濟上重要的具有相對高染色體數(shù)目的物種。良好實例是番茄，經(jīng)濟上最重要的蔬菜作物之一，其具有12條染色體/單倍體基因組。這種技術(shù)約束顯著減少反向育種技術(shù)的效率。
[0014]作為另一個備選方法可以利用由未減數(shù)的孢子再生的植物。這種技術(shù)已命名為近反向育種(W02006/094773)。未減數(shù)的孢子優(yōu)先由于第二次減數(shù)分裂的省略而形成。這個自然發(fā)生的現(xiàn)象被稱為第二次分裂重構(gòu)(SDR)，并且它可以在伴隨常規(guī)減數(shù)分裂事件的有性生殖過程中在植物中發(fā)生。
[0015] 近反向育種技術(shù)采用通過由未減數(shù)的孢子再生植物的SDR事件，所述未減數(shù)的孢子通過自然或經(jīng)改造的SDR產(chǎn)生。已發(fā)現(xiàn)了在突變時引起SDR的基因，例如OSDl和TAM1。所得到的植物(稱為SDR-O植物)主要是純合的，并且它們隨后可以用于產(chǎn)生常規(guī)DH。在起始植物的父本和母本基因組之間存在多態(tài)性的分子標記可以用于鑒定這些SDR-O植物(及其衍生的DH)，其在很大程度上關(guān)于其遺傳組成是互補的。
[0016]這些植物的雜交將導致原始起始植物的基因構(gòu)成的接近完全的重構(gòu)。然而，由于在SDR-O事件形成的過程中和在其衍生的DH形成的過程中的減數(shù)分裂重組，互補性將不是完全的。重構(gòu)的雜種在一定程度上在遺傳上不同于彼此且不同于原始起始雜種植物。然而，當與其中DH直接源自常規(guī)減數(shù)分裂事件的情況相比較時，這個變異是強烈減少的。此外，這些DH是遺傳上固定的，這意味著不存在進一步選擇的余地。
[0017]在這個過程中整合SDR事件的優(yōu)點是關(guān)于遺傳互補性的選擇在兩步過程中發(fā)生。第一個步驟集中于染色體的近側(cè)區(qū)域，即包括著絲粒。第二個步驟針對染色體的遠端，即由于重組而交換的那些區(qū)域。這個延遲的遺傳固定減少復雜性，并且增加發(fā)現(xiàn)大量互補基因型的機會，尤其當分子標記可用于選擇時。
[0018]這種方法的進一步優(yōu)點在于下述事實:SDR可以在有性生殖過程中自然發(fā)生，并且它可以像這樣利用，而無需進一步干擾有性生殖過程。進一步增加SDR事件的正常流行率的方法是本領(lǐng)域已知的，例如通過用N20的脅迫處理(如先前在下述植物中描述的:百合:Barba-Gonzalez 等人(2006), Euphytical48:303-309 ;和郁金香:0kazaki 等人.(2005)，Euphytical43:101-114)。
[0019]本發(fā)明的目的是進一步增加上述方法用于保存雜合植物的遺傳構(gòu)成的效率，所述植物具有極佳的農(nóng)藝、園藝或觀賞性質(zhì)。
[0020]本發(fā)明利用特定突變可以導致在花粉形成過程中小孢子的分離方面的缺陷的觀察。這導致四花粉粒簇的形成，所述四花粉粒在其發(fā)育自始至終保持物理上附著在一起。盡管在簇中的個體花粉粒在成熟時在四分體中保持在一起，但它們是可育的，并可以各自執(zhí)行受精且在授粉后產(chǎn)生種子。關(guān)于這個所謂的四重表型的生物學解釋是溶解果膠層的失敗，所述果膠層通常僅在花粉發(fā)育的早期存在于小孢子之間。
[0021]本發(fā)明因此涉及用于產(chǎn)生種子集合的方法，所述種子與它們起于其的雄配子在遺傳上相同，所述方法包括:
[0022]a)將有限數(shù)目的父本配子置于花的柱頭上，以使母體卵細胞受精，以獲得許多接合子，所述父本配子具有四分體或二分體的形式；
[0023]b)誘導來自接合子的母本染色體的喪失，以獲得含有其中母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合。
[0024]“遺傳上相同的”意指一粒種子的所有染色體都與相應配子的染色體相同，并且在種子內(nèi)的染色體組合與相應配子相同。
[0025]在導致本發(fā)明的研究中，另外驚訝地發(fā)現(xiàn)組合在現(xiàn)有技術(shù)中可獲得的方法與上述特定突變(其導致在花粉形成過程中小孢子的分離中的缺陷)，導致可以由其鑒定具有基本上互補的遺傳構(gòu)成的親本植物效率中的極大增加，其在雜交后引起具有與其父本祖父基本上相同的遺傳構(gòu)成的雜合植物。本發(fā)明可以與之組合的此類方法是例如反向育種和近反向育種。
[0026]四重表型(quartetphenotype)例如在 Copenhaver 等人(2000) PlantPhysiologyl24，7-15中描述。不同的非同源基因中的突變可以導致相似的四重表型(例如擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的qrtl、qrt2和qrt3)。QRT3基因(在擬南芥屬中:At4g20050)已進行分子表征，并且它編碼多聚半乳糖醛酸酶的不同類別的成員(Rhee等人.(2003) Plant Physiologyl33:1170-1180)。這些突變用于提供用于在根據(jù)本發(fā)明的方法中使用的四分體。
[0027]在四花粉粒簇中的個體花粉粒含有單一減數(shù)分裂細胞分裂的產(chǎn)物。當個體花粉四重體給植物受精時，當受精效率為100%時，這理想地導致4粒種子的形成。四分體的四個個體花粉粒代表單一減數(shù)分裂細胞分裂的產(chǎn)物的事實具有關(guān)于其為本發(fā)明主題的技術(shù)的
有利牽涉。
[0028]在減數(shù)分裂開始時，初始過程是基因組DNA的復制。隨后，在前期過程中，同源染色體對齊且折斷(synaps)，以形成二價染色體。在這個階段過程中，形成使用對齊的非姐妹染色單體進行修復的雙鏈斷裂(DSB)。在修復過程中的染色體相互作用導致稱為雙重單倍體(holiday)連接的特定結(jié)構(gòu)的形成,所述特定結(jié)構(gòu)被分解。這導致基因轉(zhuǎn)換或交換。交換(CO)事件最終以交叉的形式可見，所述交叉是在減數(shù)分裂I期過程中的適當同源分離在結(jié)構(gòu)上所需的。關(guān)于本發(fā)明，應注意到與CO的分布無關(guān)，減數(shù)分裂I期的產(chǎn)物關(guān)于其等位基因組成始終彼此完全互補。在第二個減數(shù)分裂過程中，姐妹染色單體分離到相對極，引起最后的減數(shù)分裂產(chǎn)物，即四個單倍體細胞。通常，這四個減數(shù)分裂產(chǎn)物在其進一步發(fā)育過程中變得彼此脫離，并且它們將與相同花藥室內(nèi)部的源自其他減數(shù)分裂事件的花粉?；旌?。然而，當母本植物顯示出四重表型時，單個減數(shù)分裂事件的四個產(chǎn)物在物理上保持在一起。
[0029]在四分體中四個花粉粒的集合可以含有可變程度的遺傳互補性，其為單倍染色體數(shù)目的函數(shù)。因為減數(shù)分裂I期的產(chǎn)物在彼此間完全互補，所以在四分體中結(jié)合在一起的四個花粉粒含有至少50%互補性。關(guān)于每個四分體的特定結(jié)果由機會決定，并且這個機會遵循由所謂的帕斯卡三角(Pascal’ s Triangle)獲得的分布(圖1)。
[0030]例如，黃瓜具有7條單倍染色體。第一次減數(shù)分裂導致兩個完全互補的減數(shù)分裂產(chǎn)物。在第二次減數(shù)分裂過程中，染色體可以在減數(shù)分裂I期的兩個產(chǎn)物各自中隨機分離，這可以導致2n=27=128個不同產(chǎn)物。一般而言，可以陳述在η條染色體的情況下，總共2"個不同四分體可以得自單個減數(shù)分裂事件。完全互補事件的數(shù)目始終是I，即在每行上的第一個數(shù)目(圖1)，而在每行上的第二個數(shù)目對應于單倍染色體的數(shù)目。相同行中的后續(xù)數(shù)目對應于在四分體中分別具有2、3、4、5和6條非互補染色體的預期數(shù)目的減數(shù)分裂產(chǎn)物。
[0031]在黃瓜的實例中，具有源于任何給定減數(shù)分裂事件的128個不同減數(shù)分裂產(chǎn)物，這些數(shù)目分別為21、35、35、21和7。因為減數(shù)分裂I期的產(chǎn)物彼此完全互補，所以在四分體中不存在染色體無一互補的極端情況，因為始終存在與其他減數(shù)分裂I期產(chǎn)物的染色體的互補性。具有一條非互補染色體的事件數(shù)目因此是7*2，具有兩條非互補染色體的事件數(shù)目是21*2，等等。如果例如3條染色體是非互補的，則這暗示其他四條是互補的。在花粉四分體的四個成員中發(fā)現(xiàn)某一程度的互補性的概率(機會百分比)由圖2中的表格給出。在黃瓜的花粉四分體內(nèi)遇到具有0、1、2或3條非互補染色體(且因此分別具有7、6、5或4條互補染色體)的減數(shù)分裂產(chǎn)物的機會因此分別是1.6% (= (1+1)/128),10.9% (= (7+7)/128),32.8% (= (21+21)/128)和 54.7% (= (35+35)/128)。
[0032]重要的是，在這個背景下的“非互補的”實際上僅指這些染色體的端粒端。如果我們例如具有含3條非互補染色體和在重組后僅40%雜合性的情況，則7條染色體中的4條將是完全互補的，而其他3條染色體仍是60%互補的。本質(zhì)上，四分體星座(tetradconstellation)因此導致這樣的情況:其中花粉粒對于50%的染色體始終至少完全互補配對，和-由于重組-對于剩余染色體仍部分互補配對。本發(fā)明因此實現(xiàn)雜種植物的基因型的接近完全重構(gòu)，同時仍允許與花粉四分體源自其的原始雜種植物相比較0-50%的變異，以執(zhí)行本發(fā)明。
[0033]這種方法因此允許雜種植物相同或接近相同的遺傳構(gòu)成的重構(gòu)。接近相同的重構(gòu)具有確定優(yōu)點，因為這允許評估另外的遺傳變異對目的雜種表型的作用。這個另外的遺傳變異可以證明為對雜種表型具有有利或不利作用，并且這將允許優(yōu)良雜種表型的進一步遺傳改良。關(guān)于四條染色 體的情況在圖3中圖解舉例說明。
