本發(fā)明屬于植物生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。具體地，本發(fā)明涉及一種增加水稻莖稈粗度、每穗穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻是重要的糧食作物之一，養(yǎng)活了全球大約二分之一的人口。上個(gè)世紀(jì)60年代，半矮化育種的推廣使得全世界水稻產(chǎn)量得到顯著的提高。近30年以來(lái)，雖然水稻雜種優(yōu)勢(shì)利用及其新品種培育在水稻產(chǎn)量提升方面取得了較大的進(jìn)展，但是產(chǎn)量的提高幅度依然不能滿(mǎn)足日益增長(zhǎng)人口對(duì)糧食的需求。預(yù)計(jì)2050年人口數(shù)量將達(dá)到89億，這意味著2050年糧食生產(chǎn)需要提高50％。面對(duì)人口急劇增長(zhǎng)，環(huán)境不斷惡化，可耕地面積不斷減少的嚴(yán)峻形勢(shì)，如何有效地提高水稻單產(chǎn)已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一項(xiàng)非常重要的任務(wù)。水稻產(chǎn)量主要由單位面積上的有效穗數(shù)、每穗穗粒數(shù)和千粒重等因素構(gòu)成。分蘗數(shù)決定了有效穗數(shù)，分蘗是影響水稻穗數(shù)多少并進(jìn)而影響其產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一；一次枝梗、二次枝梗與結(jié)實(shí)率決定了每穗穗粒數(shù)；籽粒大小(長(zhǎng)、寬、厚)決定了千粒重。同時(shí)，抽穗期，抗倒伏能力，抗病耐逆特性也影響著水稻產(chǎn)量。水稻穗型是指水稻穗的大小和生長(zhǎng)姿態(tài)，是水稻株型的重要組成部分穗粒數(shù)與穗發(fā)育密切相關(guān)，小花數(shù)決定了每穗穗粒數(shù)；千粒重與谷粒大小和谷粒成熟過(guò)程中灌漿充實(shí)度密切相關(guān)，這些農(nóng)藝性狀都與植株產(chǎn)量緊密相關(guān)，并且這些重要農(nóng)藝性狀如株高、分蘗數(shù)、分蘗角度、穗部形態(tài)、粒型等都是典型的復(fù)雜農(nóng)藝性狀，受多個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)(quantitativetraitlocus，qtls)和環(huán)境因子控制。在水稻育種中，理想株型塑造對(duì)水稻品種的遺傳改良發(fā)揮了巨大的作用。傳統(tǒng)的水稻株高較高，莖稈柔弱，對(duì)氮肥耐受力低，易倒伏，產(chǎn)量低；半矮桿基因sd1的引入，使株高顯著降低，莖稈增粗，分蘗數(shù)增多，耐肥與抗倒伏能力提高，因此產(chǎn)量得到顯著提高。為了進(jìn)一步提高水稻單產(chǎn)，上個(gè)世紀(jì)80年代國(guó)際水稻所(internationalriceresearchinstitute，irri)提出了理想株型(newplanttype)育種計(jì)劃，即育成少蘗、大穗、莖稈粗壯的理想株型水稻。與此同時(shí)，我國(guó)育種家提出了北方粳型超級(jí)稻的理論，指出直立穗育種是繼半矮化育種后適應(yīng)超高產(chǎn)的又一重要的育種形態(tài)進(jìn)化選擇，并育成了以“遼粳5號(hào)”和“沈農(nóng)265”等為代表的一批高產(chǎn)水稻新品種，顯著地提高了我國(guó)粳稻的單產(chǎn)水平。前期，本實(shí)驗(yàn)室從高產(chǎn)粳稻品種“沈農(nóng)265”中克隆了控制該直立穗型性狀的基因dep1，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)異等位基因dep1-1能夠增加每穗穗粒數(shù)并提高產(chǎn)量，并已在我國(guó)的“超級(jí)稻”育種中起到了至關(guān)重要的作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了進(jìn)一步解析水稻高產(chǎn)株型的分子調(diào)控機(jī)制，我們利用國(guó)際水稻所培育的具有理想株型特征的水稻親本ir66167-27-5-1-6，通過(guò)qtl定位和圖位克隆技術(shù)分離并克隆了控制該理想株型和產(chǎn)量的關(guān)鍵基因npt1。在此基礎(chǔ)上，綜合利用了遺傳學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)等多種手段，深入研究了npt1基因的生物學(xué)功能及其調(diào)控水稻產(chǎn)量的分子基礎(chǔ)，為水稻高產(chǎn)育種提供相應(yīng)的理論依據(jù)，也為水稻分子設(shè)計(jì)育種提供了重要基因資源。本發(fā)明涉及一種控制水稻莖稈粗度、分蘗數(shù)、每穗穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量的理想株型基因npt1及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及npt1在提高農(nóng)作物(例如，水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等)的分蘗數(shù)、每穗穗粒數(shù)、千粒重、產(chǎn)量、莖稈粗度和耐倒伏能力方面的新功能和應(yīng)用。更具體地，本發(fā)明涉及的npt1及其同源基因來(lái)源于水稻、小麥、大麥、玉米、高粱等農(nóng)作物。本發(fā)明人利用一個(gè)來(lái)自國(guó)際水稻研究所的少蘗、大穗且莖稈粗壯的水稻親本ir66167-27-5-1-6和我國(guó)粳稻品種春江06雜交所構(gòu)建的重組自交系群體，發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)株系ril52表現(xiàn)出了理想株型特征，包括莖稈粗度增加，分蘗數(shù)目減少，單穗粒數(shù)和產(chǎn)量顯著增加等性狀。對(duì)ril52與秈稻品種浙輻802雜交所構(gòu)建的f2群體進(jìn)行了完全隨機(jī)的田間實(shí)驗(yàn)，分別考察了分蘗數(shù)、每穗穗粒數(shù)和莖稈粗度這3個(gè)性狀，結(jié)合各性狀的表型值和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，qtl分析發(fā)現(xiàn)在8號(hào)染色體長(zhǎng)臂上存在一個(gè)同時(shí)控制莖稈粗度、穗粒數(shù)及分蘗數(shù)的主效qtl，將其命名為qnpt1。隨后利用ril52與浙輻802構(gòu)建的bc2f2和bc2f3群體，將qnpt1精細(xì)定位到水稻第八號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端4.1kbp的物理范圍內(nèi)，該區(qū)段僅有一個(gè)預(yù)測(cè)的候選基因。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)ir66167-27-5-1-6和中花11雜交，并對(duì)目標(biāo)性狀構(gòu)建了中花11背景(zh11)近等基因系，發(fā)現(xiàn)zh11-npt1莖稈更為粗壯，分蘗數(shù)略微減少，株高基本不變，但每穗穗粒數(shù)和千粒重都有明顯增加，單株產(chǎn)量顯著增加。水稻npt1編碼一個(gè)去泛素化酶(osotub1)，是人類(lèi)otub1在水稻中的同源基因，因此也將該基因稱(chēng)為osotub1基因，在本發(fā)明中這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)縮寫(xiě)可互換使用。研究發(fā)現(xiàn)水稻osotub1(seqidno：15，即水稻ntp1基因編碼的蛋白，在本發(fā)明中也稱(chēng)為npt1蛋白，這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)也可以互換使用)具有催化k48位和k63泛素鏈解聚的活性。本發(fā)明人對(duì)osotub1蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)osotub1-gfp融合蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中。另外，構(gòu)建了osotub1自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的posotub1：：gus植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株不同發(fā)育時(shí)期的器官和組織進(jìn)行g(shù)us染色發(fā)現(xiàn)，該基因在水稻的整個(gè)發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)，尤其在維管束系統(tǒng)和分生組織中顯著高表達(dá)。通過(guò)轉(zhuǎn)基因的方法，驗(yàn)證了osotub1基因功能。發(fā)現(xiàn)該基因適度降低表達(dá)或者失去功能突變均會(huì)導(dǎo)致分蘗數(shù)減少，但能增加莖稈粗度、每穗穗粒數(shù)、千粒重，進(jìn)而顯著增加產(chǎn)量。