用于檢測雞體尺性狀的試劑盒及雞的分子育種方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測雞體尺性狀的試劑盒，同時(shí)還涉及一種基于雞 miRNA-1658基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著社會經(jīng)濟(jì)的迅速發(fā)展和人們生活水平的提高，市場對肉質(zhì)的需求整體上從以 前的數(shù)量要求轉(zhuǎn)向了對質(zhì)量風(fēng)味的追求。生長性狀、體尺性狀、肉質(zhì)性狀和屠體性狀是當(dāng)今 家禽工業(yè)最關(guān)注的經(jīng)濟(jì)性狀。大多數(shù)的經(jīng)濟(jì)性狀屬于數(shù)量性狀，主要是由為數(shù)眾多的微效 基因決定的，這些基因同時(shí)具有加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和上位效應(yīng)，復(fù)雜性狀的遺傳基礎(chǔ)是由 影響該表型的遺傳因素和環(huán)境因素以及它們之間的相互作用共同決定的。國內(nèi)優(yōu)質(zhì)地方雞 普遍存在生長速度緩慢的問題，從而影響了經(jīng)濟(jì)效益。因此，多年來研宄人員試圖通過大量 的試驗(yàn)尋找與雞的相關(guān)經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的候選基因，為家禽分子選種育種方面提供輔助標(biāo)記 選擇。
[0003]應(yīng)用分子標(biāo)記的現(xiàn)代育種技術(shù)是加快良種選育和提高種群遺傳品質(zhì)的重要途徑。 應(yīng)用分子標(biāo)記育種首先是在DNA水平上篩查和檢測與雞經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，其 次是建立其基因多態(tài)性的快速檢測方法，然后實(shí)現(xiàn)遺傳標(biāo)記輔助選擇和實(shí)現(xiàn)早期診斷選 擇。
[0004] 單核苷酸多態(tài)（Singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因組水平上由 于單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP可以在DNA、RNA和蛋白質(zhì)水平影響基 因的功能，是人類可遺傳變異最常見的一種，占已知多態(tài)性的90 %以上。對基因產(chǎn)物有影響 的SNP的功能進(jìn)行分析，其意義十分重大。SNP多樣性與經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析一直是畜禽遺 傳學(xué)研宄的熱點(diǎn)。隨著miRNA的發(fā)現(xiàn)及其研宄的深入，研宄者發(fā)現(xiàn)miRNA不僅參與了動物 復(fù)雜性狀表型形成的分子調(diào)控過程，而且其SNP變化還可能導(dǎo)致miRNA功能異常，進(jìn)而引起 生物表型性狀的變異。miRNA相關(guān)多態(tài)的形成機(jī)制包括插入、缺失、易位、擴(kuò)增以及堿基替 換。miRNA的多態(tài)性是影響miRNA調(diào)節(jié)功能的重要因素。單個(gè)miRNA表達(dá)異常時(shí)，可能影響 數(shù)百種靶基因的表達(dá)，當(dāng)其中某些關(guān)鍵蛋白表達(dá)量降低時(shí)，會導(dǎo)致機(jī)體生理功能異常和疾 病發(fā)生。研宄發(fā)現(xiàn)，發(fā)生在miRNA初級產(chǎn)物、前體及成熟體上的多態(tài)性會潛在的影響數(shù)以百 計(jì)基因的表達(dá)和通路，從而廣泛影響miRNA的功能。
[0005]SNP多態(tài)性的檢測方法，最常見的有單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)（SSCP)、PCR-RFLP和直接 測序技術(shù)等。但SSCP操作繁瑣、耗時(shí)長，影響因素多，且實(shí)驗(yàn)過程中存在假陰性問題，所以 并非理想的SNP檢測手段；直接測序技術(shù)成本較高。許多研宄運(yùn)用了PCR-RFLP方法或PCR 與聚丙烯酰胺電泳檢測相結(jié)合的方法。
