本發(fā)明涉及遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因拷貝數(shù)變異研究方法。

背景技術(shù)：

拷貝數(shù)變異(copy number variants，CNVs)是生物基因組中一種重要的遺傳變異形式。研究發(fā)現(xiàn)CNVs與作物的許多性狀相關(guān)，Cook等(2012)研究發(fā)現(xiàn)大豆胞囊線蟲抗病位點(diǎn)Rhg1作用機(jī)制為31kbp基因組片段的拷貝數(shù)變異。因此研究作物種質(zhì)資源個(gè)體表型差異、群體拷貝數(shù)表型變異規(guī)律以及基因組進(jìn)化具有重要意義。目前拷貝數(shù)變異的檢測技術(shù)包括微陣列比較基因雜交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)、芯片代表性寡核苷酸微陣列分析(respectively oligonucleotide microarray analysis，ROMA)、多重連接探針擴(kuò)增(multiplex ligation.dependent probe amplification；MLPA)、多重可擴(kuò)增探針雜交(multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH)、新一代測序技術(shù)以及熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測等，雖然CNV檢測技術(shù)較多，其主要用于人類疾病的檢測，針對(duì)于作物的研究，受到每種方法的技術(shù)手段、成本及操作難度的限制難于在常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)室中推廣應(yīng)用，尤其當(dāng)被測樣本容量大的情況下，如進(jìn)行作物重組群體的表型檢測難度很大。

目前拷貝數(shù)變異的檢測技術(shù)包括微陣列比較基因雜交(array-based comparative genomic hybridization，aCGH)、單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)、芯片代表性寡核苷酸微陣列分析(respectively oligonucleotide microarray analysis，ROMA)、多重連接探針擴(kuò)增(multiplex ligation.dependent probe amplification；MLPA)、多重可擴(kuò)增探針雜交(multiplex amplifiable probe hybridization，MAPH)、新一代測序技術(shù)以及熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)檢測，以上檢測方法存在明顯的不足之處，難于在常規(guī)分子實(shí)驗(yàn)室中廣泛應(yīng)用，其中aCGH、ROMA、MLPA和MAPH等方法對(duì)芯片及雜交探針的需求及探針回收率低、實(shí)驗(yàn)成本高等問題；新一代測序技術(shù)對(duì)CNV的檢測因高測序深度而導(dǎo)致高成本及對(duì)大樣本群體CNV分析的限制；FISH技術(shù)檢測價(jià)格昂貴，且對(duì)研究人員操作手法和分析經(jīng)驗(yàn)要求極高，無法進(jìn)行大規(guī)模重復(fù)性分析且周期長、不適合做大樣本分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供一種大豆基因拷貝數(shù)變異分析方法，具體方案包括如下步驟：

1)基因組DNA的提取和濃度均一化：采取SDS法提取大豆基因組DNA，將基因組DNA濃度調(diào)整為50ng/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)被測基因引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)被測基因引物，設(shè)計(jì)模板為被測基因CDS序列；3)RT-qPCR：以β-actin為內(nèi)參基因，用內(nèi)參基因引物與步驟2)涉及的被測基因引物分別對(duì)基因組DNA模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；熒光定量PCR檢測方法反應(yīng)體系為20μL，包括：2×熒光定量預(yù)混試劑(SuperRealPreMix Plus(2×))10.0μl，濃度為10μmol·L^-1的PCR上下游引物各0.6μL，基因組DNA模板2μl，滅菌蒸餾水6.8μl；PCR程序包括：預(yù)變性95℃、15min；變性95℃、10s，退火55-60℃、20s，延伸72℃、20s,40個(gè)循環(huán)；

內(nèi)參引物：

上游：5’GATCTACCATGTTCCCAAGT 3’，

下游：5’ATAGAGCCACCAATCCAGAC 3’；

4)利用RT-qPCR獲得被測基因和內(nèi)參基因β-actin的Ct值計(jì)算被測基因在不同大豆品種中的相對(duì)豐度值，通過被測基因在不同品種大豆中的相對(duì)豐度值之間的比值判斷被測基因在不同品種大豆中的拷貝數(shù)變異關(guān)系。

上述方法具體包括以下步驟：

1)基因組DNA的提取和濃度均一化：采取SDS法提取品種A大豆基因組DNA，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測和 Lite紫外分光光度計(jì)聯(lián)合檢測DNA濃度并通過稀釋實(shí)現(xiàn)濃度均一化，將基因組DNA濃度調(diào)整為50ng/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)被測基因引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)被測基因引物，設(shè)計(jì)模板為被測基因CDS序列；