相反，過(guò)量表達(dá)該基因則會(huì)產(chǎn)生類(lèi)病斑表型并引發(fā)細(xì)胞死亡。通過(guò)酵母雙雜交篩選互作蛋白發(fā)現(xiàn)osotub1蛋白能與泛素結(jié)合酶osubc13相互作用，并抑制其功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)osotub1與水稻株型和產(chǎn)量正調(diào)控因子osspl14蛋白互作，并通過(guò)影響osspl14蛋白穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控水稻株型及產(chǎn)量。同時(shí)，本發(fā)明人從小麥、大麥、玉米、高粱、小鼠及人類(lèi)中分別克隆到了osotub1同源基因的cdna序列，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因研究證明了它們具有與osotub1類(lèi)似的控制水稻莖稈粗度、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量的生物學(xué)功能。將優(yōu)異等位基因npt1導(dǎo)入高產(chǎn)粳稻品種武運(yùn)粳7號(hào)中，多年多點(diǎn)田間測(cè)產(chǎn)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)npt1和dep1-1聚合能在主栽品種高產(chǎn)基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)水稻產(chǎn)量進(jìn)一步提升。本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)可調(diào)控莖稈粗度、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量的理想株型基因npt1，為水稻高產(chǎn)分子設(shè)計(jì)育種提供具有重要育種利用價(jià)值的新基因資源。因此，本發(fā)明提供下述：在第一方面，本發(fā)明提供一種水稻理想株型基因npt1及其等位基因npt1，其中npt1能夠增加水稻的莖稈粗度、每穗穗粒數(shù)、千粒重及單株產(chǎn)量。這兩種基因涉及到的核苷酸序列包括：(1)seqidnos：1-4中的任何一個(gè)所示的核苷酸序列；(2)與(1)的核苷酸序列的互補(bǔ)序列在中等嚴(yán)格條件、優(yōu)選高嚴(yán)格雜交條件下雜交的核苷酸序列；(3)與(1)的核苷酸序列具有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的核苷酸序列；(4)與(1)的核苷酸序列編碼相同氨基酸序列的蛋白質(zhì)、但因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性而在序列上不同的核苷酸序列；(5)編碼如下氨基酸序列之一的核苷酸序列：seqidno：15所示的氨基酸序列，或者，由于一或多個(gè)(例如1-25個(gè)、1-20個(gè)，1-15個(gè)，1-10個(gè)，1-5個(gè)，1-3個(gè))氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與seqidno：13所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，或者，與seqidno：15所示的氨基酸序列具有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、尤其是至少95％或98％同一性的氨基酸序列；(6)(1)-(6)任何一個(gè)的核苷酸序列的活性片段；(7)(1)-(6)任何一個(gè)的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。在第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述的基因及其等位基因的啟動(dòng)子序列，其如seqidno：5或6所示。表1.seqidnos：1-6的序列名稱(chēng)及其來(lái)源seqidno：名稱(chēng)來(lái)源1npt1cdna序列浙輻8022npt1cdna序列ir66167-27-5-1-63npt1gdna序列浙輻8024npt1gdna序列ir66167-27-5-1-65npt1啟動(dòng)子序列浙輻8026npt1啟動(dòng)子序列ir66167-27-5-1-6在第三方面，本發(fā)明提供第一方面的水稻npt1基因的同源基因，所述同源基因來(lái)源于烏拉爾圖小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花或番茄，其編碼seqidnos：16-23中任一個(gè)所示的氨基酸序列。具體地，所述同源基因包含seqidnos：7-14中任一個(gè)所示的核苷酸序列。表2.水稻npt1基因的同源基因的核苷酸序列seqidno：名稱(chēng)來(lái)源7tunpt1cdna序列烏拉爾圖小麥8hvnpt1cdna序列大麥9zmnpt1cdna序列玉米10sbnpt1cdna序列高粱11gmnpt1cdna序列大豆12bnnpt1cdna序列油菜13ghnpt1cdna序列棉花14slnpt1cdna序列番茄在第四方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽(也稱(chēng)蛋白)，其包含從如下組氨基酸序列中選擇的氨基酸序列：(1)seqidnos：15-23中任何一個(gè)所示的氨基酸序列，(2)由于一個(gè)或多個(gè)(例如1-25個(gè)、1-20個(gè)，1-15個(gè)，1-10個(gè)，1-5個(gè)，1-3個(gè))氨基酸殘基的替代、缺失和/或插入而與seqidno：15-23中任何一個(gè)所示的氨基酸序列不同的氨基酸序列，(3)與seqidnos：15-23中任何一個(gè)所示的氨基酸序列具有至少70％、優(yōu)選至少80％、更優(yōu)選至少90％、尤其是至少95％或98％或99％同一性的氨基酸序列，(4)(1)或(2)或(3)所述氨基酸序列的活性片段，(5)本發(fā)明涉及到的多核苷酸分子編碼的氨基酸序列。其中，osnpt1編碼otub1在水稻中的同源蛋白，因此對(duì)其編碼蛋白命名為osotub1，蛋白序列及其同源蛋白的氨基酸序列由seqidnos：15-23所示，具體參見(jiàn)下表3。表3.npt1蛋白序列及其變體蛋白的名稱(chēng)及其來(lái)源在第五方面，本發(fā)明提供一種重組構(gòu)建體，其含有本發(fā)明第一至第三方面中所述的npt1或等位基因npt1相關(guān)多核苷酸。其中所述構(gòu)建體所用的載體是克隆載體或者用于表達(dá)所述多核苷酸的表達(dá)載體。在第六方面，本發(fā)明提供一種重組宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第五方面所述的重組構(gòu)建體，或在其基因組中整合有本發(fā)明第一至第三方面中所述的npt1或等位基因npt1多核苷酸。所述宿主細(xì)胞可以選自植物細(xì)胞或者微生物細(xì)胞，例如大腸桿菌細(xì)胞，農(nóng)桿菌細(xì)胞，優(yōu)選植物細(xì)胞，最優(yōu)選水稻細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是分離的、離體的、培養(yǎng)的、或者是植物的一部分。在第七方面，本發(fā)明提供第一至第四方面的多核苷酸或多肽或第五方面的重組構(gòu)建體或第六方面的重組宿主細(xì)胞在改良水稻植物性狀中的用途。本發(fā)明還涉及改良水稻植物性狀的方法，該方法包括制備含有第一至第四方面的多核苷酸或第五方面的構(gòu)建體的水稻植株，例如，所述方法可以包括從第六方面的重組植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植株，或用第六方面的重組微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)染水稻植株得到轉(zhuǎn)基因植株。所述性狀包括但不限于：莖稈粗度、單穗粒數(shù)及產(chǎn)量等。本發(fā)明還提供一種培育產(chǎn)量提高的水稻的方法，該方法包括：用第七方面的重組宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染水稻植株得到npt1基因表達(dá)水平下降或者氨基酸序列改變導(dǎo)致蛋白功能下降的轉(zhuǎn)基因水稻植株，具體是通過(guò)rnai技術(shù)降低npt1基因表達(dá)水平或者通過(guò)crispr/cas9及創(chuàng)制npt1基因表達(dá)水平下降或者npt1蛋白失去或者功能減弱的轉(zhuǎn)基因水稻。在第八方面中，本發(fā)明提供所述npt1基因的用途，其用于增加作物莖稈粗度、每穗穗粒數(shù)、千粒重，進(jìn)而提高作物的產(chǎn)量。在第九方面，本發(fā)明涉及一種培育產(chǎn)量提高的水稻的方法。該方法包括：從第六發(fā)明的包含npt1等位基因的重組水稻宿主細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因水稻植株，或是通過(guò)降低npt1基因的表達(dá)水平，或是改變npt1蛋白生物學(xué)功能，或者通過(guò)tilling技術(shù)，即就是定向誘導(dǎo)基因組突變技術(shù)獲得npt1基因表達(dá)水平下降或者npt1蛋白失去或者功能減弱的水稻或者將包含npt1等位基因的水稻植株與另一植株雜交，優(yōu)選出分蘗數(shù)略減少、莖稈增粗、每穗穗粒數(shù)和千粒重增加，進(jìn)而產(chǎn)量增加的植株。