[0034]本發(fā)明的重要方面是四分小孢子用于給母本植物授粉的用途，這從其雜種后代中消除母本基因組。此類植物的實例近來已由Maruthachalam和Chan (Haploid plantsproduced by centromere-mediated genome elimination ;Nature464(2010),615-619 ;美國專利申請20110083202 ;W02011044132)在擬南芥屬中描述，但這個實例決不限制本發(fā)明的應用，因為本發(fā)明還可以對于其他單倍體誘導系統(tǒng)執(zhí)行。
[0035]從雜種后代中消除母本基因組因此可以借助于內(nèi)源著絲粒特異性組蛋白CENH3由經(jīng)修飾形式的轉(zhuǎn)基因替換來實現(xiàn)。在實踐中，經(jīng)修飾形式的CENH3蛋白質(zhì)在缺乏功能內(nèi)源CENH3基因的植物中過表達。
[0036]備選地，當在具有相應失活的內(nèi)源CENPC、MIS12、NDC80或NUF2基因的植物中過表達，CENPC、MIS12、NDC80或NUF2多肽也可以用于相同目的。適當?shù)?，植物?nèi)源CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2基因組編碼序列的一種或兩種等位基因被失活或敲除，并且優(yōu)選地，所有等位基因都被失活或敲除。當植物與野生型植物雜交時，生成例如至少0.1%單倍體后代。
[0037]優(yōu)選地，多肽是重組改變的CENH3多肽。多肽可以包含與包含CENH3組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)連接的具有至少五個氨基酸(或備選地，至少十個氨基酸)的異源氨基酸序列，其中所述氨基酸序列與CENH3組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域異源。適當?shù)?，所述異源氨基酸序列與CENH3組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域直接連接，并且多肽缺乏CENH3尾部結(jié)構(gòu)域。備選地，異源氨基酸序列可以經(jīng)由間插蛋白質(zhì)序列與CENH3組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域連接。這個間插蛋白質(zhì)序列可以包含CENH3尾部結(jié)構(gòu)域或非CENH3組蛋白H3尾部結(jié)構(gòu)域(并且隨后重組蛋白質(zhì)對應于CENH3蛋白質(zhì)的尾部交換形式)。
[0038]適當?shù)?，當干擾蛋白質(zhì)包含CENH3組蛋白H3尾部結(jié)構(gòu)域時，CENH3尾部結(jié)構(gòu)域可以與CENH3組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域異源。當多肽包含CENH3組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域和截短的CENH3尾部結(jié)構(gòu)域時，尾部結(jié)構(gòu)域的氨基末端相對于植物的內(nèi)源尾部結(jié)構(gòu)域是截短的。
[0039]由于Fl后代是單倍體的事實，用來自野生型父本植物的花粉給此類轉(zhuǎn)基因補助植物授粉導致不育后代。事實上，每個Fl后代用于受精和它源于其的花粉粒在遺傳上相同。野生型和經(jīng)修飾的染色體在接合子中的動粒(kinetochore)裝配中明顯不相容。染色體的自主或誘導倍增導致DH的形成。CENH3是植物中的保守和可能單拷貝的基因，并且這個系統(tǒng)因此還可以應用于作物物種。如果種子形成由于胚乳失衡而有問題，則可以執(zhí)行胚拯救。
[0040]在另一個實施方案中，可以借助于其他單倍體誘導系統(tǒng)或通過種間雜交(如由例如Bains&Howardl950，Naturel66:795描述的)，從Fl后代中消除母本基因組。
[0041]在進一步的實施方案中，四重突變還可以與反向育種技術(shù)(W003/017753 ；Dirks等人.2009, Plant Biotech J7:837_845)組合,從而極大改善反向育種的效率。在這個實施方案中，通過遺傳、轉(zhuǎn)基因或化學方法，使四重表型與父本植物中的減數(shù)分裂染色體重組抑制組合。雖然四重突變導致在花粉成熟時在四分體中的單次減數(shù)分裂的4個產(chǎn)物的物理附著，但重組的抑制確保這些花粉粒含有未重組的親本染色體。本發(fā)明因此確保具有互補遺傳組成的DH可以在源自來自單次減數(shù)分裂的花粉的四個DH中容易地鑒定，具有一個共顯性、多態(tài)性標記/染色體。
[0042]反向育種的缺點可能是不平衡(非整倍體)孢子的出現(xiàn)。然而，能夠在形態(tài)上鑒定平衡四分體(例如通過在視覺上選擇其中四個花粉粒在大小中相等(其指示所有染色體的相等分布)的四分體，或借助于例如流式細胞術(shù))，并且由此類四分體再生的DH自動互補配對。當平衡四分體用于給母本植物授粉時，這從其雜種后代中消除母本基因組，這將導致關(guān)于其遺傳組成互補配對的4粒單倍體種子。互補DH或其衍生的系的后續(xù)雜交將導致原始起始植物的遺傳組成的重構(gòu)。當這個雜交的四個后代植物在雜交前未進行基因分型時，通過使這四個植物中的兩個隨機雜交獲得原始起始植物的遺傳組成重構(gòu)的機會是50%。
[0043]在另一個實施方案中，四重表型可以與近反向育種(W02006/094773)組合。在這個實施方案中，在顯示出四重表型的植物中的第二次分裂重構(gòu)(SDR)的發(fā)生將導致通過父本植物的花粉二分體的產(chǎn)生，所述花粉二分體包含具有完全互補的遺傳組成的兩個二倍體花粉粒，其包括相同的染色體斷點。用此類花粉二分體給母本植物授粉將導致兩個二倍體植物，并且使這兩個植物彼此雜交將導致原始雜種的遺傳組成的接近完全重組，所述母本植物從其雜種后代中消除母本基因組。
[0044]“接近完全的”在本申請中指的是下述事實:兩個植物一起具有與其父本植物相同的遺傳材料(因為在減數(shù)分裂過程中未喪失或獲得DNA)，但由于在減數(shù)分裂過程中的交換事件，染色體區(qū)段的相對基因組位置可以是不同的。然而，染色體斷點的位置在兩個植物中是相同的，因為它們源于單次有絲分裂事件?；パaSDR-O系的鑒定因此通過利用四重表型得到極大促進，并且任何給定雜種的遺傳組成的接近完全重構(gòu)變得容易和有效得多。
[0045]由于在SDR-O事件的形成過程中的減數(shù)分裂重組，重構(gòu)將不是100%完全的，因為重構(gòu)的雜種由于CO在一定程度上在遺傳上不同于彼此且不同于原始起始雜種(父本)植物，尤其是在端粒(telomers)處。這個特征因此提供了另外的遺傳變異在預先選擇的優(yōu)良雜種植物中產(chǎn)生的另外優(yōu)點，通過提供備選和輕微不同的基因組排列，同時維持大多數(shù)原始雜種的構(gòu)成。這可以導致雜種表型的進一步改良。
[0046] 本發(fā)明的進一步目的是提供用于獲得種子集合的有效方法，所述種子與它們起于其的雄配子在遺傳上相同，并且所述種子集合由遺傳上基本上互補的種子對組成，當由該種子對生長的植物雜交時,導致基本上相同的雜種植物。這個雜種植物與產(chǎn)生雄配子的植物在遺傳上基本上相同，所述種子集合起于所述雄配子。
[0047]如本文使用的“基本上”意指種子對的遺傳互補性無需是100%，因為雜種植物的接近完全重構(gòu)也可能是希望的，如上所述(因為它可以提供進一步改良雜種表型的機會)。此類接近完全重構(gòu)的雜種植物與原始雜種植物和可通過本發(fā)明獲得的其他接近完全重構(gòu)的雜種植物僅基本上相同，因為盡管它具有與原始雜種植物相同或很大程度上相同的遺傳材料，由于不同的交換事件，在其基因組中可能存在備選或略微不同的基因組排列，或由于重組，一些基因組區(qū)域可以是純合的。當減數(shù)分裂交換發(fā)生時，“基本上”因此涉及在花粉粒形成的過程中發(fā)生的交換程度，所述花粉粒用于授粉單倍體誘導物母本植物。
[0048]在另一個背景下，例如在不存在減數(shù)分裂重組的情況下，“基本上”還可以指種子對的選擇(從通過本發(fā)明獲得的種子集合中)，所述種子對并非彼此100%遺傳上互補的。在也預期落入本發(fā)明的范圍內(nèi)的這 個實施方案中，例如，可以選擇一對種子(從所述種子集合中)，該對種子對于n-Ι條染色體(其中η是物種的單倍染色體數(shù)目)彼此互補，并且對于剩余染色體是相同的。對于除了一個外的全部染色體，起因于由這對種子生長的植物的雜交的雜種植物則與原始雜種植物在遺傳上相同，并且對于剩余染色體不同(即純合的)?？傮w上，植物因此僅是“基本上”遺傳上相同的。此類植物可以例如在優(yōu)選實施方案中執(zhí)行本發(fā)明時獲得，伴隨減數(shù)分裂重組(“反向育種”)的抑制。應當理解相同概念對于η-2條染色體、η-3條染色體等等完成。這個概念允許例如在僅集中于其染色體的子集時的植物基因組和表型分析，并且同時留下雜種基因組的剩余部分不改變。
[0049]本發(fā)明因此涉及用于產(chǎn)生種子集合的方法，所述種子與它們起于其的雄配子在遺傳上相同，所述方法包括:
[0050]a)將有限數(shù)目的父本配子置于花的柱頭上，以使母體卵細胞受精，以獲得許多接合子，所述父本配子具有四分體或二分體的形式；
[0051]b)誘導從接合子的母本染色體的喪失，以獲得含有其中母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合。
[0052]在這個方法中，在用于胚珠受精的花粉管中的競爭優(yōu)選應降到最低或得到阻止，以避免在四分體或二分體中包含的花粉粒中的一些未能給胚珠受精。因此，有限的授粉是優(yōu)選的，從而使得當存在沉積到其柱頭上的花粉粒時，至少存在同樣多的已授粉花的雌性生殖器官中的胚珠。每個花粉粒隨后應能夠給胚珠受精。