3)RT-qPCR：以β-actin為內(nèi)參基因，用內(nèi)參基因引物與步驟2)涉及的被測基因引物分別對(duì)基因組DNA模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)；熒光定量PCR檢測方法反應(yīng)體系為20μL，包括：2×熒光定量預(yù)混試劑(SuperRealPreMix Plus(2×))10.0μl，濃度為10μmol·L^-1的PCR上下游引物各0.6μL，基因組DNA模板2μl，滅菌蒸餾水6.8μl；PCR程序包括：預(yù)變性95℃、15min；變性95℃、10s，退火55-60℃、20s，延伸72℃、20s,40個(gè)循環(huán)；

內(nèi)參引物：

上游：5’GATCTACCATGTTCCCAAGT 3’，

下游：5’ATAGAGCCACCAATCCAGAC 3’；

4)以RT-qPCR獲得被測基因和內(nèi)參基因β-actin的Ct值為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，按公式2^{-(Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因))}計(jì)算被測基因相對(duì)豐度值，設(shè)被測基因相對(duì)豐度值為a；

5)取品種B大豆，重復(fù)上述步驟1)-4)，設(shè)被測基因相對(duì)豐度值為b'；

6)根據(jù)a/b的值判定被測基因在品種A中的拷貝數(shù)與被測基因在品種B中的拷貝數(shù)的多少：當(dāng)a/b＞2.5時(shí)，被測基因在品種A中的拷貝數(shù)顯著大于被測基因在品種B中的拷貝數(shù)。

優(yōu)選的，步驟2)所述引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：a)PCR產(chǎn)物長度90bp-200bp；b)引物對(duì)在大豆基因組上具有唯一匹配位置。

優(yōu)選的，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)計(jì)出的引物要以大豆基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增以測試基因引物特異性，以擴(kuò)增產(chǎn)物唯一為準(zhǔn)；并在退火溫度55-60℃范圍內(nèi)進(jìn)行溫度梯度PCR確定引物的最佳退火溫度，以擴(kuò)增產(chǎn)物量最大為準(zhǔn)；步驟3)中的退火溫度選取步驟2)確定的最佳退火溫度。

上述引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：

(1)PCR產(chǎn)物長度90bp-200bp；

(2)GC含量40％-60％；

(3)避免形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物二聚體；

(4)產(chǎn)物避免跨內(nèi)含子區(qū)；

(5)引物設(shè)計(jì)完成后通過與大豆基因組序列的在線比對(duì)(www.phetozome.net)，確保引物對(duì)在大豆基因組上具有唯一匹配位置。

上述步驟4)-6)中的數(shù)據(jù)處理方法為：

以被測基因PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度作為基因拷貝數(shù)變異基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，被測基因PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度的計(jì)算采用內(nèi)參基因法，具體通過公式2^-ΔΔCt計(jì)算。其中ΔΔCt＝Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，對(duì)于相對(duì)定量ΔΔCt方法，Ct值是由三次試驗(yàn)重復(fù)取平均數(shù)得，相對(duì)拷貝數(shù)，即被測基因PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度由2^-ΔΔCt計(jì)算得到，利用不同品種的PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度之間的倍數(shù)關(guān)系判斷基因拷貝數(shù)差異。具體操作如下：

(1)對(duì)不同被測樣本內(nèi)參基因Ct值進(jìn)行F測驗(yàn)，在無顯著差異情況下進(jìn)行下一步分析；

(2)對(duì)不同被測樣本目的基因Ct值進(jìn)行F測驗(yàn)，同一基因在不同樣本間存在顯著或極顯著差異的情況下進(jìn)行下一步分析；

(3)計(jì)算相對(duì)拷貝數(shù)比值，即基因PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度比值，具體為:相對(duì)拷貝數(shù)比值＝2^{-ΔΔCt樣本n}/2^{-ΔΔCt樣本n+1}，該比值大于2.5作為拷貝數(shù)差異閾值。

本發(fā)明所提供的大豆基因組基因拷貝數(shù)變異分析方法是基于熒光定量PCR結(jié)合DNA濃度均一化處理的分析方法，該方法具有低成本及技術(shù)難度低等特點(diǎn)，克服現(xiàn)有基因拷貝數(shù)變異分析方法的高成本、技術(shù)要求高和操作難度大等缺點(diǎn)，可用于大豆基因組任何編碼基因或區(qū)段的拷貝數(shù)變異定性分析和品種基因間拷貝數(shù)差異比較，便于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)操作，輔助判斷因基因拷貝數(shù)變異引起的相應(yīng)基因組區(qū)段功能差異。