本發(fā)明技術(shù)人員應(yīng)該理解，基于本發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，即，減少npt1基因的表達(dá)量，或者使其表達(dá)的npt1蛋白的功能減弱，都可以起到增加水稻分蘗數(shù)、莖稈粗度、每穗穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量的作用，能夠通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)募夹g(shù)減少npt1基因的表達(dá)量，或者使其表達(dá)的npt1蛋白的功能減弱，進(jìn)而在此基礎(chǔ)上進(jìn)行水稻育種。在第十方面，本發(fā)明通過(guò)酵母雙雜交篩選互作蛋白發(fā)現(xiàn)osotub1蛋白(即，水稻npt1蛋白)能與泛素結(jié)合酶osubc13相互作用，并抑制其功能。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)osubc13過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株可以增加產(chǎn)量，這表明可以利用osubc13基因進(jìn)行水稻育種。因此，本發(fā)明涉及一種通過(guò)過(guò)量表達(dá)osubc13培育每穗穗粒數(shù)和產(chǎn)量增加的水稻的方法，該方法包括用含有osubc13的重組構(gòu)建體的重組宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染水稻植株獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株，利用osubc13編碼的水稻泛素結(jié)合酶osubc13與npt1蛋白的作用，所得到的轉(zhuǎn)基因水稻植株中npt1活性受到影響，因此增加每穗穗粒數(shù)和產(chǎn)量。其中所述細(xì)胞為微生物細(xì)胞，所述微生物細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌或農(nóng)桿菌細(xì)胞。其作用原理是osubc13編碼水稻泛素結(jié)合酶osubc13，該蛋白直接與npt1蛋白互作，酶活性受到npt1蛋白的抑制，因此過(guò)量表達(dá)osubc13轉(zhuǎn)基因水稻類(lèi)似npt1蛋白活性下降水稻，能夠增加水稻穗粒數(shù)和產(chǎn)量。其中，osubc13基因編碼的蛋白序列如seqidno：36所示，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，osubc13基因的核苷酸序列如seqidno：35所示。第十一方面，通過(guò)crispr/cas9基因編輯技術(shù)敲除npt1或者同源基因tunpt1、hvnpt1、zmnpt1、sbnpt1、gmnpt1、bnnpt1、ghnpt1、slnpt1所產(chǎn)生產(chǎn)量增加的作物。以上所述作物優(yōu)選是農(nóng)作物，例如水稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花、番茄等，但不僅限于這些農(nóng)作物。第十二方面，一種培育高產(chǎn)水稻品種的分子標(biāo)記輔助選擇聚合育種方法，該方法包括使用包含優(yōu)異等位基因npt1的水稻親本與包含dep1-1基因的另一水稻親本雜交，在后代中根據(jù)分子標(biāo)記選育出含有npt1和dep1基因聚合的品系或品種。其中dep1-1基因編碼seqidno：34所示的氨基酸序列(即dep1蛋白)，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，dep1-1基因的核苷酸序如seqidno：33所示。第十三方面，本發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)osotub1與水稻株型和產(chǎn)量正調(diào)控因子osspl14蛋白互作，并通過(guò)影響osspl14蛋白穩(wěn)定性來(lái)調(diào)控水稻株型及產(chǎn)量。因此，本發(fā)明提供一種通過(guò)增強(qiáng)水稻株型調(diào)控蛋白o(hù)sspl14培育每穗穗粒數(shù)和產(chǎn)量增加的水稻的方法，該方法包括用含有npt1基因的重組構(gòu)建體及重組宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化水稻植株獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株，由此獲得osspl14功能增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植株，其中所述細(xì)胞為微生物細(xì)胞，所述微生物細(xì)胞優(yōu)選為大腸桿菌或農(nóng)桿菌細(xì)胞。其作用原理是npt1與osspl14蛋白直接相互作用，遺傳學(xué)證明osspl14位于npt1下游，其功能受到npt1的抑制。其中水稻osspl14蛋白序列如seqidno：38所示，水稻osspl14cdna序列如seqidno：37所示。附圖簡(jiǎn)述圖1.控制水稻理想株型株qnpt1的qtl定位。(a)春江06與國(guó)際水稻所理想株型水稻ir66167-27-5-1-6雜交并通過(guò)單粒傳法獲得重組自交系，其中ril52表現(xiàn)出理想株型的特征，比例尺，20cm；(b)穗部表型比較，比例尺，5cm；(c)分蘗數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(d)穗粒數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(e)倒一節(jié)莖稈中部粗度統(tǒng)計(jì)分析；(f)控制水稻莖稈粗度，穗粒數(shù)，分蘗數(shù)主效qtl分析。圖2.利用圖位克隆方法分離和克隆qnpt1。(a)將qnpt1基因精細(xì)定位在4.1kb的區(qū)間內(nèi)，其候選基因編碼一個(gè)去泛素化酶，是人類(lèi)otub1基因在水稻中的同源基因；(b)卡位區(qū)間單倍型分析。圖3.osotub1功能驗(yàn)證。(a)水稻株型比較，比例尺，20cm；(b)crispr/cas9方法創(chuàng)制水稻osotub1-c1突變體，綠色部分是sgrna靶序列，紅色部分是pam序列；(c)抽穗期比較分析；(d)株高比較分析；(e)倒一節(jié)直徑統(tǒng)計(jì)分析；(f)分蘗數(shù)比較分析；(g)穗長(zhǎng)度比較分析；(h)每穗一級(jí)枝梗數(shù)目比較分析；(i)每穗二級(jí)枝梗數(shù)目比較分析；(j)每穗穗粒數(shù)比較分析；(k)千粒重比較分析；(l)單株產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)分析。圖4.實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)osotub1基因在水稻不同組織中的表達(dá)水平。r：根尖；c：莖稈；lb：葉片；ls：葉鞘；sam：莖尖分生組織；yp0.2∶0.2厘米幼穗；yp6：06厘米穗；yp12：12厘米穗。圖5.在zh11背景下posotub1：：gus轉(zhuǎn)基因植株gus染色結(jié)果。(a)osotub1在胚芽鞘和根部表達(dá)，比例尺，1cm；(b)根成熟區(qū)橫切顯示osotub1在中柱鞘和韌皮部表達(dá)，比例尺，200μm；(c)osotub1在根尖靜止中心顯著高表達(dá)，比例尺，200μm；(d)倒一節(jié)莖稈橫切顯示osotub1在莖稈維管束表達(dá)，比例尺，100μm；(e)不同發(fā)育時(shí)期幼穗染色，發(fā)現(xiàn)在幼穗時(shí)期osotub1表達(dá)最強(qiáng)，穗發(fā)育后期逐漸降低，比例尺，1cm；(f)osotub1在發(fā)育中的穎殼中表達(dá)，比例尺，1mm。圖6.osotub1-gfp融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。(a)osotub1-gfp融合蛋白在根尖伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞中定位，比例尺，20μm；(b)osotub1-gfp融合蛋白在10天苗葉鞘解離原生質(zhì)體定位，比例尺，10μm。圖7.osotub1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表型分析。(a)灌漿后期株型比較。osotub1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出不同程度的矮化、分蘗減少、葉片有類(lèi)病斑等表型；比例尺，20cm；(b)穗部形態(tài)比較。osotub1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料表現(xiàn)出不同程度的穗變小，枝梗減少；比例尺，5cm；(c)葉片表型比較分析。