[0053]在一個實施方案中，父本配子的有限數(shù)目因此等于或低于攜帶柱頭的雌性生殖器官中含有的卵細胞數(shù)目。
[0054]每朵花的卵細胞或胚珠的平均數(shù)目是關(guān)于父本配子數(shù)目的優(yōu)選上限，是熟悉特定作物的技術(shù)人員已知的，所述父本配子數(shù)目可以成功地用于這種方法中。它一般略微高于該作物的典型果實中存在的種子的平均數(shù)目。對于番茄，例如，每朵花的卵細胞的平均數(shù)目為約100，對于蕓苔屬物種(species)約35，對于擬南芥屬約40-50，對于西瓜約200，對于葡萄約4，對于黃瓜約250-300，對于甜椒約100，并且對于甜瓜約500。Burd等人.，Am.J.Bot.96 (6)，1159-1167 (2009)描述了關(guān)于在187個被子植物物種中每朵花的胚珠數(shù)目的研究。
[0055]有限數(shù)目的父本配子適當?shù)匕试S以有效方式使用本發(fā)明的方法的任何數(shù)目。這意指必須避免雄配子中的太多遺傳變異，即引起在單個柱頭上沉積的雄配子的減數(shù)分裂事件數(shù)目應保持很低，如果這些減數(shù)分裂事件各自在個體配子的基因組中生成很大程度的遺傳重排，所述配子構(gòu)成二分體或四分體(通過染色體重組)。
[0056]在優(yōu)選實施方案中，父本配子的有限數(shù)目是二或四(分別對應于在單個花粉二分體或四分體中包含的配子數(shù)目，并且因此分別源自在第二次減數(shù)分裂的不存在或存在下的單次減數(shù)分裂)。這個策略將導致四粒種子(在四分體用于授粉的情況下)或兩粒種子(在二分體用于授粉的情況下)的形成，所述種子與源于單次減數(shù)分裂的花粉粒在遺傳上相同。當配子具有二分體的形式時，允許以有效方式使用本發(fā)明方法的父本配子的有限數(shù)目可以比二高得多，因為遺傳變異的量極大減少，由于在二分體內(nèi)包含的兩個配子在遺傳上完全彼此互補。尤其當使用具有二分體形式的配子時，因此有效使用任何數(shù)目的配子，其小于每朵花的卵細胞或胚珠的平均數(shù)目。
[0057]雄配子的四分體或二分體形式是在父本植物中干擾四分小孢子分離的結(jié)果。在一個實施方案中，干擾四分小孢子分離包括干擾涉及小孢子之間的果膠層分解的一種或多種靶基因，所述果膠層分解起因于單次減數(shù)分裂。一種或多種靶基因可以選自QRT1、QRT2、QRT3或其功能同系物。合適的突變是在靶基因中引入終止密碼子或移碼，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和/或功能的氨基酸取代，和遺傳元件例如T-DNA插入基因的編碼序列、啟動子或其他調(diào)節(jié)序列內(nèi)。在擬南芥屬中，qrtl-4突變起因于T-DNA插入QRTl基因的外顯子內(nèi)，qrtl_5突變體中的四重突變體表型通過T-DNA插入QRTl基因的啟動子內(nèi)引起，并且qrt 1-6突變通過T-DNA插入QRTl基因的啟動子內(nèi)引起。擬南芥屬中的qrt2_l突變體包含在QRT2蛋白質(zhì)中的第372位上的纈氨酸至丙氨酸的氨基酸取代(GTG至GCG突變)，其為這個突變系中的四重表型的潛在原因。
[0058]在另一個實施方案中，干擾四分小孢子分離包括通過化學方法干擾起因于單次減數(shù)分裂的小孢子之間的果膠層分解。QRT基因產(chǎn)物是在個體雄配子(小孢子)之間存在的果膠多糖(果膠)層分解中起作用的酶，所述個體雄配子源于花粉母細胞的減數(shù)分裂。如果這個果膠層未降解，則四個雄配子(小孢子)以四分體形式保持彼此物理上附著。
[0059]干擾涉及四分小孢子分離的一種或多種靶基因可以通過許多不同方法來實現(xiàn)。干擾靶基因可以由阻止其轉(zhuǎn)錄組成。在一個實施方案中，靶基因的轉(zhuǎn)錄可以借助于針對靶基因啟動子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子得到阻止。
[0060]在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)錄借助于表達對靶基因啟動子起作用的負作用轉(zhuǎn)錄因子得到阻止。此外，干擾靶基因還可以由使靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物失穩(wěn)組成。這可以借助于核酸分子來實現(xiàn)，所述核酸分子與靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物互補且選自反義RNA、RNAi分子、病毒誘導的基因沉默(VIGS)分子、共阻遏分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸。
[0061]干擾靶基因還可以由借助于一種或多種顯性負性核酸構(gòu)建體，或借助于一種或多種化學化合物抑制靶基因表達產(chǎn)物組成。
[0062] 在另外一個實施方案中，干擾靶基因由一種或多種突變引入靶基因內(nèi)，導致其生物學功能的擾動組成。一種或多種突變可以隨機引入，該引入借助于一種或多種化學化合物(例如甲磺酸乙酯、亞硝基甲基脲、羥胺、原黃素、N-甲基-N-亞硝基胍、N-乙基-N-亞硝基脲、N-甲基-N-硝基-亞硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亞胺、疊氮化鈉、福爾馬林(formaline)、聚氨酯、苯酚、環(huán)氧乙烷)和/或物理方法(例如UV照射、快中子暴露、X射線、Y照射)和/或遺傳元件(例如轉(zhuǎn)座子、T-DNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒元件)的插入-或具體地，借助于同源重組或基于寡核苷酸的突變誘導。
[0063]干擾四分小孢子分離的化學方法包括使用化學抑制劑，其減少Q(mào)RT基因產(chǎn)物的活性(或穩(wěn)定性)，或使用化學制品，其直接或間接減少Q(mào)RT基因產(chǎn)物的表達水平，導致起因于單次減數(shù)分裂事件的在四個小孢子之間的果膠層的持久性。QRT蛋白質(zhì)的酶活性可以借助于化學抑制劑得到抑制，從而使得用抑制性化學制品處理在正常小孢子分離的階段(或先前階段)過程中的花芽，導致源自單次減數(shù)分裂事件的小孢子之間的果膠層的持久性，并且因此在晚期發(fā)育階段過程中和在開花時的四分小孢子的持久性。
[0064]在優(yōu)選實施方案中，除了四重表型外，產(chǎn)生所述雄配子(以四分體或二分體)的父本植物還顯示出染色體重組的抑制，其取消染色體交換且導致整條染色體的完整傳送。在這個實施方案中，在四分體的個體花粉粒中鑒定兩個遺傳上互補的基因組的機會是50百分比。當產(chǎn)生所述雄配子的父本植物顯示出染色體重組的抑制時,染色體重組的這個抑制通過干擾參與重組的一種或多種靶基因來實現(xiàn)。
[0065]在一個實施方案中，靶基因涉及雙鏈斷裂，并且它可以選自SP011、MER1、MER2、MRE2、ME14、REC102、REC104、REC114、MEKI /MRE4、RED 1、HOP 1、RAD50、MRE11、XRS2 或其功能同系物。
[0066]在另一個實施方案中，靶基因涉及染色體配對和/或鏈交換，并且它可以選自RHD54/TID1、DMCl、SAE3、REDl、HOPl、H0P2、REC8、MERl、MRE2、ZIPl、ZIP2、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPAl、SMC3、SCCl、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、S0L0DANCERS、HIM6、CHK2或其功能同系 物。
[0067]在另外一個實施方案中，靶基因涉及減數(shù)分裂重組過程，并且它可以選自SGS1、MSH4、MSH5、ZIP1和ZIP2或其功能同系物。
[0068]在另一個實施方案中，靶基因選自PRD1、PRD2、PRD3、PHS1、NBS1、COMl、MND1、MER3/RCK、ZIP3、ZIP4、PTD、SHOCK ZYPU MLHU MLH3 或其功能同系物。
[0069]干擾涉及重組的一種或多種靶基因可以通過許多不同方法來實現(xiàn)。干擾靶基因可以由阻止其轉(zhuǎn)錄組成。
[0070]在一個實施方案中，靶基因的轉(zhuǎn)錄可以借助于針對靶基因啟動子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子得到阻止。在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)錄借助于表達對靶基因啟動子起作用的負作用轉(zhuǎn)錄因子得到阻止。此外，干擾靶基因還可以由使靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物失穩(wěn)組成。這可以借助于核酸分子來實現(xiàn)，所述核酸分子與靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物互補且選自反義RNA、RNAi分子、病毒誘導的基因沉默(VIGS)分子、共阻遏分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸。干擾靶基因還可以由借助于一種或多種顯性負性核酸構(gòu)建體，或借助于一種或多種化學化合物抑制靶基因表達產(chǎn)物組成。
