本發(fā)明涉及分子生物技術(shù)領(lǐng)域，具體來說是一種精確測量人群端粒長度的方法。

背景技術(shù)：

端粒，是特殊的核蛋白復(fù)合物，由進(jìn)化上保守的串聯(lián)重復(fù)DNA序列TTAGGG組成，位于真核生物染色體末端，在真核細(xì)胞生物學(xué)中起到重要作用。端粒的縮短起到有絲分裂計數(shù)器和壽命限制的作用，能在細(xì)胞水平反應(yīng)器官的衰老。端粒長度的研究，對端粒及端粒相關(guān)疾病甚至腫瘤的研究方面極其重要。端粒長度測量是研究端粒生物學(xué)及端粒功能失調(diào)對退行性疾病影響的重要手段。臨床上，端粒長度測量被廣泛運(yùn)用于診斷端粒相關(guān)疾病，包括心血管疾病、進(jìn)行性肝硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。精確可靠的端粒長度測量對端粒臨床意義的研究極其需要。

目前，常用的測量端粒長度方法還沒有一種能做到精確、容易和快速，且目前所采用的端粒測量方法操作復(fù)雜，要求較高，或需要大量DNA樣本，很難進(jìn)行人群端粒長度的精確測量及比較。末端限制性片段(Terminal Restriction Fragment，TRF)分析法是首次用于檢測端粒長度的方法，被認(rèn)為是端粒測量的黃金標(biāo)準(zhǔn)法(gold standard)，但TRF分析需要大量的DNA(0.5～5μg，≥10⁶個細(xì)胞)，同時，它對基因組的完整性及DNA樣本純度要求較高。熒光原位雜交定量法(Quantitative-fluorescence in situ hybridization，Q-FISH)要求每個樣本中至少有15～20個處于分裂中期的細(xì)胞，才能獲得可靠的端粒長度測量。結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)的熒光原位雜交(Flow-FISH)也用于測量端粒長度，但整個過程較為費(fèi)時，技術(shù)昂貴，且操作要求苛刻。

實(shí)時定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)法測量端粒長度的主要原理是用特異的引物來擴(kuò)增端粒，通過收集熒光估算出端粒的總長度(T)，用單拷貝基因的引物擴(kuò)增單拷貝基因，來估算基因組拷貝數(shù)(S)，根據(jù)T/S比率，估算出每個二倍體基因組中端粒的平均長度。而RT-qPCR最主要的局限在于樣本之間可變性較大，移液過程中誤差大，此外，這個方法還需要進(jìn)行假設(shè)，包括各DNA樣本完整性一致，都為二倍體，核型穩(wěn)定等。對于結(jié)果而言，不同RT-qPCR實(shí)驗所測出的端粒長度也很難進(jìn)行比較。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對背景技術(shù)存在的問題，提供一種精確測量人群端粒長度的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種精確測量人群端粒長度的方法，其特征在于，該測量方法單拷貝基因選用編碼酸性核糖體磷蛋白質(zhì)P0的36B4基因，步驟包括：

(1)人基因組DNA提?。红o脈穿刺取血150～200μl，用血液基因組提取試劑盒提取樣本基因組DNA，同時計算其濃度和純度；

(2)設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)物和引物并合成；

(3)設(shè)計端粒和36B4標(biāo)準(zhǔn)曲線：

①端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)計，根據(jù)引物合成報告書中的分子質(zhì)量MW＝26667.2μg/μmole，阿伏伽德羅常數(shù)Avogadro’s number＝6.02×10²³，端粒標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量MW/Avogadro’s number＝0.44×10^-19g，計算出最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)物Standard A相當(dāng)于有1.14×10¹²kb端粒，稀釋六個端粒標(biāo)準(zhǔn)物A～F(10¹²～10⁷)，最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)物相當(dāng)于含1.14×10⁷kb端粒，端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品的端粒總長度進(jìn)行度量，得出具體數(shù)值；②根據(jù)引物合成報告書中的分子質(zhì)量MW＝23268.15μg/μmole，單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量MW/Avogadro’s number＝0.38×10-¹⁹，計算出最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)物Standard A含20pg的36B4合成物，相當(dāng)于2.63×10⁸個基因組拷貝，稀釋六個36B4標(biāo)準(zhǔn)物A～F(10⁸～10³)，最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)物相當(dāng)于有2630個基因組拷貝，通過單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品的基因組數(shù)量進(jìn)行度量；

(4)RT-qPCR法測量人群端粒長度：樣品體系和標(biāo)準(zhǔn)品體系按Power SYBR Green mastermix(2×)10μl、引物-F 1μl、引物-R1μl、雙蒸水4μl、DNA 4μl，20μl體系；按95℃10min，95℃15s、60℃1min、×40，進(jìn)行PCR反應(yīng)；

(5)數(shù)據(jù)分析：樣本的端?？傞L度和基因組拷貝數(shù)，二者的比率就是樣本的端粒絕對長度。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述標(biāo)準(zhǔn)物包括端粒標(biāo)準(zhǔn)物和36B4標(biāo)準(zhǔn)物，所述端粒標(biāo)準(zhǔn)物序列如SEQ ID No.1所示，所述36B4標(biāo)準(zhǔn)物序列如SEQ ID No.2所示。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，所述引物序列為：