osotub1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系oe-8#和oe-13#在抽穗前期葉片出現(xiàn)類(lèi)病斑；比例尺，2cm；(d)臺(tái)盼藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)osotub1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系oe-8#和oe-13#出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞程序性死亡；(e)過(guò)量表達(dá)株系中osotub1基因表達(dá)量分析；(f)osotub1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株株高表現(xiàn)出不同程度降低；(g)osotub1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株分蘗數(shù)表現(xiàn)出不同程度減少；(h)osotub1過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株每穗穗粒數(shù)表現(xiàn)出不同程度減少。圖8.水稻osotub1蛋白具有k48位和k63位泛素鏈解聚活性。圖9.osotub1與osubc13互作調(diào)控水稻株型和產(chǎn)量。(a)酵母雙雜交驗(yàn)證osotub1與osubc13蛋白互作；(b)pull-down實(shí)驗(yàn)分析osotub1與osubc13蛋白互作；(c)bifc實(shí)驗(yàn)分析osotub1與osubc13蛋白互作，比例尺，10μm；(d)在zh11背景下，osubc13轉(zhuǎn)基因植株的株型比較，比例尺，20cm；(e)倒一節(jié)莖稈粗度比較，比例尺，0.5mm；(f)穗型比較，比例尺，5cm；(g)粒型比較，比例尺，2mm；(h)osubc13基因表達(dá)水平分析；(i)分蘗數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(j)每穗穗粒數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(k)千粒重統(tǒng)計(jì)分析；(l)倒一節(jié)粗度統(tǒng)計(jì)分析。圖10.osspl14蛋白的sbp結(jié)構(gòu)域參與osotub1蛋白互作。(a)酵母雙雜交驗(yàn)證osotub1δn1-80與osspl14δn21-100相互作用；(b)osspl14蛋白缺失突變的示意圖；(c)bifc實(shí)驗(yàn)分析osspl14蛋白的不同結(jié)構(gòu)域與osotub1蛋白互作，比例尺，10μm。圖11.osotub-osspl14分子模塊調(diào)控水稻株型。(a)bifc實(shí)驗(yàn)證明osotub1與osspl14的sbp結(jié)構(gòu)域相互作用；(b)co-ip實(shí)驗(yàn)證明osotub1與osspl14蛋白互作；(c)在nil-npt1背景下，降低osspl14表達(dá)，可導(dǎo)致其分蘗數(shù)增加和穗粒數(shù)減少等性狀，類(lèi)似zh11野生型表型；而zh11-osspl14wfp材料表型類(lèi)似于nil-npt1，比例尺，20cm；(d)在nil-npt1背景下，降低osspl14基因表達(dá)，可導(dǎo)致每穗穗粒數(shù)降低，而zh11-osspl14wfp材料表型類(lèi)似于nil-npt1，比例尺，5cm；(e)osspl14基因表達(dá)水平分析；(f)分蘗數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(g)每穗穗粒數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(h)倒一節(jié)莖稈粗度統(tǒng)計(jì)分析。圖12.otub1及其同源基因的氨基酸序列比對(duì)分析。圖13.過(guò)量表達(dá)玉米、大麥、小鼠及人類(lèi)otub1同源基因均能互補(bǔ)zh11-npt1的突變表型。(a)灌漿后期株型比較，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的分蘗增加，莖稈變細(xì)，比例尺，20cm；(b)穗部形態(tài)比較，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的枝梗減少，每穗穗粒數(shù)減少，比例尺，5cm；(c)osotub1基因表達(dá)水平分析；(d)分蘗數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(e)每穗穗粒數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(f)倒一節(jié)莖稈中部直徑統(tǒng)計(jì)分析。圖14.優(yōu)異等位基因npt1和dep1-1聚合育種提升水稻產(chǎn)量。(a)灌漿后期株型比較，比例尺，20cm；(b)穗部形態(tài)比較，比例尺，5cm；(c)粒型比較，比例尺，2mm；(d)倒一節(jié)莖稈粗度比較，比例尺，0.5mm；(e)維管束數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析；(f)抽穗期統(tǒng)計(jì)分析；(g)株高統(tǒng)計(jì)分析；(h)分蘗數(shù)統(tǒng)計(jì)分析千粒重統(tǒng)計(jì)分析；(i)每穗穗粒數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(j)千粒重統(tǒng)計(jì)分析；(k)產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)分析。圖15.降低osotub1(即npt1)基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)量增加。(a)灌漿后期株型比較，比例尺，20cm；(b)穗部形態(tài)比較，比例尺，5cm；(c)osotub1基因表達(dá)水平分析；(d)每穗穗粒數(shù)統(tǒng)計(jì)分析；(e)倒一節(jié)莖稈粗度統(tǒng)計(jì)分析；(f)單株產(chǎn)量統(tǒng)計(jì)分析。圖16.顯示osotub1的sgrna盒序列(seqidno：24)：u6a-sgrna盒單子葉植物。其中小寫(xiě)字母顯示的序列是靶序列，最后部分粗體下劃線顯示的序列是sgrna編碼序列。具體實(shí)施方式經(jīng)過(guò)廣泛而深入的研究，本發(fā)明克隆了一個(gè)可以改變水稻莖稈粗度、分蘗數(shù)、每穗穗粒數(shù)和產(chǎn)量的理想株型基因npt1，該基因位于水稻第八號(hào)染色體長(zhǎng)臂；該基因表達(dá)量降低或功能缺失突變可導(dǎo)致分蘗數(shù)減少，莖稈增粗，每穗穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量增加。植物轉(zhuǎn)化在特別優(yōu)選實(shí)施方式中，在高等生物體例如植物中表達(dá)至少一種本發(fā)明的控制粒寬和粒重的蛋白。可將本發(fā)明的控制粒寬和粒重的基因的核苷酸序列插入到表達(dá)盒中，然后優(yōu)選地，將該表達(dá)盒穩(wěn)定整合在所述植物基因組中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，將所述控制粒寬和粒重的基因的核苷酸序列包含在非致病自我復(fù)制的病毒中。按照本發(fā)明轉(zhuǎn)化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物，包括但不限于玉米，小麥，大麥，黑麥，甘薯，豆，豌豆，菊苣，萵苣，甘藍(lán)，花椰菜，花莖甘藍(lán)，蕪菁，蘿卜，菠菜，蘆筍，洋蔥，大蒜，胡椒，芹菜，筍瓜，南瓜，大麻，夏南瓜，蘋(píng)果，梨，溫桲，瓜，李子，櫻桃，桃子，油桃，杏，草莓，葡萄，木莓，黑莓，菠蘿，鱷梨，蕃木瓜，芒果，香蕉，大豆，番茄，高粱，甘蔗，甜菜，向日葵，菜籽油菜，三葉草，煙草，胡蘿卜，棉花，苜蓿，稻，馬鈴薯，茄子，黃瓜，擬南芥屬和木本植物如針葉樹(shù)和落葉樹(shù)。特別優(yōu)選的是水稻、小麥、大麥、玉米、燕麥、或黑麥。一旦已將期望的核苷酸序列轉(zhuǎn)化進(jìn)入特定植物物種中，可以在該物種中繁殖它或用常規(guī)育種技術(shù)將它轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。優(yōu)選地，在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)本發(fā)明的核苷酸序列，由此在轉(zhuǎn)基因植物中引起相應(yīng)粒寬蛋白的生物合成。以這種方式，可產(chǎn)生具有改良性狀的轉(zhuǎn)基因植物。為了在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)本發(fā)明核苷酸序列，本發(fā)明核苷酸序列可能需要修飾和優(yōu)化。所有生物體都有特定的密碼子使用偏愛(ài)性，這是本領(lǐng)域已知的，可以在保持本發(fā)明所述核苷酸序列編碼的氨基酸的同時(shí)改變其密碼子以符合植物偏愛(ài)性。而且，從有至少約35％，優(yōu)選多于約45％，更優(yōu)選多于50％，最優(yōu)選多于約60％gc含量的編碼序列可以最好地實(shí)現(xiàn)植物中高水平的表達(dá)。