[0006]MassARRAY系統(tǒng)進(jìn)行SNP分型的基本原理是以基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì) 譜（MALDI-TOFMS)技術(shù)結(jié)合單引物延伸反應(yīng)，通過對核酸片段分子量直接鑒定而實(shí)現(xiàn)的。 引物序列經(jīng)合成、稀釋后首先進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，以增加單堿基延伸反應(yīng)的模板，然后再進(jìn) 行單堿基延伸反應(yīng)，單堿基延伸反應(yīng)中所用為ddNTP，因此延伸一個(gè)堿基后反應(yīng)自動終止。 最后將延伸產(chǎn)物利用全自動點(diǎn)樣機(jī)加到芯片上，通過MassARRAY進(jìn)行質(zhì)譜分型。MASSARRAY平臺檢測SNP具有以下優(yōu)勢：準(zhǔn)確可靠，直接對分子量進(jìn)行檢測，不涉及熒光標(biāo)記、凝膠電 泳等，就能檢測一個(gè)堿基的差異，準(zhǔn)確性高，機(jī)器本身出錯(cuò)的概率非常低，無需再次驗(yàn)證，也 無需設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)學(xué)重復(fù)。通量較高，可以適用于對幾個(gè)到幾百個(gè)SNP位點(diǎn)的檢測。檢測時(shí)間 短，利用質(zhì)譜檢測在40min內(nèi)就可以完成對380個(gè)樣本的檢測，并且實(shí)時(shí)顯示檢測結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測雞體尺性狀的試劑盒。
[0008] 同時(shí)，本發(fā)明還提供一種基于雞miRNA-1658基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方 法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0010] 用于檢測雞體尺性狀的試劑盒，包括：
[0011]上游引物F PRimer :5' -ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3'（如SEQ ID NO. 1 所示），
[0012]下游引物R PRimer :5' -ACGITGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3,（如SEQ ID NO. 2 所示）；
[0013]單堿基延伸引物：5'-CATCAACACCAACCCA-3'（如SEQID NO. 3所示）。
[0014] 上述試劑盒還可以包括：10Xbuffer、Mg2+、dNTP、Hotstar、iPLEX終止反應(yīng)Mix、單 堿基延伸酶、SAP buffer、SAP酶、ddd H20及DNA Marker等。試劑盒中各組分的添加量可 適當(dāng)選取，如大于10次的用量。
[0015] 一種基于雞miRNA-1658基因單核苷酸多態(tài)性的分子育種方法，包括以下步驟：
[0016] 1)提取雞總DNA，加入引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0017] 2)加入單堿基延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，得反應(yīng)產(chǎn)物；
[0018]3)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)飛行質(zhì)譜檢測后，選留GG基因型的公母雞個(gè)體，建立目標(biāo)雞群。
[0019] 步驟1)中引物如下：
[0020]上游引物F PRimer : 5 ' -ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3'，
[0021]下游引物R PRimer :5' -ACGITGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3'；
[0022] 步驟2)中單堿基延伸引物為：5'-CATCAACACCAACCCA-3'。
[0023] 步驟1)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：總計(jì)5. 0 y 1 ;10Xbuffer 0. 5 y 1，25mM Mg2+0. 4y1,25mM dNTP 0. 1y1,5U/y1 Hotstar 0. 2y1,lOpmol/y1 F Primer/R Primer 各0? 5 y 1，100ng/ y 1總DNA 1. 0 y 1，ddd H20 1. 8 y 1。
[0024] 步驟1)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性95°C2min;95°C30s;56°C30s; 72°C60s，45 個(gè)循環(huán)；72°C5min;25°C保溫。
[0025] 步驟1)中PCR擴(kuò)增后一般需加入蝦堿性磷酸酶（SAP)去除剩余的dNTP，SAP酶消 化為本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)。在本發(fā)明中，SAP酶消化體系為：總計(jì)2. 0y1;SAPbuffer0. 17y1， 1.7U/ylSAP酶0.3yl，dddH20 1.53yl;SAP酶消化程序?yàn)椋?7°C40min，85°C5min，25°C 保溫。
