亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法與流程

文檔序號:12412901閱讀:230來源:國知局
一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法與流程

本發(fā)明涉及分子遺傳技術領域,尤其涉及一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法。



背景技術:

在眾多表觀遺傳修飾形式中,最常見且研究最多的是DNA甲基化(Jaenisch and Bird,2003),是指在甲基轉(zhuǎn)移酶催化作用下以S-腺苷甲硫氨酸為供體,將甲基基團共價添加到DNA堿基上的修飾形式(Santi et al.,1983)。DNA甲基化在許多生物學過程中發(fā)揮著十分重要的作用,包括基因表達調(diào)控、基因印記和轉(zhuǎn)座子沉默等。眾多關注DNA甲基化的研究表明,DNA甲基化多態(tài)性也可以影響表型(Katherine et al.,2013)。早在20世紀80年代,就有眾多研究報道胞嘧啶甲基化的主要功能是作為基因表達的抑制子(Razin and Riggs,1980;van der Ploeg,1980)減少了表型變異,這種現(xiàn)象在植物和動物中都有發(fā)現(xiàn)。人類癌癥的發(fā)生與CpG島的甲基化使抑癌因子p16的轉(zhuǎn)錄沉默有關,高等植物的某些發(fā)育過程如開花、果實成熟和種子發(fā)育等也會隨DNA甲基化的改變而改變或受到抑制。有越來越多的研究證據(jù)表明,表型變異不僅由遺傳因素決定,還會受到基因表觀遺傳修飾的影響(Verhoeven et al.,2010),并且這種影響所產(chǎn)生的表型是可以遺傳的。

林木是多年生植物,世代周期長且需要經(jīng)歷長時間段的組織分化,還要適應多變的自然環(huán)境。我國森林覆蓋面積較廣,林木物種比較豐富,眾多林木樹種在商業(yè)用材生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境保護中起著非常重要的作用。目前對林木遺傳資源的分布、遺傳多樣性和群體結構等的研究已取得了一定的進展,也對某些樹種進行了遺傳連鎖圖譜的構建,能夠為將來進一步的研究和育種工作提供理論基礎。然而,表型變異并不僅僅由DNA序列決定,DNA甲基化對表型的影響也很顯著。林木中表觀遺傳連鎖圖譜的構建還未見報道。



技術實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法,本發(fā)明提供的構建方法高效、穩(wěn)定、易操作,有利于林木遺傳資源分布、遺傳多樣性和群體結構的深入研究。

本發(fā)明提供了一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法,包括以下步驟:

1)提取木質(zhì)部組織的基因組DNA,所述木質(zhì)部組織取自林木胸徑位置成熟木質(zhì)部;

2)采用第一組酶和第二組酶分別對所述基因組DNA進行雙酶切,在兩組雙酶切產(chǎn)物上分別連接接頭,得到兩組酶切連接后的產(chǎn)物;

所述第一組酶包括EcoRI和HpaII,所述第二組酶包括EcoRI和MspI;

3)分別對兩組酶切連接后的產(chǎn)物依次進行預擴增和選擇性擴增,通過毛細管電泳分離所述選擇性擴增的產(chǎn)物,獲得群體基因組甲基化標記位點;

所述選擇性擴增用引物為:在預擴增用引物的3'端隨機增加3個核苷酸堿基,且5'端進行熒光標記;

4)從所述群體基因組甲基化標記位點中篩選符合孟德爾遺傳分離的群體甲基化多態(tài)性位點,構建甲基化遺傳連鎖圖譜。

優(yōu)選的是,所述步驟2)中第一組酶EcoRI和HpaII的雙酶切產(chǎn)物用接頭的序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示;

所述步驟2)中第二組酶EcoRI和MspI的雙酶切產(chǎn)物用接頭的序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