盡管可以在單子葉植物和雙子葉植物物種中充分地表達(dá)優(yōu)選的基因序列，但可以修飾序列以適應(yīng)單子葉植物或雙子葉植物的特異密碼子偏好和gc含量偏好，因?yàn)檫@些偏好已被證明是不同的(murray等，nucl.acidsres.17：477-498(1989))。此外，可篩選核苷酸序列以尋找引起信息截?cái)嗟姆浅Ｒ?guī)剪接位點(diǎn)的存在。利用公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)ep0385962(monsanto)，ep0359472(lubrizol)和wo93/07278(ciba-geigy)中所述的方法，用本領(lǐng)域熟知的位點(diǎn)定向誘變技術(shù)，pcr和合成基因構(gòu)建進(jìn)行在這些核苷酸序列中需要進(jìn)行的所有改變，如上述那些改變。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，下列實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不用來(lái)限制本發(fā)明的精神和范圍。需要說(shuō)明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述實(shí)施例中所用的試劑、酶類(lèi)等除特別說(shuō)明外，均為可從試劑公司商購(gòu)的分析純級(jí)別的試劑或酶類(lèi)。實(shí)施例1：水稻理想株型基因npt1的克隆本發(fā)明人將中國(guó)粳稻品種春江06與國(guó)際水稻所理想株型株系ir66167-27-5-1-6雜交收獲f1，并通過(guò)單粒傳法獲得重組自交系；其中ril52株系具有莖稈粗度增加，分蘗數(shù)目略減少，穗粒數(shù)顯著增加的理想株型特征的表型(圖1a-e)。將ril52與秈稻品種浙輻802雜交獲得f1，f2后代中隨機(jī)選取196個(gè)單株的葉片提取dna，同時(shí)對(duì)應(yīng)考察倒一節(jié)中部莖稈粗度、分蘗數(shù)和每穗穗粒數(shù)等性狀。利用ssr引物對(duì)ril52和浙輻802進(jìn)行多態(tài)性分析，選取有多態(tài)的引物，分別對(duì)196個(gè)f2單株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，根據(jù)電泳結(jié)果和作圖軟件mapmakerversion3.0要求，凡是出現(xiàn)ril52帶型的單株標(biāo)記為b，出現(xiàn)浙輻802帶型的單株標(biāo)記為a，同時(shí)出現(xiàn)ril52和浙輻802帶型的單株標(biāo)記為h。利用winqtlcartographerv2.5及復(fù)合區(qū)間作圖的方法進(jìn)行qtl定位和效應(yīng)估計(jì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在第8號(hào)染色體長(zhǎng)臂上存在一個(gè)同時(shí)控制水稻莖稈粗度(culmdiameter)、分蘗數(shù)(tillernumber)和每穗穗粒數(shù)(grainnumber)的主效qtl，將其命名為qnpt1(圖1f)。將ril52與浙輻802雜交后繼續(xù)回交浙輻802，獲得bc1f2群體；選取類(lèi)似ril52植株表型的單株389個(gè)。進(jìn)一步從中選取表型明確的93個(gè)單株，提取dna進(jìn)行粗定位。利用在目標(biāo)區(qū)域篩選出8個(gè)indel標(biāo)記，將目標(biāo)基因定位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂p6049與p351之間。利用剩余296個(gè)單株進(jìn)行精細(xì)定位，將目標(biāo)基因定位在p5528與p3914之間。將類(lèi)似ril52表型的bc1f2單株與zf802繼續(xù)回交，獲取目標(biāo)性狀的bc2f2分離樣品5326個(gè)，繼續(xù)利用在卡位區(qū)間發(fā)展的6個(gè)in-del標(biāo)記篩選交換單株，最終將目標(biāo)基因定位在p139與p143之間的4.1kbp區(qū)間內(nèi)，其中包含1個(gè)預(yù)測(cè)基因。該基因編碼一個(gè)去泛素化酶，是人類(lèi)otub1在水稻中的同源基因，將其命名為osotub1(圖2a)。rap-db(http：//rapdb.dna.affrc.go.jp/)預(yù)測(cè)osotub1存在兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，其中osotub1.1具有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)825bp；osotub1.2具有5個(gè)外顯子，4個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)597bp。對(duì)卡位區(qū)間進(jìn)行單倍型分析，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于ir66167-27-5-1-6的區(qū)段特有4個(gè)snp差異及一個(gè)單堿基插入差異，其中一個(gè)snp位于啟動(dòng)子(圖2b)。qnpt1鑒定與分離所用的分子標(biāo)記是以pcr為基礎(chǔ)的標(biāo)記，包括ssr標(biāo)記和自行設(shè)計(jì)indel標(biāo)記。ssr標(biāo)記均來(lái)自mccouch等(2001，2002)發(fā)表的微衛(wèi)星標(biāo)記連鎖圖；sts標(biāo)記是用ssr分析工具(http：//www.gramene.org/gramene/searches/ssrtool)分析克隆序列篩選出微衛(wèi)星重復(fù)性好的ssr目標(biāo)序列，再用primer5分析軟件對(duì)這些目標(biāo)序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。從這些引物中選擇了75對(duì)在染色體上均勻分布，且在親本間多態(tài)性好的標(biāo)記用于遺傳背景篩選，部分引物名稱(chēng)和序列見(jiàn)表4。pcr程序按照panaud等(1996)的方法稍加修改進(jìn)行，具體為每管20μl擴(kuò)增反應(yīng)體系，包括：0.15μmssr引物、200μmdntps、1×pcr反應(yīng)緩沖液(50mmkcl，10mmtris-hclph8.3，1.5mmmgcl2，0.01％明膠)、50～100ng模板dna，1utaq酶；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃dna變性5min、循環(huán)(94℃1min，56℃1min，72℃1min)36次、72℃再延伸5min。擴(kuò)增出的pcr產(chǎn)物用6％聚丙烯酰胺變性凝膠進(jìn)行電泳，電壓調(diào)至300v，室溫下電泳約3小時(shí)。電泳完畢后，銀染記錄帶型或凝膠成像。以中花11(zh11)的dna為模板，分別擴(kuò)增2.5kbposotub1.1及osotub1.2的啟動(dòng)子區(qū)，插入pcambia-2300載體(參見(jiàn)hajdukiewiczetal.，1994)，構(gòu)成攜帶水稻自身啟動(dòng)子的載體pcambia-osotub1.1-2300及pcambia-osotub1.2-2300。同時(shí)，以zh11的幼穗材料的cdna為模板，擴(kuò)增osotub1.1及osotub1.2的編碼區(qū)序列，分別插入載體pcambia-osotub1.1-2300及pcambia-osotub1.2-2300，構(gòu)成植物表達(dá)載體posotub1.1：：osotub1.1及posotub1.2：：osotub1.2。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化zh11-npt1，并獲得轉(zhuǎn)基因植株。研究發(fā)現(xiàn)posotub1.1：：osotub1.1轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株一次枝梗和二次枝梗減少，并且穗變長(zhǎng)，粒變長(zhǎng)，每穗籽粒數(shù)明顯減少，莖稈變細(xì)，分蘗增多，類(lèi)似zh11野生型的表型；而posotub1.2：：osotub1.2轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株表型類(lèi)似zh11-npt1。以上結(jié)果表明osotub1.1轉(zhuǎn)錄本具有功能，可以恢復(fù)zh11-npt1的表型。實(shí)施例2：中花11背景近等基因系的構(gòu)建本發(fā)明人將ril52連續(xù)回交中花11，選取莖稈增粗、分蘗減少、穗粒數(shù)增加的植株，并利用indel分子標(biāo)記p135對(duì)目標(biāo)區(qū)段進(jìn)行跟蹤檢測(cè)；同時(shí)，對(duì)目標(biāo)性狀以外的區(qū)段進(jìn)行背景掃描，最終獲得與中花11遺傳背景十分接近的近等基因系z(mì)h11-npt1材料用于后續(xù)的研究。灌漿后期zh11-npt1表現(xiàn)出莖稈粗壯、有效分蘗數(shù)減少和每穗穗粒數(shù)增加的表型。