[0026] 步驟2)中單堿基延伸反應(yīng)的反應(yīng)體系為：總計(jì)2. 0y1;10Xbuffer0. 2y1， 反應(yīng)濃度為1XiPLEX終止反應(yīng)Mix0. 2y1，7yM單堿基延伸引物0. 94y1，反應(yīng)濃度為 lXiPLEX單堿基延伸酶0.041yl，dddH20 0.619yl。
[0027] 步驟2)中單堿基延伸反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94°C30s;40個(gè)循環(huán)：94°C5s， 52°C5s，80°C5sX5 個(gè)內(nèi)部循環(huán)，72°C3min;25°C保溫。
[0028] 步驟3)中反應(yīng)產(chǎn)物先用樹脂脫鹽，再點(diǎn)樣于芯片，芯片用基質(zhì)輔助激光解吸附電 離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：
[0030] 本發(fā)明采用MassARRAY系統(tǒng)基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合單 引物延伸反應(yīng)，對固始雞和安卡雞&代資源群樣本進(jìn)行!^1?^-1658〇'816681031 0/6)單個(gè)SNP位點(diǎn)基因分型檢測，并與F2代資源群體尺性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明雞miRNA-1658 基因SNP單核苷酸多態(tài)性與雞體尺性狀顯著關(guān)聯(lián)，GG基因型有利于4周齡雞的胸寬、骨盆 寬和體斜長顯著增大，將其作為4周齡雞體尺性狀的輔助選擇和分子遺傳育種標(biāo)記，可快 速建立遺傳資源優(yōu)良的雞群。
【附圖說明】
[0031] 圖1為雞miRNA-1658基因的SNP測序圖；
[0032] 圖2為SNP位點(diǎn)不同基因型的特征質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下述實(shí)施例僅對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0034] 實(shí)施例1
[0035] 本實(shí)施例中用于檢測雞體尺性狀的試劑盒，包括：
[0036] lOpmol/ y 1 上游引物FPRimer :5' -ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3'，
[0037]lOpmol/ y 1 下游引物RPRimer :5' -ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3'；
[0038] 7yM單堿基延伸引物：5 '-CATCAACACCAACCCA-3'。
[0039] 實(shí)施例2
[0040] 本實(shí)施例中用于檢測雞體尺性狀的試劑盒，除包含如下引物外，還包括： 10Xbuffer、25mM Mg2+、25mM dNTP、5U/yl Hotstar、反應(yīng)濃度為lXiPLEX單堿基延伸酶、 SAP buffer、1. 7U/ y 1 SAP酶、ddd H20及DNA Marker ;
[0041] lOpmol/ y 1 上游引物FPRimer :5' -ACGTTGGATGTTCTGCCATACCAGTGTGTG-3'，
[0042]lOpmol/ y 1 下游引物RPRimer:5' -ACGTTGGATGACTCCTCCAGCTGCTGCTTC-3'；
[0043] 7yM單堿基延伸引物：5 '-CATCAACACCAACCCA-3'。
[0044] 試驗(yàn)例
[0045] 一、雞miRNA-1658基因單核苷酸多態(tài)性的檢測，包括以下步驟：
[0046] 1、動物材料：固始雞和安卡雞。
[0047] 固始雞屬于我國黃雞類型的一種優(yōu)良地方品種，它以固始縣為中心，在非凡的生 態(tài)環(huán)境和飼養(yǎng)條件下，經(jīng)過長期閉鎖繁衍而自然形成。固始雞是蛋肉兼用型雞種，具有優(yōu)良 的性狀：一是耐粗飼，抗病力強(qiáng)，適宜野外放牧散養(yǎng)；二是肉質(zhì)細(xì)嫩，肉味鮮美，湯汁醇厚， 營養(yǎng)豐富，具有較強(qiáng)的滋補(bǔ)功效；三是母雞產(chǎn)蛋較多，蛋大，蛋清較稠，蛋黃色深，蛋殼厚，耐 貯運(yùn)。
[0048] 安卡肉雞是當(dāng)今世界優(yōu)良的肉用雞種之一，也是目前國內(nèi)生長速度最快的紅黃羽 肉雞，具有適應(yīng)性強(qiáng)，耐應(yīng)激，長速快，飼料報(bào)酬高等特點(diǎn)。
[0049] 2、動物