[0071]在另外一個實施方案中，干擾靶基因由一種或多種突變引入靶基因內(nèi)，導致其生物學功能的擾動組成。一種或多種突變可以隨機引入，該引入借助于一種或多種化學化合物(例如甲磺酸乙酯、亞硝基甲基脲、羥胺、原黃素、N-甲基-N-亞硝基胍、N-乙基-N-亞硝基脲、N-甲基-N-硝基-亞硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亞胺、疊氮化鈉、福爾馬林、聚氨酯、苯酚、環(huán)氧乙烷)和/或物理方法(例如UV照射、快中子暴露、X射線、Y照射)和/或遺傳元件(例如轉(zhuǎn)座子、T-DNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒元件)的插入-或具體地，借助于同源重組或基于寡核苷酸的突變誘導。[0072]在另一個優(yōu)選實施方案中，除了四重表型外，產(chǎn)生所述雄配子的父本植物還顯示出在減數(shù)分裂過程中的第二次分裂重構(gòu)(SDR)。在這個實施方案中，父本植物產(chǎn)生雄配子，其為2η并具有二分體的形式，因為第二次減數(shù)分裂不發(fā)生。在一個二分體中包含的兩個雄配子在遺傳上完全互補，并且在二分體的兩個個體花粉粒中鑒定兩個遺傳上互補的基因組的機會因此是100百分比。
[0073]當產(chǎn)生所述雄配子的父本植物顯示出在減數(shù)分裂過程中的第二次分裂重構(gòu)時，這個第二次分裂重構(gòu)可以自發(fā)發(fā)生，而不干擾起始生物體。在另一個實施方案中，第二次分裂重構(gòu)借助于遺傳修飾進行誘導。這個遺傳修飾可以是瞬時的，或它可以通過將遺傳元件(例如轉(zhuǎn)基因、突變、轉(zhuǎn)座子、逆轉(zhuǎn)錄病毒元件、T-DNA)穩(wěn)定摻入基因組內(nèi)來實現(xiàn)，所述遺傳元件增加生物體中的第二次分裂重構(gòu)事件數(shù)目。 [0074]在另外一個實施方案中，第二次分裂重構(gòu)通過對父本植物實施環(huán)境脅迫來實現(xiàn)，所述環(huán)境脅迫例如溫度脅迫、NO2、氧化亞氮(N2O)或其組合(Zhang等人.(2002) Journalof Horticultural Science&Biotechnology78:84-88 ；W02006/094773 ;Barba_Gonzalez等人.(2006), Euphytical48:303-309 ；0kazaki 等人.(2005), Euphytical43:101-114)。
[0075]從接合子的母本染色體的喪失以獲得含有其中母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合可以以不同方式實現(xiàn)。在一個實施方案中，單倍體誘導系可以用作雌性。單倍體誘導系是其中雙親之一的染色體從接合子的基因組中消除，所述接合子在卵細胞由花粉受精后形成。雌性可以例如是不同物種的植物，如已由例如Bains&Howardl950，Naturel66:795描述的。在另一個實施方案中，從接合子的母本染色體的喪失起因于使用轉(zhuǎn)基因植物作為母本生物體，所述轉(zhuǎn)基因植物包含異源轉(zhuǎn)基因表達盒，該表達盒包含與多核苷酸可操作地連接的啟動子，所述多核苷酸編碼重組改變的CENH3、CENPC, MIS12、NDC80或NUF2多肽，且具有相應失活的內(nèi)源CENH3、CENPC, MIS12、NDC80或NUF2基因，如W02011/044132 中所述的。
[0076]本發(fā)明還涉及含有其中母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合，所述集合由基本上在遺傳上互補的種子對組成，所述種子對在雜交時導致基本上相同的雜種，并且所述種子集合可通過本發(fā)明的方法獲得。這個種子集合的種子都具有相同父本，因為它們源于用有限數(shù)目的父本配子給母本植物授粉，所述父本配子具有四分體或二分體的形式，所述父本配子已從單個父本植物中收集。因為這點，并且由于母本染色體從接合子中消除，所以從遺傳觀點來看，所述種子集合的種子僅具有一個雄性祖父親本和一個雌性祖母親本，即其父本的雙親。這在圖4中示意性表示。
[0077]本發(fā)明還涉及用于產(chǎn)生植物的親本植物集合，所述產(chǎn)生的植物的遺傳構(gòu)成與其雄性祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同，所述產(chǎn)生包括在倍增種子的染色體數(shù)目之后或之前，由本發(fā)明的種子集合的種子生長植物，并且將兩個遺傳上互補的植物鑒定為親本植物。此類遺傳上互補的植物可以借助于分子(遺傳)標記進行鑒定，父本植物(其產(chǎn)生雄配子)對于所述標記是雜合的，并且兩個父本祖父母對于所述標記具有不同等位基因。這些標記可以用許多不同方法進行評分，例如特定基因組區(qū)的直接DNA測序、AFLP, RFLP, SSR、RAPD, KASPar(KBioscience)、Invader? 或 Invader Plus? (參見例如 De Vienne 編輯(2003)MolecularMarkers in Plant Genetics and Biotechnology.Science publishers Inc.Enfield, NHUSA.1SBN1-57808-239-0)。[0078]本發(fā)明進一步涉及用于就其遺傳構(gòu)成篩選種子集合或其生長的植物的方法，以鑒定其遺傳構(gòu)成與其父本祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的植物，并且鑒定其遺傳構(gòu)成與其父本祖母的遺傳構(gòu)成基本上相同的另一個植物。
[0079]其遺傳構(gòu)成與其父本祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的植物隨后可以與其遺傳構(gòu)成和其父本祖母的遺傳構(gòu)成基本上相同的另一個植物雜交，以便獲得其遺傳構(gòu)成與其自身祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的后代植物。對于‘其自身祖父’，(雜種)植物意指產(chǎn)生花粉四分體或花粉二分體，用于單倍體誘導系的授粉。這個系譜在圖4中圖解舉例說明且闡明。
[0080]本發(fā)明進一步涉及在倍增種子的染色體數(shù)目之后或之前，所述種子集合用于鑒定兩個遺傳上互補的植物作為用于雜交的雙親的用途。
[0081]本發(fā)明可以對其進行實踐 的作物物種包括例如煙草、白楊、甜菜、油菜、大豆、番茄、黃瓜、小黃瓜、玉米生菜、菠菜、辣椒、矮牽牛、馬鈴薯、茄子、甜瓜、西瓜、胡蘿卜、蘿卜、蔬菜蕓苔屬物種(甘藍、花椰菜、青花菜、球莖甘藍、抱子甘藍)、豆、豌豆、洋蔥、草莓、食用甜菜、蘆筍和葡萄藤。
[0082]本發(fā)明進一步在下述條款中描述。
[0083]條款
[0084]本發(fā)明涉及:
[0085]1.用于產(chǎn)生種子集合的方法，所述種子與它們起于其的雄配子在遺傳上相同，所述方法包括:
[0086]a)將有限數(shù)目的父本配子置于花的柱頭上，以使母體卵細胞受精，以獲得許多接合子，所述父本配子具有四分體或二分體的形式；
[0087]b)誘導從接合子的母本染色體的喪失，以獲得含有其中母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合。
[0088]2.根據(jù)條款I(lǐng)的方法，其中父本配子的有限數(shù)目等于或低于攜帶柱頭的雌性生殖器官中含有的卵細胞數(shù)目。
[0089]3.根據(jù)條款I(lǐng)或2的方法，其中父本配子的有限數(shù)目是二或四。
[0090]4.根據(jù)條款1-3的任何組合的方法，其中具有四分體或二分體形式的父本配子是干擾四分小孢子分離的結(jié)果。
[0091]5.根據(jù)條款4的方法，其中干擾四分小孢子分離包括干擾涉及小孢子之間的果膠層分解的一種或多種靶基因，所述小孢子起因于單次減數(shù)分裂。
[0092]6.根據(jù)條款5的方法，其中所述一種或多種靶基因選自QRTl、QRT2、QRT3或其功能冋系物。
[0093]7.根據(jù)條款4的方法，其中干擾四分小孢子分離通過化學方法來實現(xiàn)。
[0094]8.根據(jù)條款1-7的任何組合的方法，其中所述父本植物顯示出染色體重組的抑制。
[0095]9.根據(jù)條款1-7的任何組合的方法，其中所述父本植物顯示出在減數(shù)分裂過程中的第二次分裂重構(gòu)(SDR)。
[0096]10.根據(jù)條款8的方法，其中所述染色體重組的抑制通過干擾參與重組的一種或多種靶基因來實現(xiàn)。
[0097]11.根據(jù)條款10的方法，其中所述靶基因涉及雙鏈斷裂。[0098]12.根據(jù)條款11的方法，其中所述靶基因選自SPOlU MERU MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104、REC114、MEKI /MRE4、RED 1、HOP 1、RAD50、MRE11、XRS2 或其功能同系物。
[0099]13.根據(jù)條款10的方法，其中所述靶基因涉及染色體配對和/或鏈交換。
[0100]14.根據(jù)條款13的方法，其中所述靶基因選自RHD54/TID1、DMCU SAE3、REDUH0P1、H0P2、REC8、MER1、MRE2、ZIP1、ZIP2、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA、SMC3、SCC1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、S0L0DANCERS、HIM6, CHK2 或其功能同系物。
[0101]15.根據(jù)條款10的方法，其中所述靶基因涉及減數(shù)分裂重組過程。
[0102]16.根據(jù)條款15的方法，其中所述靶基因選自SGS1、MSH4、MSH5、ZIPl和ZIP2或其功能同系物。
[0103]17.根據(jù)條款5和/或10的方法，其中所述干擾一種或多種靶基因由阻止其轉(zhuǎn)錄組成。
[0104]18.根據(jù)條 款17的方法，其中轉(zhuǎn)錄借助于針對所述靶基因啟動子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子得到阻止。