進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，相比zh11野生型，zh11-npt1節(jié)間莖稈粗度顯著增加、有效分蘗數(shù)減少大約2個(gè)、穗長(zhǎng)略變短(長(zhǎng)度18-20cm)，每穗穗粒數(shù)增加50-70粒，單株產(chǎn)量增加約10％(圖3)。實(shí)施例3：npt1的功能驗(yàn)證分別提取中花11背景的一對(duì)近等基因系幼苗的根(root)、幼嫩莖稈(culm)、葉片(leafblade)、葉鞘(leafsheath)、頂端分生組織(sam)、0.2cm幼穗(youngpanicle)、6cm穗及12cm穗的總rna，反轉(zhuǎn)錄獲取cdna后，定量pcr檢測(cè)osotub1在一對(duì)材料中不同組織和器官中的表達(dá)，發(fā)osotub1在水稻整個(gè)發(fā)育時(shí)期都有較高水平的表達(dá)，尤其在幼穗中的表達(dá)量高。相比zh11，osotub1在zh11-npt1不同組織和器官中的表達(dá)均呈現(xiàn)出了一定程度的下調(diào)(圖4)。以質(zhì)粒pb1121(chenetal.，2003)為模板擴(kuò)增gus序列，回收gus片段和載體骨架并連接，構(gòu)成載體pcambia：：gus-2300；擴(kuò)增2.5kb的osotub1.1啟動(dòng)子序列，酶切回收并插入pcambia：：gus-2300，構(gòu)建成posotub1：：gus。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)入zh11，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株不同發(fā)育時(shí)期的器官和組織進(jìn)行g(shù)us染色發(fā)現(xiàn)，該基因在水稻的整個(gè)發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)，尤其在維管束系統(tǒng)中顯著表達(dá)。對(duì)生長(zhǎng)一周的幼苗染色，觀察到osotub1在胚芽鞘和根部表達(dá)顯著(圖5a)；在根尖分生組織的靜止中心(quiescentcenter，qc)和根冠均有表達(dá)(圖5b)；在根部中柱鞘表達(dá)(圖5c)；在莖稈維管束有表達(dá)(圖5d)；在穗發(fā)育的不同時(shí)期均有表達(dá)，到后期表達(dá)逐漸降低，主要集中在穎殼上(圖5e，f)。以pcambia-2300為骨架載體，將osotub1.1啟動(dòng)子插入載體，然后按先后順序插入去掉終止密碼子的osotub1.1編碼序列及gfp編碼序列，構(gòu)建了自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的osotub1.1-gfp融合蛋白植物表達(dá)載體potub1：osotub1.1-gfp并轉(zhuǎn)化zh11。對(duì)轉(zhuǎn)基因幼苗根尖直接壓片觀察，發(fā)現(xiàn)osotub1.1-gfp融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中(圖6a)。進(jìn)一步酶解轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株幼苗葉鞘原生質(zhì)體，也證實(shí)了osotub1.1-gfp融合蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中(圖6b)。以pcambia-2300為骨架載體，構(gòu)建了pactin：：osotub1.1過(guò)量表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)入zh11中，實(shí)時(shí)定量pcr檢測(cè)osotub1.1基因表達(dá)量，獲得了過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系oe-8和oe-13。兩個(gè)超高表達(dá)株系灌漿后期表現(xiàn)出穗小、矮化，葉片具有明顯的類(lèi)病斑表型，進(jìn)一步對(duì)出現(xiàn)類(lèi)病斑的葉片進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞死亡。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)osotub1.1的超高表達(dá)導(dǎo)致一次枝梗、二次枝梗和每穗穗粒數(shù)的顯著減少，株高降低，呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)(圖7)。目標(biāo)蛋白的泛素化和去泛素化調(diào)控對(duì)細(xì)胞和生命活動(dòng)發(fā)揮著重要的功能。水稻osotub1編碼一個(gè)去泛素化酶，參與了泛素鏈的解聚。將osotub1.1，osotub1.2構(gòu)建到ge公司原核表達(dá)載體pgex-4t-1上，轉(zhuǎn)入rosetta(de3)菌株中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白并純化，購(gòu)買(mǎi)bostonbiochem公司的otub1蛋白及兩種底物泛素鏈tetra-ub。將gst-osotub1.1、gst-osotub1.2和otub1分別與兩種底物泛素鏈tetra-ub于37℃共同孵育1小時(shí)，進(jìn)行體外去泛素化實(shí)驗(yàn)。westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)tetra-ub-k48與tetra-ub-k63均能夠被osotub1.1裂解，而不能被osotub1.2裂解，這表明具備完整催化活性位點(diǎn)的osotub1.1不僅能夠催化48位泛素鏈的解聚，而且能夠催化63位泛素鏈解聚。進(jìn)一步分析osotub1.1對(duì)k48位和k63泛素鏈的催化活性，發(fā)現(xiàn)二者對(duì)k48位和k63泛素鏈的解聚能力不同，osotub1.1對(duì)k48位泛素鏈的解聚能力更強(qiáng)，基本將底物全部解聚，形成ub1；而對(duì)k63位泛素鏈的解聚能力較弱，形成ub3，ub2和ub1(圖8)。實(shí)施例4：npt1/osotub1互作蛋白o(hù)subc13鑒定及功能驗(yàn)證將osotub1.1構(gòu)建在pgbkt7(clontech公司)上，利用酵母雙雜交技術(shù)從水稻穗部cdna文庫(kù)中篩選互作蛋白。采用共轉(zhuǎn)化的方法，初步在-ade/-his/-leu/-trp營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板上獲取陽(yáng)性克隆200個(gè)，藍(lán)白斑篩選后獲得陽(yáng)性克隆40個(gè)。提取質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌，證實(shí)了osubc13(os01g48280)、osspl14(os08g39890)分別與osotub1.1相互作用。osubc13編碼一個(gè)泛素結(jié)合酶，其在動(dòng)物中的同源蛋白u(yù)bc13直接與otub1互作，并受到otub1的抑制。將osotub1.1插入pgex-4t-1原核表達(dá)載體(購(gòu)自ge)，構(gòu)建成pgex-4t-osotub1.1；osubc13插入pet-28a原核表達(dá)載體(購(gòu)自novagen)，構(gòu)建成pet-28a-osubc13。同時(shí)和對(duì)照蛋白gst空載體(購(gòu)自ge)分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株rosetta中，誘導(dǎo)表達(dá)并純化獲得gst、gst-osotub1.1與his-osubc13蛋白。將gst、gst-osotub1.1分別與sepharose4b4℃孵育1小時(shí)后，加入his-osubc13蛋白。4℃孵育2小時(shí)后westernblot檢測(cè)，gstpull-down實(shí)驗(yàn)證明gst-osotub1.1與his-osubc13相互作用。將osotub1.1連接在psy-735-35s-cyfp-ha(bracha-drori，k.etal，2004)載體，表達(dá)yfpc-osotub1.1；將osubc13連接在psy-736-35s-nyfp-ee(bracha-drori，k.etal，2004)載體，表達(dá)yfpn-osubc13。采用酶法解離7天水稻幼苗第一葉鞘，獲得原生質(zhì)體。通過(guò)peg介導(dǎo)的方法共轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體，結(jié)果顯示yfpc-osotub1.1與yfpn-osubc13在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生相互作用(圖9a-c)。以pcambia-2300為骨架載體，分別構(gòu)建p35s：osubc13及p35s：：osubc13-rnai植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化zh11，發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)osubc13植株株高無(wú)明顯變化，分蘗略減少，莖稈增粗，一次枝梗和二次枝梗數(shù)目增加，穗粒數(shù)增加，表型類(lèi)似于nil-npt1。