優(yōu)選的是,所述預擴增用引物的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

優(yōu)選的是,所述步驟2)中的雙酶切和連接接頭在一個體系中進行,所述體系包括:2μL 10×Buffer,0.25μL 12U/μL的EcoRI酶,0.4μL 10U/μL的HpaII或MspI酶,1μL 100μM的EcoRI的接頭,1μL 100μM的HpaII或MspI的接頭,0.5μL 10U/μL的T4DNA連接酶,4μL 100ng/μL的基因組DNA,ddH2O補足至20μL;

所述體系的溫度為35~37℃,酶切與連接反應總時間為10~14h。

優(yōu)選的是,所述步驟3)中預擴增的反應體系包括:4μL 5×Buffer,1μL 10μM的SEQ ID No.5引物,1μL 10μM的SEQ ID No.6引物,0.3μL 10mM的dNTPs,0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase,任一組所述步驟2)酶切連接后的產(chǎn)物3μL,ddH2O補足至20μL;

所述預擴增的條件為:94℃預變性5min;94℃30s,56℃30s,72℃80s,30個循環(huán);72℃延伸5min。

優(yōu)選的是,所述步驟3)中選擇性擴增的反應體系包括:3μL稀釋20倍后的預擴增產(chǎn)物,4μL 5×Buffer,4μL選擇性擴增的引物,0.3μL 10mM的dNTPs,0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase,ddH2O補足至20μL;

所述選擇性擴增的條件為:94℃預變性3min;首個循環(huán)擴增參數(shù)為94℃30s,65℃30s,72℃80s,將每個循環(huán)的退火溫度依次遞減0.7℃,共擴增13個循環(huán);94℃30s,56℃30s,72℃60s擴增25個循環(huán);72℃延伸5min。

優(yōu)選的是,所述步驟5)的篩選過程中,將最小等位頻率<5%的低頻率位點和不存在多態(tài)性位點舍棄。

本發(fā)明提供一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法,可通過篩選群體內(nèi)符合孟德爾遺傳分離的穩(wěn)定甲基化位點進行表觀遺傳圖譜構建,方法精確性高。本發(fā)明提供的方法能夠高效、穩(wěn)定地構建林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜,實現(xiàn)重要性狀基因定位,能夠為林木分子標記輔助育種提供直接有力的技術支持,對確保我國林木速生豐產(chǎn)、林業(yè)持續(xù)穩(wěn)定健康地發(fā)展具有重要的戰(zhàn)略意義。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1得到的毛白楊基因組DNA甲基化遺傳圖譜。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法,包括以下步驟:

1)提取木質(zhì)部組織的基因組DNA,所述木質(zhì)部組織取自林木胸徑位置成熟木質(zhì)部;

2)采用第一組酶和第二組酶分別對所述基因組DNA進行雙酶切,在兩組雙酶切產(chǎn)物上分別連接接頭,得到兩組酶切連接擴增產(chǎn)物;

所述第一組酶包括EcoRI和HpaII,所述第二組酶包括EcoRI和MspI;

3)分別對兩組酶切連接后的產(chǎn)物依次進行預擴增和選擇性擴增,通過毛細管電泳分離所述選擇性擴增的產(chǎn)物,獲得群體基因組甲基化標記位點;

所述選擇性擴增用引物為:在預擴增用引物的3'端隨機增加3個核苷酸堿基,且5'端進行熒光標記;

4)從所述群體基因組甲基化標記位點中篩選符合孟德爾遺傳分離的群體甲基化多態(tài)性位點,構建甲基化遺傳連鎖圖譜。

在本發(fā)明中,提取木質(zhì)部組織的基因組DNA,所述木質(zhì)部組織取自雜交群體內(nèi)個體胸徑位置成熟木質(zhì)部。所述林木優(yōu)選為F1代雜交群體,本發(fā)明對所述雜交所用母本和父本并沒有特殊的限制,采用常規(guī)雜交授粉進行組合交配即可。本發(fā)明對所述木質(zhì)部組織的采取方法沒有特殊的限定,采用本領域技術人員熟知的木質(zhì)部組織采取方法即可。如剝?nèi)淦?,取木質(zhì)部材料置于液氮中進行保存。