[0105]19.根據(jù)條款17的方法，其中轉(zhuǎn)錄借助于表達對所述靶基因啟動子起作用的負作用轉(zhuǎn)錄因子得到阻止。
[0106]20.根據(jù)條款5和/或10的方法，其中所述干擾一種或多種靶基因由使所述靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物失穩(wěn)組成。
[0107]21.根據(jù)條款20的方法，其中所述靶基因mRNA借助于核酸分子失穩(wěn)，所述核酸分子與所述靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物互補且選自反義RNA、RNAi分子、病毒誘導的基因沉默(VIGS)分子、共阻遏分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸。
[0108]22.根據(jù)條款5和/或10的方法，其中所述干擾一種或多種靶基因由抑制所述靶基因表達產(chǎn)物組成。
[0109]23.根據(jù)條款22的方法，其中所述靶基因表達產(chǎn)物借助于一種或多種顯性負性核酸構(gòu)建體的一種或多種表達產(chǎn)物得到抑制。
[0110]24.根據(jù)條款22的方法，其中所述靶基因表達產(chǎn)物借助于一種或多種化學化合物得到抑制。
[0111]25.根據(jù)條款5和/或10的方法，其中所述干擾一種或多種靶基因由一種或多種突變引入所述靶基因內(nèi)，導致其生物學功能的擾動組成。
[0112]26.根據(jù)條款25的方法，其中所述一種或多種突變借助于一種或多種化學化合物和/或物理方法和/或遺傳元件的插入而隨機引入。
[0113]27.根據(jù)條款26的方法，其中所述一種或多種化學化合物選自甲磺酸乙酯、亞硝基甲基脲、羥胺、原黃素、N-甲基-N-亞硝基胍、N-乙基-N-亞硝基脲、N-甲基-N-硝基-亞硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亞胺、疊氮化鈉、福爾馬林、聚氨酯、苯酚和環(huán)氧乙烷。
[0114]28.根據(jù)條款26的方法，其中所述物理方法選自UV照射、快中子暴露、X射線、Y照射。
[0115]29.根據(jù)條款26的方法，其中所述遺傳元件選自轉(zhuǎn)座子、T-DNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒元件。
[0116]30.根據(jù)條款25的方法，其中所述一種或多種突變借助于同源重組或基于寡核苷酸的突變誘導而特異性引入。
[0117]31.根據(jù)條款9的方法，其中第二次分裂重構(gòu)自發(fā)發(fā)生，特別地不干擾所述起始生物體。
[0118]32.根據(jù)條款9的方法，其中第二次分裂重構(gòu)借助于遺傳修飾進行誘導。
[0119]33.根據(jù)條款32的方法，其中所述遺傳修飾是瞬時的。
[0120]34.根據(jù)條款32的方法，其中所述遺傳修飾通過將遺傳元件穩(wěn)定摻入所述基因組內(nèi)來實現(xiàn)，所述遺傳元件增加所述生物體中的第二次分裂重構(gòu)事件數(shù)目。
[0121]35.根據(jù)條款9的方法，其中第二次分裂重構(gòu)通過對所述父本植物實施環(huán)境脅迫來實現(xiàn)。
[0122]36.根據(jù)條款35的方法，其中所述環(huán)境脅迫選自溫度脅迫、NO2、氧化亞氮(N2O)或其組合。
[0123]37.根據(jù)條款1-36的任何組合的方法，其中從所述接合子的母本染色體的喪失通過使用單倍體誘導系作為所述雌性進行誘導。
[0124]38.根據(jù)條款37的方法，其中所述雌性是不同物種的植物。
[0125]39.根據(jù)條款1-37的任何組合的方法，其中所述雌性植物是包含異源轉(zhuǎn)基因表達盒的轉(zhuǎn)基因植物，所述表達盒包含與多核苷酸可操作地連接的啟動子，所述多核苷酸編碼重組改變的CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2多肽，且具有相應失活的內(nèi)源CENH3、CENPC、MIS12、NDC80 或 NUF2 基因。
[0126]40.含有其中所述母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合，所述集合由遺傳上互補的種子對組成，當由所述種子生長的植物雜交時，導致基本上相同的雜種，并且所述種子集合可通過根據(jù)條款1-39的任何組合的方法獲得。
[0127]41.一種用于提供用于產(chǎn)生植物的親本植物集合的方法，所述產(chǎn)生的植物的遺傳構(gòu)成與其雄性祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同，所述方法包括在倍增所述種子的染色體數(shù)目之后或之前，由根據(jù)條款40的種子集合的種子生長植物，并且將兩個遺傳上互補的植物鑒定為親本植物。
[0128]42.根據(jù)條款41的方法，其中就其遺傳構(gòu)成篩選所述種子集合或其生長的所述植物，以鑒定其遺傳構(gòu)成與其父本祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的植物，并且鑒定其遺傳構(gòu)成與其父本祖母的遺傳構(gòu)成基本上相同的另一個植物。[0129]43.根據(jù)條款40-42的任何組合的方法，其中其遺傳構(gòu)成與其父本祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的植物與其遺傳構(gòu)成和其父本祖母的遺傳構(gòu)成基本上相同的另一個植物雜交，以便獲得其遺傳構(gòu)成與其自身祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的后代植物。
[0130]本發(fā)明將在下述實施例中進一步舉例說明，所述實施例不預期以任何方式限制本發(fā)明。在實施例中，參考下述附圖:
[0131]圖1:所謂的帕斯卡三角，描述對于每個花粉四分體的染色體互補性在物種染色體數(shù)目函數(shù)中的特定后果。從頂部到底部，單倍染色體數(shù)目增加，并且在每行上的數(shù)目總和始終等于2n，是可以起于其中涉及η條染色體的減數(shù)分裂的不同減數(shù)分裂產(chǎn)物的總數(shù)目。如果以第七行作為例子(對于例如黃瓜，具有7條單倍染色體，η=7)，則可見完全互補事件的數(shù)目始終是1，即在行上的第一個數(shù)目，而在行上的第二個數(shù)目對應于單倍染色體的數(shù)目。相同行中的后續(xù)數(shù)目對應于在四分體中分別具有2、3、4、5和6條非互補染色體的預期數(shù)目的減數(shù)分裂產(chǎn)物。具有一條非互補染色體的總事件數(shù)目是7*2，具有兩條非互補染色體的總事件數(shù)目是21*2，等等。如果例如3條染色體是非互補的，則這暗示其他四條是互補的。重要的是，在這個背景下的“非互補的”實際上僅指這些染色體的端粒端。如果我們例如具有含3條非互補染色體和在重組后僅40%雜合性的情況，則7條染色體中的4條將是完全互補的，而其他3條染色體仍是60%互補的。
[0132]圖2:這個表格顯示作為單倍染色體數(shù)目的函數(shù)，在花粉四分體的四個成員中發(fā)現(xiàn)某一程度的互補性的概率(機會百分比)。對于例如黃瓜(具有n=7)，在黃瓜的花粉四分體內(nèi)遇到具有0、1、2或3條非互補染色體(且因此分別具有7、6、5或4條互補染色體)的減數(shù)分裂產(chǎn)物的機會因此分別是1.6% (= (1+1)/128),10.9% (= (7+7)/128),32.8% (=(21+21)/128)和 54.7% (= (35+35)/128)。
[0133]在四重體的四個成員中發(fā)現(xiàn)某一程度的互補性的概率(機會百分比)通過圖2中的表格給出。在黃瓜的花粉四分體內(nèi)遇到具有0、1、2或3條非互補染色體(且因此分別具有7、6、5或4條互補染色體)的減數(shù)分裂產(chǎn)物的機會因此分別是1.6% (= (1+1)/128)、10.9%(=(7+7) /128),32.8% (= (21+21)/128)和 54.7% (= (35+35)/128)。
[0134]圖3:具有4條單倍染色體(n=4)的減數(shù)分裂事件的圖示。雜種植物的一個親本對雜種貢獻藍色染色體，而另一個親本對雜種貢獻紅色染色體。在第一個步驟中，基因組從2n倍增到4n，并且隨后交換可以在姐妹染色單體的同源區(qū)之間發(fā)生，如此處用每條染色體單個交換事件舉例說明的。在第一次減數(shù)分裂過程中，產(chǎn)生兩個二倍體子細胞，其是遺傳上完全互補的(即，如果將兩者的基因組合在一起，則獲得來自分裂前的4n基因組組成)。在該圖中，僅顯示了減數(shù)分裂I期結(jié)果的一個可能實例。在第二次減數(shù)分裂過程中，產(chǎn)生配子(在這個背景下:小孢子或花粉粒)，并且染色體可以隨機分離到任一子細胞。這導致211-1不同對的子細胞(配子)。對于在左側(cè)上的子細胞，該圖顯示了一個可能的配子對，而對于在右側(cè)上的子細胞，顯示了所有8個可能的配子對(二〗3=〗11-1)。