對(duì)倒一節(jié)間莖稈中部橫切，發(fā)現(xiàn)莖稈增粗、增厚、維管束數(shù)目增加。而通過(guò)rnai降低osubc13的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株株高無(wú)明顯變化，但分蘗減少、莖稈變細(xì)、一次枝梗和二次枝梗數(shù)量減少、每穗穗粒數(shù)減少，表型類(lèi)似于osotub1.1過(guò)量表達(dá)植株的表型。對(duì)其穗下第一節(jié)間中部橫切，發(fā)現(xiàn)莖稈變細(xì)，維管束數(shù)目減少。以上結(jié)果表明osotub1具有抑制osubc13的功能(圖9d-i)。實(shí)施例5：npt1/osotub1互作蛋白o(hù)sspl14鑒定及功能驗(yàn)證osspl14編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其在rna水平上受到mir156的調(diào)控。osspl14轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平增高，使得水稻分蘗減少、穗粒數(shù)和千粒重增加，同時(shí)莖稈變得粗壯，抗倒伏能力增強(qiáng)，進(jìn)而提高產(chǎn)量。為了進(jìn)一步確認(rèn)osotub1與osspl14的相互作用及互作結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了表達(dá)yfpn-osspl14全長(zhǎng)及不同區(qū)段缺失瞬時(shí)表達(dá)載體，分別與表達(dá)yfpc-osotub1.1的表達(dá)載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)化水稻葉鞘原生質(zhì)體。觀察發(fā)現(xiàn)osotub1.1與osspl14的sbp-結(jié)構(gòu)域相互作用(圖10，圖11a)。這表明水稻spl轉(zhuǎn)錄因子的sbp結(jié)構(gòu)域是osotub1.1與osspl14相互作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域。免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-ip)是研究體內(nèi)蛋白相互作用的一種實(shí)驗(yàn)方法。提取zh11背景pactin：：otub1.1-gfp轉(zhuǎn)基因植株總蛋白與anti-gfp抗體4℃孵育1h，然后加入40μlproteing瓊脂糖珠后于4℃共同孵育1h。倒掉上清漂洗三次并加入2×sds上樣緩沖液，沸水浴5分鐘后進(jìn)行sds聚丙烯酰胺電泳。westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)osotub1與osspl14蛋白在體內(nèi)相互作用(圖11b)。以pcambia-2300為骨架載體，構(gòu)建pactin：：osspl14-rnai植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化zh11-npt1，觀察轉(zhuǎn)基因植株發(fā)現(xiàn)，降低osspl14表達(dá)水平導(dǎo)致植株分蘗顯著增加，穗部一次枝梗和二次枝梗數(shù)目減少，每穗穗粒數(shù)減少，部分類(lèi)似于zh11表型。將優(yōu)異等位基因osspl14wfp雜交到zh11背景，發(fā)現(xiàn)zh11-osspl14wfp分蘗減少，穗部一次枝梗和二次枝梗數(shù)目增加，單穗粒數(shù)增加，類(lèi)似于zh11-npt1表型。這些研究表明osspl14處于osotub1下游，二者共同調(diào)節(jié)水稻株型(穗型)的形態(tài)建成(圖11c-h)。實(shí)施例6：npt1同源基因的克隆和功能分析在ncbi網(wǎng)站(www.ncbi.nih.nlm.gov)提供的數(shù)據(jù)庫(kù)里，通過(guò)basiclogicalalignmentsearchtool(blast)比對(duì)，獲得了小麥、大麥、玉米、高粱、擬南芥、大豆、小鼠及人的同源的cdna序列，分別為烏拉爾圖小麥tuotub1(seqidno：7)、大麥hvotub1(seqidno：8)、玉米zmotub1(seqidno：9)、高粱sbotub1(seqidno：10)、擬南芥atotub1(seqidno：11)、大豆gmotub1(seqidno：12)、小鼠mmotub1(seqidno：13)和人類(lèi)hsotub1(seqidno：14)，它們編碼的蛋白的同源性分別為：tuotub1(seqidno：16)同水稻osotub1(seqidno：4)相似性為86.43％；hvotub1(seqidno：17)同水稻osotub1的相似性為86.79％；zmotub1(seqidno：19)同水稻osotub1的相似性為69.38％；sbotub1(seqidno：18)同水稻osotub1相似性為68.10％；atotub1(seqidno：20)同水稻osotub1的相似性為59.80％；gmotub1(seqidno：21)同水稻osotub1的相似性為61.32％；mmotub1(seqidno：22)同水稻osotub1的相似性為38.70％；hsotub1(seqidno：23)同水稻osotub1的相似性為39.12％(圖12)。通過(guò)同源克隆方法分別從玉米、大麥、小鼠和人類(lèi)中分離了osotub1的同源基因zmotub1、hvotub1、mmotub1和hsotub1，分別構(gòu)建了posotub1：tuotub1、posotub1：hvotub1、posotub1：mmotub1和pactin：hsdep1載體，轉(zhuǎn)化zh11-npt1水稻植株；轉(zhuǎn)基因水稻植株表型比較分析顯示過(guò)量表達(dá)玉米、大麥、小鼠及人類(lèi)otub1同源基因均能互補(bǔ)zh11-npt1水稻植株的突變表型，這表明這些同源基因功能具有保守性(圖13)。實(shí)施例7：優(yōu)異等位基因npt1和dep1-1聚合育種應(yīng)用dep1是一個(gè)控制水稻直立穗型和產(chǎn)量性狀的主效qtl，其優(yōu)異等位基因dep1-1能提高水稻莖尖分生組織活性，增加每穗穗粒數(shù)，進(jìn)而提高產(chǎn)量(參見(jiàn)本申請(qǐng)人已授權(quán)的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)枮?01110029759.9，在該申請(qǐng)中當(dāng)時(shí)將該基因命名為dep1，后來(lái)為了區(qū)分同一個(gè)dep1基因的不同變異類(lèi)型，將原來(lái)的dep1重新命名為dep1-1)。為了評(píng)價(jià)dep1-1和npt1聚合效應(yīng)，通過(guò)雜交的方法將npt1導(dǎo)入攜帶dep1-1(seqidno：33)的高產(chǎn)粳稻品種武運(yùn)粳7號(hào)(wyj7-dep1-1)，通過(guò)分子標(biāo)記輔助選擇和連續(xù)回交6次，獲得了wyj7-npt1-dep1-1與wyj7-npt1-dep1-1一對(duì)近等基因系。多年多點(diǎn)田間測(cè)產(chǎn)分析發(fā)現(xiàn)，優(yōu)異等位基因npt1和dep1-1聚合不影響水稻抽穗期和株高，分蘗數(shù)略有減少，但能明顯增加莖稈增粗、每穗穗粒數(shù)和千粒重，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量增加(圖14)。選育方法中涉及到的分子標(biāo)記是p135及pd1，序列請(qǐng)見(jiàn)表5。實(shí)施例8：利用crispr/cas9系統(tǒng)敲除npt1和其同源基因通過(guò)basiclogicalalignmentsearchtool(blast)比對(duì)，獲得了小麥、大麥、玉米、高粱、大豆、油菜、棉花及番茄的同源的cdna序列。以同源基因編碼蛋白氨基酸序列保守區(qū)域?yàn)榘行蛄?，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)。序列如下：水稻：5′-tcagctggaaagtgttctgcagg小麥：5′-ttaaggcgaacacgaggagatgg大麥：5′-ttaagacggacacgaggagatgg玉米：5′-aagctttatgttttcctacctgg高粱：5′-aagctttatgttctcctacttgg大豆：5′-attcgtcgtactcgaggagatgg油菜：5′-gttgcaatcaggcgaacaagagg棉花：5′-gcagccattagaagaacgcgagg番茄：5′-gctgccattagaagaacacgtgg設(shè)計(jì)引物將靶序列連入sgrna表達(dá)盒(序列seqidno：24-32)，單子葉植物邊酶切邊連接插入pylcrispr/cas9pubi-mh，雙子葉植物邊切邊連插入pylcrispr/cas9p35s-dh，方法具體參照文獻(xiàn)(maetal.，2015)，目前已經(jīng)獲得水稻轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。