有益效果

1基因組DNA用量較高通量測序、微陣列法和原位雜交技術(shù)用量少10³倍；

2與現(xiàn)有技術(shù)相比，無需進(jìn)行測序和雜交探針合成，成本低廉；

3操作簡單，只需進(jìn)行DNA提取，濃度均一化及PCR反應(yīng)即可獲得數(shù)據(jù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求低，掌握基本的實(shí)驗(yàn)技能即可運(yùn)用本發(fā)明提供的方法，且周期短，可以實(shí)現(xiàn)大樣本分析；

4理論上可對(duì)任意基因組區(qū)段進(jìn)行拷貝數(shù)定性分析及品種間比較；

5適用于大樣本容量重組群體的拷貝數(shù)變異表型分析。

附圖說明

圖1模板DNA濃度均一化；A：DNA提取濃度檢測；B：RNA酶消化后DNA濃度檢測；

圖2基于高通量測序的拷貝數(shù)變異區(qū)；注：染色體左側(cè)三角代表缺失區(qū)段(相對(duì)于參考基因組拷貝數(shù)低)；染色體右側(cè)三角代表獲得區(qū)段(相對(duì)于參考基因組拷貝數(shù)高)；

圖3目標(biāo)基因引物特異性檢測；

A：溫度梯度PCR檢測；B，C：引物特異性檢測。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

利用本方法對(duì)高通量測序獲得的拷貝數(shù)變異區(qū)進(jìn)行驗(yàn)證

1)植物材料及DNA提取

采取SDS法提取大豆基因組DNA，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測和Lite紫外分光光度計(jì)聯(lián)合檢測DNA濃度并通過稀釋實(shí)現(xiàn)濃度均一化，將基因組DNA濃度調(diào)整為50ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩４蠖拱揖€蟲多小種抗性大豆種質(zhì)東農(nóng)L-10為參照材料，感病大豆品種黑農(nóng)37、綏農(nóng)10和綏農(nóng)14為參照材料。

2)目標(biāo)基因引物設(shè)計(jì)及特異性分析

通過大豆基因組重測序(測序深度30x)，獲得抗病品種東農(nóng)L-10和感病品種黑農(nóng)37之間拷貝數(shù)差異區(qū)(圖2，表1)。

表1基于基因組重測序的拷貝數(shù)變異區(qū)預(yù)測

結(jié)合主效QTL區(qū)段，選取拷貝數(shù)變異區(qū)內(nèi)27個(gè)候選基因進(jìn)行方法建立和驗(yàn)證試驗(yàn)(表2)。根據(jù)其CDS序列進(jìn)行基因特異性引物設(shè)計(jì)，以東農(nóng)L-10為模板，通過設(shè)定6個(gè)溫度梯度PCR來確定最適退火溫度(圖3A)，其中56℃引物和模板結(jié)合較好，產(chǎn)物特異性較好，確定為最適退火溫度；設(shè)置退火溫度為56℃，對(duì)27對(duì)基因特異性引物進(jìn)行4個(gè)模板DNA的PCR分析，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得22個(gè)特異性好的引物，用于拷貝數(shù)變異定性分析(圖3B-C)。

表2實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

3)RT-qPCR分析

以β-actin為內(nèi)參基因，用內(nèi)參基因引物與步驟2)涉及的被測基因引物分別對(duì)基因組DNA模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，與上述引物對(duì)分別對(duì)四種大豆基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR；熒光定量PCR檢測方法反應(yīng)體系為20μL，包括：2×熒光定量預(yù)混試劑(SuperRealPreMix Plus(2×))10.0μl，濃度為10μmol·L^-1的PCR上下游引物各0.6μL，PCR Reverse Primer(10μmol·L-1)0.6μL，基因組DNA模板2μl，滅菌蒸餾水6.8μl；PCR程序包括：預(yù)變性95℃、15min；變性95℃、10s，退火56℃、20s，延伸72℃、20s,40個(gè)循環(huán)。