[0135]當隨后由不同配子再生加倍單倍體植物時(例如通過本發(fā)明的方法，通過生成單倍體植物且使其基因組倍增)，這些植物可以彼此雜交。緊在不同染色體組下的數(shù)目對應于與該圖最左側(cè)上的染色體組互補的染色體數(shù)目。如果例如含有在最左側(cè)上描繪的四條染色體(即四條完全藍色的染色體)的植物將與含有四條完全紅色的染色體的植物雜交，所述四條完全紅色的染色體來自右側(cè)上的八個染色體對中的第一個，則所有4條染色體將是互補的。這個雜交將導致已產(chǎn)生配子的原始雜種植物的確切重構(gòu)。類似地，使具有四條藍色染色體的相同植物與在右側(cè)上展示的含有其他可能染色體組的植物(更精確地:八對中每一左側(cè)染色體組)雜交，導致原始雜種植物的完全重構(gòu)(當所有4條染色體都是完全互補的時)，或?qū)е略茧s種植物的接近完全重構(gòu)(當4條染色體中的一條或兩條不是完全互補的時)。超過兩條染色體不互補的情況不存在，因為配子源于相同減數(shù)分裂事件。此外，由該圖明確的是大部分“非互補”染色體事實上是互補的，并且雜交將導致高度雜合的后代；唯一不互補的染色體部分是由于在染色體的端粒處的交換事件，所述交換區(qū)域在所得到的后代中將變成純合的。當與在最左側(cè)上的染色體組相比較，總計在染色體對下的數(shù)目，以分組具有O、I或2條非互補染色體的事件時，這導致對于n=4的2-8-6分布，其還可以在圖1的三角的第四行中發(fā)現(xiàn)(其中它們作為1-4-6-4-1展示)。
[0136] 在該圖的最右側(cè)上，描述了第二個可能的配子對，其可以源自減數(shù)分裂II期過程中的最左側(cè)二倍體細胞。在該圖底部上列出的數(shù)目代表:當來自該對的配子之一與源自最右側(cè)二倍體細胞的16個配子中的任何組合時的互補染色體數(shù)目。再次，可以觀察到相同結(jié)果:在16個配子中，2個是完全互補的(即4條互補染色體)，8個具有一條非互補染色體，并且6個具有兩條非互補染色體。通過使源自單個減數(shù)分裂事件的四個產(chǎn)物保持在一起，并且通過提供獲得與這四個減數(shù)分裂產(chǎn)物的后代植物在遺傳上相同的方法，本發(fā)明使鑒定后代植物對的機會達到最大，所述后代植物對在雜交后可以導致原始雜種植物，或在遺傳上與原始雜種基本上相同的雜種。
[0137]圖4:根據(jù)本發(fā)明的系譜的簡化概述，假定不發(fā)生重組。起因于兩個(純合)親本系(分別具有基因型AA和BB)雜交的雜種植物產(chǎn)生以四分體形式的花粉粒。當單個四分體用于給單倍體誘導母本植物(具有隨機基因型)授粉時，起因于這個雜交的后代將由一組四粒單倍體種子組成。遺傳上，這些種子是A、A、B和B (在不存在重組的情況下)，并且不存在來自母本植物的遺傳貢 獻。因此，這四粒單倍體種子僅具有兩個祖父母，即產(chǎn)生花粉四分體的雜種父本植物的親本系。在基因組倍增后，可以獲得四個加倍單倍體植物，其在不存在重組的情況下，將始終在遺傳上完全互補配對。使來自對中的任何的兩個遺傳上互補的植物雜交導致原始雜種植物的重構(gòu)。如圖1、2和3舉例說明的，當重組的確發(fā)生時，情況更復雜。當重組發(fā)生時，在花粉四分體的后代中發(fā)現(xiàn)一對完全互補植物的機會根據(jù)單倍染色體數(shù)目而降低時，但在不存在重組的情況下，染色體數(shù)目對結(jié)果沒有作用。
實施例
[0138]實施例1
[0139]四重花粉脫離蕓苔屬植物的鑒定
[0140]用于執(zhí)行本發(fā)明的基本來源是脫落其以四分體形式的花粉粒的目的物種的植物，由此來自減數(shù)分裂的四個產(chǎn)物保持彼此物理上附著。此類植物可以在突變體篩選中或通過轉(zhuǎn)基因方法獲得。這個實施例舉例說明了第一個選項，而第二個選項將在后續(xù)實施例中說明。
[0141]為了鑒定顯示出四重花粉表型的植物，在表型上篩選甘藍(Brassica oleracea)EMS-突變型群體，以檢測在個體植物的花藥中具有四重表型的花粉粒(即花粉四分體)的出現(xiàn)。在大容量方法中，將來自多個植物的花粉合并在一起，并且在溶液中稀釋，從而使得可以明確辨別個體花粉粒。這些花粉庫隨后通過眼睛在雙目鏡下進行篩選，但備選地，這個篩選用流式細胞術(shù)或通過過濾(使用具有大于個體花粉粒直徑，但小于花粉四分體直徑的孔徑的濾器)也是可能的。在檢測花粉庫中的所需四重表型后，單獨篩選對該庫貢獻花粉的所有植物，直到陽性鑒定四重突變型植物。在下一代中，證實四重表型的可傳性。
[0142]實施例2
[0143]制備從其Fl后代中消除母本基因組的蕓苔屬植物
[0144]Maruthachalam&Chan 的出版物(Nature464,615-619 ；2010)教導了用關(guān)于GFP-CENH3-尾部互換蛋白質(zhì)(tailswap protein)的過表達構(gòu)建體轉(zhuǎn)化擬南芥cenh3突變型植物，導致在受精后接合子中的異常有絲分裂。在這個異常有絲分裂過程中，從分裂接合子中選擇性消除母本染色體。因為CENH3蛋白質(zhì)在真核生物中是通用的，并且它的功能是非常良好保守的，所以來自擬南芥屬的這個策略可廣泛應用于其他植物物種中。
[0145]為了制備在其Fl后代中母本染色體選擇性消除的甘藍植物，制備缺乏蛋白質(zhì)的功能形式的蕓苔屬植物，所述蛋白質(zhì)與來自擬南芥屬的CENH3直向同源。這借助于RNAi方法來實現(xiàn)。這種植物隨后借助于土壤桿菌屬(Agrobacterium)感染在遺傳上轉(zhuǎn)化,使用由Maruthachalam&Chan(Nature464,615-619 ;2010)描述的 GFP-CENH3-尾部互換構(gòu)建體。由于純合cenh3突變型植物(如在擬南芥屬的情況下)的致死率，必須用這種構(gòu)建體轉(zhuǎn)化雜合沉默的植物。轉(zhuǎn)化體植物隨后基于構(gòu)建體的選擇標記進行選擇，并且GFP-CENH3-尾部互換融合蛋白的存在和正確表達可以在有絲分裂過程中用熒光顯微鏡檢查進行檢測。
[0146]實施例3
[0147]在擬南芥屬中組合四重表型與母本基因組消除
[0148]這個實施例舉例說明可以如何有效重構(gòu)雜種植物的基因型。
[0149]制備含有RNAi構(gòu)建體的單拷貝(以純合狀態(tài))的Ler登記的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物，所述RNAi構(gòu)建體靶向QRTl基因(At5g55590)，由CaMV35S組成型啟動子驅(qū)動。備選地，其他技術(shù)例如人工微小RNA (amiRNA)可以用于這個目的。這個植物隨后與Ws登記的野生型擬南芥植物雜交。 [0150]所得到的Fl代由具有混合Ler/Ws背景的雜種植物組成，所述雜種植物對于RNAi構(gòu)建體是半合子。因為RNAi構(gòu)建體以孢子體和顯性方式起作用，所以所有Fl植物都顯示出四重花粉表型。隨后使顯示出四重花粉表型的Fl植物作為父本與Col-O登記的擬南芥cenh3突變型植物雜交，所述突變型植物已用如由Maruthachalam&Chan (Nature464,615-619 ；2010)報道的GFP-CENH3-尾部互換構(gòu)建體進行遺傳轉(zhuǎn)化。這個雜交導致在接合子中的第一次有絲分裂過程中母本染色體的消除，導致單倍體種子的形成。
[0151]在用于雜交的制備中，父本植物的幾乎裂開的花藥在雙目顯微鏡下打開，以允許個體的成熟花粉四分體的收集。使用睫毛或細刷毛，將每個花粉四分體小心沉積到母本植物的雌蕊上，并且允許四個花粉粒給四個胚珠受精。允許起因于用單個花粉四分體的這個有限授粉的四粒種子成熟，并且隨后收獲且允許發(fā)芽。備選地，超過一個四分體可以沉積到母本植物的雌蕊上，但應注意花粉粒的數(shù)目不超過在物種的雌性生殖部分中的胚珠平均數(shù)目。超過一個四分體用于授粉的使用亦即減少由其可以鑒定遺傳上互補的后代植物的效率。
[0152]起因于轉(zhuǎn)基因Col-O母本植物的有限授粉的幼苗的倍體通過流式細胞術(shù)進行測試。它們的倍體是n，除了其中自發(fā)基因組倍增至2n已同時發(fā)生的一些情況外。對于單倍體個體，基因組倍增隨后通過技術(shù)人員已知的標準方法(例如秋水仙堿處理)來完成。一旦起因于這個雜交的四個幼苗是2n，就分離它們的基因組DNA并且就覆蓋整個擬南芥屬基因組的遺傳標記進行遺傳分析。尤其地，測試在Col-O和Ler之間以及在Col-O和Ws之間多態(tài)性的標記，以區(qū)分兩個親本基因組對四個后代植物的貢獻。由于從接合子中消除母本基因組，四個后代植物僅含有來自雜種父本植物的重組染色體，并且因此它們對于所有Col-O特異性標記都測試陰性。
[0153]圖2顯示在花粉四分體內(nèi)具有某一數(shù)目的互補染色體的后代植物的發(fā)生率依賴單倍染色體數(shù)目U)。擬南芥屬具有五條染色體，并且由于原始父本植物中的四重花粉表型，四個幼苗的染色體星座起因于單次減數(shù)分裂。這暗示對于兩個完全互補染色體存在于單個花粉四分體中的理論機會是16個中的I個(6.3%)。機會對于具有含一條非互補染色體的兩個基因組是31.3%，并且對于具有含兩條非互補染色體的兩個基因組是62.5%。在所有情況下，四分體中的個體花粉粒因此彼此至少50%互補。重要的是，如果重組導致例如40%雜合性，則在個體花粉粒的基因組之間的總體互補性始終高于50%，因為即使“非互補”染色體隨后仍彼此60%互補。
[0154]因此，在理論上，平均僅需要使用花粉四分體的16次個體雜交，以鑒定具有基本上互補的染色體組的兩個擬南芥屬幼苗。然而，在實踐中，因為授粉的效率、種子形成和植物發(fā)芽，并且存活一般低于100百分比，所以需要更多。作為概測法，用單個四分體完成多10倍的雜交，即在這種情況下160次，以使成功機會達到最大。
[0155]在鑒定后，使兩個遺傳上基本上互補的植物生長至開花且隨后雜交。起因于這個雜交的Fl后代的遺傳構(gòu)成在實驗上顯示為與其父本祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同，即具有Ler/Ws雜種背景的qrtl突變型植物。
[0156]實施例4
[0157]在擬南芥屬中伴母本基因組消除的四重表型與非轉(zhuǎn)基因后代的組合
[0158]在實施例3中，F(xiàn)l后代保持轉(zhuǎn)基因，因為它保持靶向QRTl基因的RNAi構(gòu)建體，并且因此還保持四重花粉表型。然而，當在成熟花粉粒中特異性表達綠色熒光蛋白的GFP報道分子盒整合到實施例3中 使用的RNAi構(gòu)建體內(nèi)時，這允許其中后代植物并非轉(zhuǎn)基因的另一種方法。T-DNA構(gòu)建體隨后還含有在晚期花粉特異性啟動子(LAT52啟動子；Twell等人，1990，Deve1pment 109:705-713 )下具有核定位信號的GFP蛋白質(zhì)，其允許這個構(gòu)建體在成熟花粉粒中的容易視覺檢測。