本發(fā)明對所述基因組DNA的提取方法沒有特殊的限定,采用本領域技術人員熟知的常規(guī)的CTAB法提取基因組即可。

得到基因組DNA后,本發(fā)明采用第一組酶和第二組酶分別對所述基因組DNA進行雙酶切,在兩組雙酶切產(chǎn)物上分別連接接頭,得到兩組酶切連接擴增產(chǎn)物;第一組酶包括EcoRI和HpaII,所述第二組酶包括EcoRI和MspI。兩組的雙酶切產(chǎn)物均可在T4連接酶的作用下與特定的人工合成接頭相連接,形成帶有接頭的特異性片段,從而保證預擴增引物與其退火結合。其中,接頭是雙鏈的寡核苷酸,由核心序列和限制性內(nèi)切酶識別序列二部分組成。人工接頭優(yōu)選5′端去磷酸化,從而保證只有一端可以被連接到酶切片段的末端。所述第一組酶EcoRI和HpaII的雙酶切產(chǎn)物用接頭的序列分別如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示;所述步驟2)中第二組酶EcoRI和MspI的雙酶切產(chǎn)物用接頭的序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

在本發(fā)明中,所述雙酶切和連接接頭在一個體系中進行,所述體系包括:2μL 10×Buffer,0.25μL 12U/μL的EcoRI酶,0.4μL 10U/μL的HpaII或MspI酶,1μL 100μM的EcoRI的接頭,1μL 100μM的HpaII或MspI的接頭,0.5μL 10U/μL的T4DNA連接酶,4μL 100ng/μL的基因組DNA,ddH2O補足至20μL。在本發(fā)明中,所述10×Buffer優(yōu)選含有MgCl2,所述體系的溫度為35~37℃,優(yōu)選為36℃,所述酶切與連接的總反應時間為10~14h,優(yōu)選為12h。

得到兩組酶切連接擴增產(chǎn)物后,分別對兩組酶切連接后的產(chǎn)物依次進行預擴增和選擇性擴增。在本發(fā)明中,所述預擴增用引物的序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。在本發(fā)明中,所述預擴增的反應體系包括:4μL 5×Buffer,1μL 10μM的SEQ ID No.5引物,1μL 10μM的SEQ ID No.6引物,0.3μL 10mM的dNTPs,0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase,任一組所述步驟2)酶切連接后的產(chǎn)物3μL,ddH2O補足至20μL;所述5×Buffer優(yōu)選包括MgCl2,所述預擴增的條件為:94℃預變性5min;94℃30s,56℃30s,72℃80s,30個循環(huán);72℃延伸5min。

得到預擴增產(chǎn)物后,本發(fā)明利用預擴增產(chǎn)物進行選擇性擴增,通過毛細管電泳分離所述選擇性擴增的產(chǎn)物,獲得群體基因組甲基化標記位點。在本發(fā)明中,所述選擇性擴增用引物為:在預擴增用引物的3'端隨機增加3個核苷酸堿基,且5'端進行熒光標記。在本發(fā)明中,所述選擇性擴增的反應體系包括:3μL稀釋20倍后的預擴增產(chǎn)物,4μL 5×Buffer,4μL選擇性擴增的引物,0.3μL 10mM的dNTPs,0.3μL 10U/μL的Go Taq polymerase,ddH2O補足至20μL;所述5×Buffer包括MgCl2,所述選擇性擴增的條件為:94℃預變性3min;首個循環(huán)擴增參數(shù)為94℃30s,65℃30s,72℃80s,將每個循環(huán)的退火溫度依次遞減0.7℃,共擴增13個循環(huán);94℃30s,56℃30s,72℃60s擴增25個循環(huán);72℃延伸5min。