通過分析RT-qPCR獲得被測基因和內(nèi)參基因β-actin的Ct值，可知,四個(gè)品種內(nèi)參基因的Ct值在26–29之間,其中東農(nóng)L-10的CT值在26.07–29.62之間，其平均Ct值為26.64；黑農(nóng)37的Ct值在26.03-28.94之間，平均Ct值為27.07；綏農(nóng)10的Ct值在26.04-29.68之間，平均Ct值為27.68；綏農(nóng)14的Ct值在26.18-28.47之間，平均Ct值為27.01；四個(gè)品種內(nèi)參基因Ct值方差分析結(jié)果表明在P＝0.05水平和P＝0.01水平上均不顯著(表3)。由此可見，內(nèi)參基因β-actin在四個(gè)品種模板DNA濃度均一化后PCR產(chǎn)物豐度一致性較好，說明不同品種之間內(nèi)參基因β-actin在基因組模板DNA的初始含量一致，間接說明該基因在被測的不同品種間無拷貝數(shù)的差異，可以作為被測目標(biāo)基因的對(duì)照。

表3內(nèi)參基因β-actin Ct值方差分析

22個(gè)目的基因在四個(gè)品種中的Ct值差異較大，整體在13–32之間,其中東農(nóng)L-10的Ct值在13.46–31.78之間，其平均CT值為17.74；黑農(nóng)37的Ct值在15.47-32.85之間，平均CT值為19.47；綏農(nóng)10的CT值在14.86-28.88之間，平均Ct值為20.79；綏農(nóng)14的CT值在15.19-28.17之間，平均Ct值為19.58(表4)。以上結(jié)果說明在四個(gè)品種模板DNA濃度均一化后不同基因在特定品種當(dāng)中PCR產(chǎn)物豐度存在較大差異，間接說明不同基因在基因組DNA中初始含量不同，PCR產(chǎn)物豐度差異可以通過q RT-PCR方法檢測。

表4目的基因Ct值分析

4)拷貝數(shù)變異分析

通過F測驗(yàn)，對(duì)同一品種不同基因以及同一基因不同品種進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果表明目的基因18、21在抗病品種東農(nóng)L-10與感病品種綏農(nóng)14的中PCR產(chǎn)物豐度差異不顯著，目的基因1、2、17、23在東農(nóng)L-10與黑農(nóng)37中的PCR產(chǎn)物豐度差異達(dá)到顯著水平，目的基因22在東農(nóng)L10與綏農(nóng)10中的PCR產(chǎn)物豐度差異達(dá)到顯著水平，其他的15個(gè)目的基因的PCR產(chǎn)物豐度在抗病品種與感病品種間均呈極顯著差異，由此可以推斷這15個(gè)目的基因在抗感品種基因組中可能存在拷貝數(shù)變異(表5)。

表5 PCR產(chǎn)物豐度顯著性分析F測驗(yàn)值

注：F crit0.05＝7.71；F crit0.01＝21.20

表6 PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度值

表7 PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度比較值

在22個(gè)基因中，對(duì)PCR產(chǎn)物豐度在抗感品種間存在極顯著差異的15個(gè)基因進(jìn)行PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度值的估算(表6)，并進(jìn)行抗病品種東農(nóng)L-10和其他三個(gè)感病品種的PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度值進(jìn)行比較(表7)，目的基因4分別在東農(nóng)L-10和綏農(nóng)14，東農(nóng)L-10和綏農(nóng)10，東農(nóng)L-10和綏農(nóng)14中的PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度比值較低，說明目的基因4在東農(nóng)L-10中拷貝數(shù)低于綏農(nóng)14、綏農(nóng)10、黑農(nóng)37的拷貝數(shù)；目的基因15,24分別在東農(nóng)L-10和綏農(nóng)10、東農(nóng)L-10和黑農(nóng)37，東農(nóng)L-10和綏農(nóng)14、東農(nóng)L10和綏農(nóng)10中的PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度比值較低，說明目的基因15、24在東農(nóng)L-10中拷貝數(shù)低于在綏農(nóng)10、綏農(nóng)14，黑農(nóng)37。目的基因8、11、27在東農(nóng)L-10和黑農(nóng)37的PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度值較低，說明目的基因8、11、27在東農(nóng)L-10中拷貝數(shù)低于在黑農(nóng)37中的拷貝數(shù)，其他的9個(gè)目的基因在東農(nóng)L-10和黑農(nóng)37，東農(nóng)L-10和綏農(nóng)10，東農(nóng)L-10和綏農(nóng)14中的PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度比值均大于2.5，說明這9個(gè)目的基因在東農(nóng)L-10中的拷貝數(shù)高于在黑農(nóng)37，綏農(nóng)10，綏農(nóng)14中的拷貝數(shù)，可定性為這9個(gè)目的基因在這四個(gè)品種中存在拷貝數(shù)變異(表7)。