提取轉(zhuǎn)基因水稻不同株系的dna，通過(guò)pcr擴(kuò)增含有靶位點(diǎn)的gdna序列，回收pcr產(chǎn)物并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了不同形式的靶位點(diǎn)敲除株系，。其中osotub1-c1突變體gdna缺失7個(gè)堿基，導(dǎo)致移碼突變，編碼蛋白氨基酸序列提前終止。相比zh11，osotub1-c1突變體表現(xiàn)出了類(lèi)似nil-npt1表型(圖3)。實(shí)施例9：降低npt1基因表達(dá)轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)量增加pcr擴(kuò)增npt1基因(即osotub1基因)編碼區(qū)的5′端300bp的cdna序列，構(gòu)建了具備回文結(jié)構(gòu)的rnai干擾載體pactin：：rnai-osotub1，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將其轉(zhuǎn)入zh11，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株中osotub1基因表達(dá)呈現(xiàn)出不同程度的下調(diào)并表現(xiàn)出了zh11-npt1類(lèi)似的表型。比較zh11和rnai-osotub1兩個(gè)材料，發(fā)現(xiàn)rnai-osotub1轉(zhuǎn)基因材料穗變短，莖稈增粗，一次枝梗和二次枝梗數(shù)目增加，每穗穗粒數(shù)增加，產(chǎn)量增加(圖15)。表4.qtl分析及圖位克隆所用部分引物及序列表5.載體構(gòu)建所用部分引物及序列應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。參考文獻(xiàn)：kiewiczp，svabz，andmaligap.(1994).thesmall，versatileppzpfamilyofagrobacteriumbinaryvectorsforplanttransformation.plantmolecularbiology25.989-994.chenp-y，wangc-k，soongs-c，andtok.-y(2003).completesequenceofthebinaryvectorpbi121anditsapplicationincloningt-dnainsertionfromtransgenicplants.molecularbreeding11，287-293.max，zhangq，zhuq，etal.(2015).arobustcrispr/cas9systemforconvenient，high-efficiencymultiplexgenomeeditinginmonocotanddicotplants.molplant8，1274-1284.bracha-drorik，shichrurk，katza，etal.(2004).detectionofprotein-proteininteractionsinplantsusingbimolecularfluorescencecomplementation.plantj；40：419-427.序列表<110>中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所<120>控制水稻莖稈粗度、分蘗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重和產(chǎn)量的理想株型基因npt1及其應(yīng)用<130>ib178051<160>38<170>patentinversion3.1<210>1<211>825<212>dna<213>來(lái)自浙輻802的npt1cdna<400>1atgggcggggactactaccactcgtgctgcggcgaccccgaccccgacctccgcgcgccc60gaggggcccaagctgccgtacgtcggggacaaggaacctctctccactttagccgctgag120tttcagtctggcagccccattttacaggagaaaataaagttgcttggtgaacagtatgat180gctttaagaaggacacgaggagatggaaactgcttttatcgaagctttatgttttcctac240ttggaacatatcctagagacacaagacaaagctgaggttgagcgcattctaaaaaaaatt300gagcagtgcaagaagactcttgcagatcttggatacattgagttcacctttgaagatttc360ttctctatattcattgatcagctggaaagtgttctgcagggacatgaatcctccataggg420gccgaagagcttctagaaagaaccagggatcagatggtttctgattatgttgtcatgttc480tttaggtttgtcacctctggtgaaatccaaaggagggctgagttcttcgaaccattcatc540tctggcttgacaaattcgactgtggttcagttctgcaaggcttccgtggagccgatgggc600gaggaaagtgaccatgtccacataattgccctatcagatgcgttgggtgtgccaatccgt660gtgatgtacctagacagaagctcatgtgatgctggaaatataagtgtgaaccaccatgat720ttcagccctgaggccaattcatcggacggtgctgctgctgctgagaaaccttacattact780ttgctctaccgtcctggtcactacgacattctctacccgaagtga825<210>2<211>825<212>dna<213>來(lái)自ir66167-27-5-1-6的npt1cdna<400>2atgggcggggactactaccactcgtgctgcggcgaccccgaccccgacctccgcgcgccc60gaggggcccaagctgccgtacgtcggggacaaggaacctctctccactttagccgctgag120tttcagtctggcagccccattttacaggagaaaataaagttgcttggtgaacagtatgat180gctttaagaaggacacgaggagatggaaactgcttttatcgaagctttatgttttcctac240ttggaacatatcctagagacacaagacaaagctgaggttgagcgcattctaaaaaaaatt300gagcagtgcaagaagactcttgcagatcttggatacattgagttcacctttgaagatttc360ttctctatattcattgatcagctggaaagtgttctgcagggacatgaatcctccataggg420gccgaagagcttctagaaagaaccagggatcagatggtttctgattatgttgtcatgttc480tttaggtttgtcacctctggtgaaatccaaaggagggccgagttcttcgaaccattcatc540tctggcttgacaaattcgactgtggttcagttctgcaaggcttccgtggagccgatgggc600gaggaaagtgaccatgtccacataattgccctatcagatgcgttgggtgtgccaatccgt660gtgatgtacctagacagaagctcatgtgatgctggaaatataagtgtgaaccaccatgat720ttcagccctgaggccaattcatcggacggtgctgctgctgctgagaaaccttacattact780ttgctctaccgtcctggtcactacgacattctctacccgaagtga825<210>3<211>3825<212>dna<213>來(lái)自浙輻802的npt1gdna序列<400>3atgggcggggactactaccactcgtgctgcggcgaccccgaccccgacctccgcgcgccc60gaggggcccaagctgccgtacgtcggggacaaggtgagatgttgacgcctctctctcttt120ctctgtctctctcgctcgctttgactcatctgcgctttgactcatctgcggtcgatagat180ttgttcatgtggtagaaatgggtctgaatcgtggtaagacgcccagtgttgccatgccag240tatccgctagttgtgccagcaggtgaggcgatagatcagtcctgttagtctagttggatg300ctgattgttggtcatcattactgttgtattggtgctccatttctatgtgaattgacattt360taaggcgtctatacaagcagtggggactagaatttggataacaagtaacaatttcccctt420attgcgtcatcttaaaggataagaggagttatcagatgctggattttctcctttattttt480agtcgtggtgcctggaataatggagattggctgaacaagttcatatcagttgtgtccatt540ttcatcctctggatggtcagtccttaagtattgtcaggcgctattgttgtgagttgtaac600tgttgtacttgattttttagcttcgttggtgaactgatgtttggaggttcatgcagaagt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