所述選擇性擴增后,本發(fā)明通過毛細管電泳分離所述選擇性擴增的產(chǎn)物,獲得群體基因組甲基化標記位點。通過對比兩組不同雙酶切組合下的擴增結果,根據(jù)對特定識別作用的酶切位點測序,利用毛細管電泳技術就可以確定出全甲基化位點、半甲基化位點與未甲基化位點三種甲基化標記分離類型,隨后進行每個位點的群體甲基化多態(tài)性數(shù)據(jù)收集。

得到群體基因組甲基化標記位點后,本發(fā)明從所述甲基化標記位點中篩選穩(wěn)定的群體多態(tài)性位點,將最小等位頻率<5%的低頻率位點和不存在多態(tài)性位點舍棄。

篩選出在群體內(nèi)符合孟德爾分離的穩(wěn)定遺傳多態(tài)性位點后,采用本領域技術人員熟知的遺傳作圖方法進行甲基化遺傳圖譜構建即可。如利用JoinMap 4.1軟件中的CP(cross pollinator)模型對多態(tài)性DNA甲基化標記進行連鎖分析、確定重組率和標記排列順序,并按照操作流程構建為DNA甲基化標記遺傳圖譜(E-map);利用回歸作圖算法進行標記順序排列;利用Kosambi作圖函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)換成圖距單位cM(centiMorgan),似然比LOD(logarithm of odds)值≥5.0,重組率r<0.30。圖譜連鎖群作圖通過MapChart 2.3完成。

下面結合實施例,對本發(fā)明提供的一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法進行詳細的描述,但是不能將它們理解為對本申請保護范圍的限定。

實施例1

1、本實施例所用的雜交子代群體是以銀腺楊“YX01”(Populus alba×P.glandulosa)為母本,毛白楊雄性優(yōu)良無性系“LM50”(P.tomentosa Carr.)為父本雜交獲取的F1代家系,隨機選取552株作為實驗材料。用利刃剝離植株胸徑處樹皮(大約5cm×5cm),取出小塊木質(zhì)部材料放入液氮中冷凍處理保存,用于基因組DNA的提取。

2、楊樹雜交子F1代群體552株不同基因型個體成熟木質(zhì)部基因組DNA提取采用的是改良的CTAB法。具體包括以下步驟:

1)將含有β-巰基乙醇的CTAB提取緩沖液在65℃條件下水浴預熱;

2)將木質(zhì)部材料于液氮中研磨成粉末,取0.5g粉末迅速移入1.5mL無菌離心管中;

3)向裝有植物材料的離心管中加入800μl的CTAB提取緩沖液,渦旋震蕩10min,置于65℃水浴,每5min輕輕顛倒震蕩1次,40min后,12000r/min離心15min;

4)吸取上清液,冰浴冷卻至室溫,加入等體積的氯仿-異戊醇(24:1)溶液,充分混勻,4℃,12000r/min離心10min;

5)重復步驟4)2~3次,至蛋白層不再出現(xiàn)為止;

6)吸取上清液,加入等體積的異丙醇(-20℃預冷),輕柔混勻,4℃,12000r/min離心10min;

7)取上清液,-20℃沉淀1小時,4℃,12000r/min離心10min;

8)棄去上清液;

9)加入800μl 70%乙醇,輕輕震蕩后置4℃,12000r/min離心30s;

10)重復步驟(9);

11)室溫下倒置離心管自然干燥;

12)用100μl去離子水溶解DNA,于-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

利用NanoVueTM紫外/可見光分光光度計檢測基因組DNA濃度和質(zhì)量(其檢測標準為1.6<OD260/OD280<1.9),通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳后與DNA Marker作對照,根據(jù)條帶的亮度與完整性檢測基因組DNA純度及完整性。3、使用同裂酶HpaII/MspI分別與限制性內(nèi)切酶EcoRI組合對材料基因組DNA分別進行雙酶切,酶切連接由一步法完成。各接頭的終濃度為50μM,接頭在使用前序放置于65℃環(huán)境下加熱10min,冷卻后使用。將冷卻后的接頭分別與兩組酶切產(chǎn)物進行連接,酶切選接體系如下:

第一組酶的雙酶切產(chǎn)物用接頭

EcoRI接頭(100μM) 1μl

HpaII接頭(100μM) 1μl

或第二組酶的雙酶切產(chǎn)物用接頭

EcoRI接頭(100μM) 1μl

MspI接頭(100μM) 1μl

37℃酶切連接過夜。

4、預擴增與選擇性擴增

1)預擴增時,將EcoRI預擴增引物:5'-GACTGCGTACCAATTC-3'、HpaII/MspI預擴增引物:5'-ATCATGAGTCCTGCTCGG-3'溶解稀釋至濃度為10μM后進行預擴增。預擴增反應體系如下:

94℃預變性3min,按以下參數(shù)擴增30個循環(huán):94℃30s,56℃30s,72℃80s,最后72℃延伸5min。

2)選擇性擴增時,將預擴增產(chǎn)物稀釋20倍,選擇性擴增引物(是由預擴增引物3′端增加3個堿基獲得,HpaII/MspI+3為熒光標記引物,序列見表1,溶解稀釋至濃度為10μM后進行選擇性擴增。選擇性擴增反應體系如下:

94℃預變性3min,按下列步驟進行PCR擴增:首個循環(huán)擴增參數(shù)為94℃30s,65℃30s,72℃80s,然后將每個循環(huán)的退火溫度依次遞減0.7℃,共擴增13個循環(huán);最后按下列步驟擴增25個循環(huán):94℃30s,56℃30s,72℃60s。最后72℃延伸5min。

表1選擇性擴增引物序列

本實施例中所用于選擇性PCR擴增的110對引物,是EcoRI引物與HpaII/MspI引物隨機組合獲得。

5、舍棄低頻率的非甲基化位點和不具有多態(tài)性的甲基化位點,利用多態(tài)性甲基化位點進行遺傳圖譜構建。利用JoinMap 4.1軟件對多態(tài)性DNA甲基化標記進行連鎖分析、確定重組率和標記排列順序,在軟件CP(cross pollinator)模型下利用銀腺楊×毛白楊雜交子F1代群體DNA甲基化構建表觀遺傳連鎖圖譜(E-map)?;貧w作圖算法用于進行標記順序排列,Kosambi作圖函數(shù)用于將重組率轉(zhuǎn)換成圖距單位cM(centiMorgan),似然比LOD(logarithm ofodds)值≥5.0,重組率r<0.30。圖譜連鎖群作圖通過MapChart 2.3完成。

最終確定的表觀遺傳連鎖圖譜(E-map)19個連鎖群(LGI-LGXIX)共包含2463個多態(tài)性DNA甲基化標記,每個連鎖群上多態(tài)性DNA甲基化標記的數(shù)目介于64個至203個之間,平均每個連鎖群含有130個標記位點,毛白楊基因組DNA甲基化遺傳圖譜如圖1所示,所有連鎖的標記組成的連鎖群覆蓋毛白楊基因組總長度為2426.7cM。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式,應當指出,對于本技術領域的普通技術人員來說,在不脫離本發(fā)明原理的前提下,還可以做出若干改進和潤飾,這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京林業(yè)大學

<120> 一種林木基因組DNA甲基化遺傳連鎖圖譜的構建方法

<130> 2016

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctcgtagact gcgtacc 17

<210> 2

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aattggtacg cagtc 15

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatcatgagt cctgct 16

<210> 4

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgagcaggac tcatga 16

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactgcgtac caattc 16

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atcatgagtc ctgctcgg 18

當前第1頁1 2 3 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1