Telo-F CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT

Telo-R GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT

36B4-F CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC

36B4-R CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明在RT-qPCR法的基礎(chǔ)上加入端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線和單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)曲線對T、S值進(jìn)行更準(zhǔn)確度量，以此獲得更準(zhǔn)確的端粒長度，且DNA用量少，僅需60ng，測量速度快，有可比性，能精確的大批量測量出端粒長度，特別適合人群端粒長度測量。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

1、人的基因組DNA提取

靜脈穿刺取血150～200μl，用北京天根血液基因組提取試劑盒進(jìn)行人樣本基因組DNA提取。

取細(xì)胞DNA提取液5μl，加入495μl的三蒸水稀釋500倍，紫外分光光度計測定260nm和280nm波長的OD值，DNA濃度的計算公式如下：

DNA的濃度(μg/μl)＝OD₂₆₀×稀釋倍數(shù)×50/1000

DNA的純度為OD260與OD₂₈₀的比值，當(dāng)OD260/OD280在1.8左右時，說明樣本DNA的純度較高，比值如果大于1.9，說明樣品有RNA污染，比值如果小于1.6，說明樣本有蛋白質(zhì)等污染。

2、設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)物和引物并合成；

3、設(shè)計端粒和36B4標(biāo)準(zhǔn)曲線：

①端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線設(shè)計，根據(jù)引物合成報告書中的分子質(zhì)量MW＝26667.2μg/μmole，阿伏伽德羅常數(shù)Avogadro’s number＝6.02×10²³，端粒標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量MW/Avogadro’s number＝0.44×10^-19g，計算出最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)物Standard A相當(dāng)于有1.14×10¹²kb端粒，稀釋六個端粒標(biāo)準(zhǔn)物A～F(10¹²～10⁷)，最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)物相當(dāng)于含1.14×10⁷kb端粒，端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品的端?？傞L度進(jìn)行度量，得出具體數(shù)值；②根據(jù)引物合成報告書中的分子質(zhì)量MW＝23268.15μg/μmole，單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量MW/Avogadro’s number＝0.38×10^-19，計算出最高濃度的標(biāo)準(zhǔn)物Standard A含20pg的36B4合成物，相當(dāng)于2.63×10⁸個基因組拷貝，稀釋六個36B4標(biāo)準(zhǔn)物A～F(10⁸～10³)，最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)物相當(dāng)于有2630個基因組拷貝，通過單拷貝基因標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品的基因組數(shù)量進(jìn)行度量；

。端粒長度和基因組數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣本中的總端粒長度除以樣本中的總基因組數(shù)，得到樣本中的每個基因組端粒平均長度。

4、RT-qPCR法測量人群端粒長度

(1)引物及標(biāo)準(zhǔn)物按實(shí)驗濃度要求進(jìn)行溶解和稀釋后，-20℃保存，稀釋引物及標(biāo)準(zhǔn)品4℃?zhèn)溆貌怀^1周。

(2)RT-qPCR反應(yīng)體系為：

樣本體系：

為確保實(shí)驗數(shù)據(jù)的穩(wěn)定和準(zhǔn)確，每個樣本都進(jìn)行三次平行重復(fù)實(shí)驗，采用ABI八連管。同時進(jìn)行的端粒標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)體系中，只需將DNA樣本換為標(biāo)準(zhǔn)物，此外，還需要在每個標(biāo)準(zhǔn)物小管中加入質(zhì)粒DNA(E.coli)，以保證標(biāo)準(zhǔn)物小管中的總DNA的量也為20ng。在加樣過程中需要特別小心，避免吸樣和加樣誤差，同時，由于Power SYBR Green含高濃度去垢劑，容易起泡，因此，在取樣和加樣過程中，應(yīng)避免小泡產(chǎn)生以造成誤差。同時，在加樣到八連管的過程中，也要保證混樣均勻，取量精確，避免實(shí)驗誤差的產(chǎn)生。同時，為確保每一板樣本的值有可比性并減少實(shí)驗誤差，需要在每一板中加入陽性對照(已知端粒長度的樣本DNA)和空白對照。

(3)在PCR儀上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線法并準(zhǔn)確設(shè)置好每個標(biāo)準(zhǔn)品的值，將空白對照、陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)物、樣本放入ABI實(shí)時熒光定量PCR儀上，循環(huán)條件為：

95℃10min；95℃15s，60℃1min(40個循環(huán))

5、數(shù)據(jù)分析

反應(yīng)結(jié)束后，檢查陽性對照擴(kuò)增及無擴(kuò)增的陰性對照，觀察標(biāo)準(zhǔn)物和樣品的擴(kuò)增，確保每個目標(biāo)樣品都落在標(biāo)準(zhǔn)曲線生成的直線范圍內(nèi)——任何擴(kuò)增出這條直線范圍的樣品都應(yīng)該在接下來的分析中舍棄。單個樣品都一式三份的分析，并且只有Ct值的標(biāo)準(zhǔn)誤﹤1Ct(CV﹥5％)這個數(shù)據(jù)才能被接受。樣品的標(biāo)準(zhǔn)物要是大于1Ct，那么在接下來的分析中這個數(shù)據(jù)就應(yīng)該被丟棄，并且重新分析。

系統(tǒng)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線給每個樣品分別生成兩個定量值，即每個目標(biāo)樣本的端粒總長度(kb/reaction)和基因組拷貝數(shù)(基因組拷貝數(shù)/reaction)，二者的比率就是樣本的端粒絕對長度(TL/diploid genome，kb)。

本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。

最后所應(yīng)說明的是：以上實(shí)施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。