[0159]在實施例3中提及的Ler/Ws雜種植物(對于靶向QRTl的RNAi構(gòu)建體半合子)的花藥壓片(squashes)中，在視覺上(使用熒光雙目鏡或顯微鏡)或通過FACS (熒光激活細胞分選)，選擇其中四個花粉粒中的兩個在其核中不表達GFP的花粉四分體。四個花粉粒中的僅兩個因此含有靶向QRTl基因的RNAi構(gòu)建體。用此類花粉四分體給上述Col-O母本植物授粉導致兩個轉(zhuǎn)基因單倍體后代植物(含有RNAi構(gòu)建體)和兩個非轉(zhuǎn)基因單倍體后代植物(不含RNAi構(gòu)建體)，所述授粉誘導在接合子中的第一次有絲分裂過程中母本染色體的消除。
[0160]非轉(zhuǎn)基因后代植物根據(jù)定義缺乏含有關(guān)于QRTl的RNAi構(gòu)建體的Ler染色體片段，并且這兩個植物的雜交因此絕不導致原始Fl雜種的確切重構(gòu)，因為重構(gòu)的植物對于至少一個Ws染色體區(qū)域?qū)⑹羌兒系?，所述染色體區(qū)域即對應于在Ler親本植物中含有關(guān)于QRTl的RNAi構(gòu)建體的染色體區(qū)域。
[0161]實施例5
[0162]在甜椒(辣椒(Capsicum annuum))中組合四重花粉表型與第二次分裂重構(gòu)
[0163]當?shù)诙畏至阎貥?gòu)(SDR)出現(xiàn)時，第二次減數(shù)分裂不發(fā)生，并且減數(shù)分裂的結(jié)果將是兩個二倍體花粉粒，而不是四個單倍體花粉粒。因此，當減數(shù)分裂產(chǎn)物保持彼此物理上附著時(如關(guān)于四重花粉表型的情況)當SDR發(fā)生時，植物將產(chǎn)生花粉二分體。在本發(fā)明的這個優(yōu)選實施方案中，兩個二倍體減數(shù)分裂產(chǎn)物保持彼此物理上附著，并且因為它們的染色體具有相同的重組斷裂點，所以兩個花粉粒彼此100%遺傳互補。
[0164]通過RNAi方法獲得顯示出四重花粉表型的甜椒植物(辣椒)，類似于如實施例3中所述。對其后代植物-對于四重表型純合-實施冷脅迫，以便增加未減數(shù)小孢子(配子)形成的頻率，如由Zhang等人.(2002) Journal of HorticulturalScience&Biotechnology78:84-88和W02006/094773的實施例2中描述的)。冷處理的植物的花藥中產(chǎn)生的最多25%小孢子和花粉具有二分體的形式。分離的小孢子級分通過顯微鏡分析(備選地可以使用流式細胞術(shù))對于二分體進一步富集。使用這種方法，稱為近反向育種(W02006/094773)的應用可以在優(yōu)選實施方案中允許。
[0165]為了這個目的，根據(jù)實施例2中概述的實驗方法，制備第二個甜椒植物，其在第一次有絲分裂過程中從其接合子中消除母本基因組。這個轉(zhuǎn)基因甜椒植物用源自上述冷處理的甜椒植物的單個花粉二分體授粉，并且將所得到的兩個二倍體種子收獲且發(fā)芽。在來自花粉四重體中的花藥壓片中手動選擇花粉二分體，所述花粉四重體起因于非SDR減數(shù)分裂事件。
[0166]隨后使由這兩個二倍體種子生長的植物雜交，并且使用遺傳標記，這個雜交的后代植物的遺傳組成可以證實為與甜椒植物的遺傳組成基本上相同，所述甜椒植物產(chǎn)生我們用于授粉的花粉二分體。然而，由于在花粉二分體的形成過程中已發(fā)生的交換事件，已引入一些端粒變異，其在所選雜種背景中提供了另外的遺傳變異。
[0167]因此，在這個實施例中通過用花粉二分體(由另一個甜椒植物產(chǎn)生)給單倍體誘導母本植物授粉制備的甜椒植物，與產(chǎn)生用于授粉的花粉二分體的甜椒植物僅在遺傳上“基本上相同”，因為由于在花粉二分體的形成過程中已發(fā)生的交換事件，另外的遺傳變異已在端粒處引入。父本植物的所有遺傳材料已得到維持，但它的一些部分已通過交換事件重排，并且這個重排可以引起另外的表型效應。
[0168]這個實施例因此允許在所選(良種)雜種植物中引入另外的遺傳變異。當與原始雜種表型相比較時，這個另外的變異可以具有另外的正面或負面表型效應，并且它因此提供了進一步改良(和/或細調(diào))雜種表型的有利機會，而不喪失在原始雜種中包含的所需性狀的組合。
[0169]備選地，顯示出四重表型的甜椒植物可以與自然顯示出SDR的高于平均程度的甜椒植物雜交。它們的后代隨后自然產(chǎn)生高于平均百分比的花粉二分體。另一個策略是使自然顯示出SDR的高于平均程度的甜椒植物群體誘變，并且在前面的遺傳學方法中，在這個突變型群體中篩選展示四重花粉表型的植物。
[0170]在每個和每一個二分體中，兩個花粉粒彼此遺傳上基本上互補的機會是100% (具有相同的染色體斷裂點)。在二分體中包含的兩個小孢子根據(jù)定義是遺傳上基本上互補的，并且使可以源自這些二分體中的任何一個的兩個植物雜交始終導致雜種植物，其與產(chǎn)生二分體的原始雜種植物基本上在遺傳上相同。這個實施方案因此極大改善近反向育種技術(shù)的效率。
[0171]一般地，在本發(fā)明的這個實施方案中，攜帶遺傳特征的植物通過有限授粉進行授粉，所述遺傳特征引起母本染色體從其Fl后代中消除。在這個雜交中使用的花粉是得自相同物種的雜種植物的單個花粉二分體，所述雜種植物顯示出與SDR組合的四重花粉表型。這個花粉二分體通過下述獲得:在視覺上篩選壓片花藥且隨后從四分體星座(其起因于在其過程中未發(fā)生SDR的減數(shù)分裂)中選擇二分體星座，或借助于流式細胞術(shù)或細胞分選就二分體富集花粉餾分(在更高流通量設(shè)置中)。
[0172] 在攜帶遺傳特征的母本植物授粉后，所述遺傳特征引起母本染色體從其Fl后代中消除，在二分體中包含的兩個二倍體花粉粒各自給胚珠受精，并且允許種子形成且成熟。在成熟后，將起因于這個雜交的兩粒種子收獲且發(fā)芽。所得到的幼苗隨后借助于流式細胞術(shù)測試其倍體水平，以證實如預期的，它們真的是2η。
[0173]隨后，從兩個幼苗中分離基因組DNA，并且在兩個個體中測試覆蓋整個基因組的遺傳標記。由于從接合子中消除母本染色體，兩個幼苗預期僅具有父本染色體。由于來自兩個幼苗的染色體源于單次減數(shù)分裂的事實，所有染色體斷裂點都是相同的，并且它們的基因組是100%互補的。這通過全基因組標記分析加以證實。
[0174]幼苗隨后生長至成熟，并且彼此雜交。它們的Fl后代與在第一次雜交中用作父本的原始起始雜種植物在遺傳上基本上相同，除了在SDR配子的形成過程中已發(fā)生的交換事件外。這些交換事件引入一些端粒變異，其在所選雜種背景中提供了另外的遺傳變異。
[0175]父本祖父生物體的(雜種)基因型的近確切重構(gòu)在僅兩代的時間中實現(xiàn)，并且無需中間體再生或基因組倍增步驟或組織培養(yǎng)。
[0176]實施例6
[0177]在擬南芥屬中組合四重花粉表型與染色體重組的抑制和母本染色體消除
[0178]從顯示出四重花粉表型的擬南芥屬植物和其中染色體重組被部分或完全抑制(通過轉(zhuǎn)基因、突變或化學方法)的另一個擬南芥屬植物之間的雜交中，可以選擇其中組合兩個性質(zhì)的F2后代植物:起因于單次減數(shù)分裂的四個花粉粒保持彼此物理上附著，直到開花和花粉脫落時，并且在減數(shù)分裂過程中，同源染色體的重組被抑制。
[0179]這個后代植物允許反向育種(W003/017753 ；Dirks等人2009)以更有效方式應用。因為減數(shù)分裂產(chǎn)物保持彼此物理上附著，所以鑒定具有基本上互補的染色體組的兩個花粉粒的機會極大增加。不同四分體數(shù)目是物種染色體數(shù)目的函數(shù)，但在單個四分體內(nèi)，然而，兩個花粉粒具有完全互補的染色體組的機會始終是50%，因為四個花粉?；パa配對。在每個和每一個四分體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)兩對互補花粉粒的機會因此是100%。
[0180]如實施例3中所述，制備含有RNAi構(gòu)建體的單拷貝(以純合狀態(tài))的擬南芥Ler植物，所述RNAi構(gòu)建體靶向QRTl基因，由CaMV35S組成型啟動子驅(qū)動。這個植物隨后與含有RNAi構(gòu)建體的純合單拷貝的Ws登記的擬南芥植物雜交，所述RNAi構(gòu)建體靶向DMCl基因，也由CaMV35S組成型啟動子驅(qū)動。
[0181]所得到的Fl代由具有混合Ler/Ws背景的雜種植物組成，所述雜種植物對于兩個RNAi構(gòu)建體都是半合子的。因為RNAi構(gòu)建體兩者以孢子體和顯性方式起作用，所以Fl植物顯示出四重花粉表型和在減數(shù)分裂過程中染色體重組的抑制。作為不希望有的副作用，染色體重組的抑制還導致不平衡花粉四分體(在平衡四分體旁邊)的出現(xiàn)，因為在不存在足夠功能DMCl蛋白質(zhì)的情況下，每條染色體在分裂的子細胞上隨機分布。然而，平衡四分體可以在實驗上(通過視覺檢查和/或流式細胞術(shù))選自花藥。
[0182]源自Fl植物(顯示出與染色體重組抑制組合的四重花粉表型)的平衡花粉四分體(對于兩個轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體都是半合子的)，隨后用于給Col-O登記的擬南芥cenh3突變型植物(如由Maruthachalam&Chan, 2010制備且報道的)授粉，所述突變型植物已用由Maruthachalam&Chan (2010)報道的GFP-CENH3-尾部互換構(gòu)建體進行遺傳轉(zhuǎn)化，所述授粉導致在接合子中的第一次有絲分裂過程中母本染色體的消除。
[0183]當單個平衡花粉四分體用于授粉母本植物的雌蕊時，這個雜交理想地導致四粒單倍體后代種子。允許四粒后代種子發(fā)芽，并且用標記遺傳測試幼苗。因為在減數(shù)分裂過程中未發(fā)生染色體重組(由于靶向DMCl的RNAi構(gòu)建體，所有染色體都整體傳遞給下一代)，所以僅需要極少標記以測試每個染色體，以測定它是繼承自Ler祖父還是Ws祖父(事實上，每條染色體的單個多態(tài)性標記將是足夠的；在我們的實驗方法中，我們使用每個染色體臂一個標記，即每條染色體兩個標記)。