SEQUENCE LISTING

<110> 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種大豆基因拷貝數(shù)變異分析方法

<130>

<160> 56

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV1-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 1

tcaatcactt tgcctttctg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV1-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 2

atccgaaaca ttatgaaccc 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> CNV2-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 3

agtcctctgc cacagcgtca c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV2-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 4

tccaccaaag ctccatctcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV3-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 5

atgggtatca agtatgtgga 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> CNV3-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 6

ggttcattat agtgagggag t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV4-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 7

gggacaggat cagtgagtta 20

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> CNV4-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(22)

<400> 8

aaatagaaga gggaaacacc aa 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV5-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 9

tgacctcctt gactcacctc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> CNV5-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 10

ccacatactt gatacccatt c 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV6-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 11

tggtgcatca gggaacaatt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV6-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 12

gaaagctggg acctaactgc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV7-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 13

attctcaaag acagggatga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV7-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 14

tagaaattga acgtgccaga 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV8-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 15

atgggtatca agtatgtgga 20

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> CNV8-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 16

ggttcattat agtgagggag t 21

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV9-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 17

tcatggcggt atgcctattt 20

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> CNV9-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(22)

<400> 18

acatcggtgt attctaagca ac 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV10-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 19

cactgctcta acgaggcaca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV10-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 20

gcacaatttg ggaagaaaca 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> CNV11-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(24)

<400> 21

agaaggtatt ggtaatatgg gatc 24

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV11-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 22

gcagtttatg ggcagtggtg 20

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> CNV12-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 23

gaatgggtat caagtatgtg g 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV12-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 24

gtgggtcaaa gaaggaagag 20

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> CNV13-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(19)

<400> 25

gcctggtgat gaagacagg 19

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> CNV13-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(22)

<400> 26

ttcccagtat tctttgatgt tc 22

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV14-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 27

aaacaggcag ggcagcagta 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV14-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 28

agtgacgttg tggcagagga 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV15-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 29

ccatgaaggc caacaagaag 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV15-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 30

agaagggaga ccaacagcaa 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV16-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 31

tttatcggca acaatctatg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV16-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 32

aaggagcaat cactatccag 20

<210> 33

<211> 22

<212> DNA

<213> CNV17-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(22)

<400> 33

aatggataag agttgtaccg tg 22

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV17-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 34

gcaaattgct gtaccttagg 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV18-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 35

cccattccca tttgcttata 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV18-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 36

aactgtctgt ccattcaccc 20

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> CNV19-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(24)

<400> 37

ctcttatcag agtttatagc atat 24

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV19-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 38

tttgttactg tcatcatccc 20

<210> 39

<211> 21

<212> DNA

<213> CNV20-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 39

aaggaggttc acaacgcaaa g 21

<210> 40

<211> 24

<212> DNA

<213> CNV20-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(24)

<400> 40

gctcagatat gaatgatacc caaa 24

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV21-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 41

gctggcaacc atgacagaag 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV21-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 42

acaggtcgat aagccgcagt 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV22-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 43

tatggctgaa aggaagagga 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV22-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 44

atgccttgtg gaatatgacc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV23-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 45

ttggacacgg tgatggtaat 20

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> CNV23-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 46

tctcgcaagt ggtcaagata a 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> CNV24-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(21)

<400> 47

tgttgcttag aatacaccga t 21

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV24-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 48

ctttacatcc caaaacagaa 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV25-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 49

gtgaagaaag cggaggtaga 20

<210> 50

<211> 19

<212> DNA

<213> CNV25-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(19)

<400> 50

cccttgaatt tctggagga 19

<210> 51

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV26-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 51

gtctgccacc actcctatta 20

<210> 52

<211> 23

<212> DNA

<213> CNV26-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(23)

<400> 52

agggtttgta tctgaagagt tta 23

<210> 53

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV27-F

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 53

aaccctccat tctcaacctc 20

<210> 54

<211> 20

<212> DNA

<213> CNV27-R

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 54

caaaggtcag gtgtaatccc 20

<210> 55

<211> 20

<212> DNA

<213> 內(nèi)參引物上游

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 55

gatctaccat gttcccaagt 20

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 內(nèi)參引物下游

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(20)

<400> 56

atagagccac caatccagac 20