[0184]為了確保母本植物在遺傳上對后代沒有貢獻，還測試Col-O特異性標記，但無法鑒定Col-O代材料，如實施例3中的情況一樣。[0185]發(fā)現(xiàn)四個后代植物在遺傳上完全互補配對，并且基于遺傳標記分析，可以有效鑒定這些對。使此類遺傳上互補的后代植物對彼此雜交導致原始雜種植物的有效遺傳重構(gòu)，所述原始雜種植物產(chǎn)生用于授粉的花粉四分體，即對于RNAi構(gòu)建體半合子的Ler/Ws雜種植物。圖4舉例說明在這個實驗中使用的植物系譜。
【權(quán)利要求】
1.用于產(chǎn)生種子集合的方法，所述種子與它們起于其的雄配子在遺傳上相同，所述方法包括: a)將有限數(shù)目的父本配子置于花的柱頭上，以使母體卵細胞受精，以獲得許多接合子，所述父本配子具有四分體或二分體的形式； b)誘導來自所述接合子的母本染色體的喪失，以獲得含有其中所述母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述父本配子的有限數(shù)目等于或低于攜帶所述柱頭的雌性生殖器官中含有的卵細胞數(shù)目。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中所述父本配子的有限數(shù)目是二或四。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項的方法，其中具有四分體或二分體形式的所述父本配子是干擾四分小孢子分離的結(jié)果。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中干擾四分小孢子分離包括 干擾涉及所述小孢子之間的果膠層分解的一種或多種靶基因，所述果膠層分解起因于單次減數(shù)分裂。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述一種或多種靶基因選自QRTl、QRT2、QRT3或其功能冋系物。
7.根據(jù)權(quán)利要求4 的方法，其中干擾四分小孢子分離通過化學方法來實現(xiàn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述父本植物顯示出染色體重組的抑制。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的方法，其中所述父本植物顯示出在減數(shù)分裂過程中的第二次分裂重構(gòu)(SDR)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述染色體重組的抑制通過干擾涉及重組的一種或多種靶基因來實現(xiàn)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述一種或多種靶基因涉及雙鏈斷裂，例如SP011、MERl、MER2、MRE2、MEI4、REC102、REC104, RECl 14、MEK1/MRE4、REDl、HOPl、RAD50、MREl1、XRS2或其功能同系物，或其中所述一種或多種靶基因涉及染色體配對和/或鏈交換，例如RHD54/TID1、DMCl、SAE3、REDl、HOPl、H0P2、REC8、MERl、MRE2、ZIPl、ZIP2、MEI5、RAD51、RAD52、RAD54、RAD55、RAD57、RPA、SMC3、SCC1、MSH2、MSH3、MSH6、PMS1、SOLODANCERS、HM6、CHK2或其功能同系物，或其中所述一種或多種靶基因涉及減數(shù)分裂重組過程，例如SGS1、MSH4、MSH5、ZIP1和ZIP2或其功能同系物，或其中所述一種或多種靶基因選自PRD1、PRD2、PRD3、PHSl、NBSl、COMl、MNDl、MER3/RCK、ZIP3、ZIP4、PTD、SHOCl、ZYPl、MLHl、MLH3 或其功能冋系物。
12.根據(jù)權(quán)利要求5或10的方法，其中所述干擾一種或多種靶基因由阻止其轉(zhuǎn)錄組成。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中轉(zhuǎn)錄優(yōu)選借助于針對所述靶基因啟動子的RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸或RNAi分子得到阻止，或其中轉(zhuǎn)錄優(yōu)選借助于表達對所述靶基因啟動子起作用的負作用轉(zhuǎn)錄因子得到阻止。
14.根據(jù)權(quán)利要求5或10的方法，其中所述干擾一種或多種靶基因由使所述靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物失穩(wěn)組成，優(yōu)選借助于核酸分子，所述核酸分子與所述靶基因mRNA或轉(zhuǎn)錄物互補，選自反義RNA、RNAi分子、病毒誘導的基因沉默(VIGS)分子、共阻遏分子、RNA寡核苷酸或DNA寡核苷酸，或其中所述干擾一種或多種靶基因由抑制所述靶基因表達產(chǎn)物組成，優(yōu)選借助于一種或多種顯性負性核酸構(gòu)建體的一種或多種表達產(chǎn)物，或優(yōu)選借助于一種或多種化學化合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求5或10的方法，其中所述干擾一種或多種靶基因由一種或多種突變引入所述靶基因內(nèi)，導致其生物學功能的擾動組成，并且其中所述一種或多種突變優(yōu)選借助于一種或多種化學化合物和/或通過物理方法和/或通過遺傳元件的插入而隨機引入，所述一種或多種化學化合物例如甲磺酸乙酯、亞硝基甲基脲、羥胺、原黃素、N-甲基-N-亞硝基胍、N-乙基-N-亞硝基脲、N-甲基-N-硝基-亞硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亞胺、疊氮化鈉、福爾馬林、聚氨酯、苯酚、環(huán)氧乙烷，所述物理方法例如UV照射、快中子暴露、X射線、Y照射，所述遺傳元件例如轉(zhuǎn)座子、T-DNA、逆轉(zhuǎn)錄病毒元件，和/或其中所述一種或多種突變借助于同源重組或基于寡核苷酸的突變誘導而特異性引入。
16.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中第二次分裂重構(gòu)自發(fā)發(fā)生，特別地不干擾所述起始生物體。
17.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中第二次分裂重構(gòu)借助于遺傳修飾進行誘導，其中所述遺傳修飾是瞬時的，或其中所述遺傳修飾通過將遺傳元件穩(wěn)定摻入所述基因組內(nèi)來實現(xiàn)，所述遺傳元件增加所述生物體中的第二次分裂重構(gòu)事件數(shù)目，或其中第二次分裂重構(gòu)通過對所述父本植物實施環(huán)境脅迫來實現(xiàn)，所述環(huán)境脅迫例如溫度脅迫、NO2、氧化亞氮(N2O)或其組合。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項的方法，其中來自所述接合子的母本染色體的喪失通過使用單倍體誘導系作為所述雌性進行誘導。
19.根據(jù)權(quán)利要 求18的方法，其中所述雌性是不同種的植物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一項的方法，其中所述雌性植物是包含異源轉(zhuǎn)基因表達盒的轉(zhuǎn)基因植物，所述表達盒包含與多核苷酸可操作地連接的啟動子，所述多核苷酸編碼重組改變的CENH3、CENPC、MIS12、NDC80或NUF2多肽，且具有相應失活的內(nèi)源CENH3、CENPC、MIS12、NDC80 或 NUF2 基因。
21.含有其中所述母本染色體不存在的有限數(shù)目種子的種子集合，所述集合由遺傳上互補的種子對組成，當由所述種子生長的植物雜交時，導致基本上相同的雜種，并且所述種子集合可通過根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項的方法獲得。
22.一種用于提供用于產(chǎn)生植物的親本植物集合的方法，所述植物的遺傳構(gòu)成與其雄性祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同，所述方法包括在倍增所述種子的染色體數(shù)目之后或之前，由根據(jù)權(quán)利要求21的種子集合的種子生長植物，并且將兩個遺傳上互補的植物鑒定為親本植物。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述種子集合或其生長的所述植物就其遺傳構(gòu)成進行篩選，以鑒定其遺傳構(gòu)成與其父本祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的植物，并且鑒定其遺傳構(gòu)成與其父本祖母的遺傳構(gòu)成基本上相同的另一植物。
24.根據(jù)權(quán)利要求21-23中任一項的方法，其中其遺傳構(gòu)成與其父本祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的植物與其遺傳構(gòu)成和其父本祖母的遺傳構(gòu)成基本上相同的另一植物雜交，以便獲得其遺傳構(gòu)成與其自身祖父的遺傳構(gòu)成基本上相同的后代植物。
【文檔編號】A01H1/04GK103957698SQ201280047468
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2012年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月29日
【發(fā)明者】C·M·P·范鄧恩 申請人:瑞克斯旺種苗集團公司