本發(fā)明涉及一種用于核酸定量檢測的數(shù)字PCR芯片和方法，更確切地說涉及基于表面活性劑改性PDMS的數(shù)字PCR芯片和方法，有望應用于生物學、醫(yī)學及環(huán)境科學等領域。

背景技術：

上世紀90年代后期提出的熒光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR，qPCR)已發(fā)展成為分子生物學領域的一項關鍵技術和常規(guī)技術，極大地推動了生命科學各個領域的發(fā)展。但是，影響PCR擴增效率的因素很多，很難保證實際樣品與標準樣品以及不同樣品之間的擴增效率是否相同，由此導致其定量分析所依賴的基礎—循環(huán)閾值(Cycling Threshold Value，Ct)不是恒定不變的。因此qPCR的定量只是“相對定量”，其準確度和重現(xiàn)性依然不能夠滿足分子生物學定量分析的要求。另外，由于PCR擴增產(chǎn)物對酶催化反應的抑制作用，目前基于PCR技術的基因變異檢測方法對體細胞中低豐度的基因變異的檢測常常無能為力。

20世紀末提出的數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)是一種基于單分子PCR方法來進行計數(shù)的核酸定量方法，是一種絕對定量的方法。主要采用當前分析化學熱門研究領域的微液滴或微陣列方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微液滴或微反應腔中，每個反應器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個。這樣經(jīng)過PCR循環(huán)之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據(jù)相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統(tǒng)定量PCR不同，數(shù)字PCR通過直接計數(shù)的方法，可以實現(xiàn)起始DNA模板的絕對定量。此外，數(shù)字PCR還可以在大量的野生型DNA背景中鑒定出微量突變體的方法。由于數(shù)字PCR技術可以將模板DNA分子事先分隔開來單獨進行擴增，就避免了高豐度等位基因核酸對變異核酸的擴增抑制，因此其在檢測和定量稀有突變方面其靈敏度和準確度是普通PCR和qPCR所無法匹及的。

數(shù)字PCR提出至今，因其絕對定量的獨特優(yōu)勢，其相關技術和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都非常迅速。迄今，已有報道的數(shù)字PCR平臺主要有兩大類：液滴式和陣列式。

最早的液滴式數(shù)字PCR采用油相液相高速混合的方式制備微液滴，制備的液滴尺寸均一性差，后來隨著微流控技術的發(fā)展，利用T型、十字型等微通道水油兩相切割實現(xiàn)了更小體積，更高通量的單分散微液滴數(shù)字PCR平臺。例如已經(jīng)商品化的BioRad公司的QX100^TM微滴式dPCR系統(tǒng)等，但是這些平臺一般都需要液滴產(chǎn)生、收集、轉移、反應、快速讀出分析等步驟，相關儀器操作繁瑣，成本過高，不利于產(chǎn)品和研究的普及。另外液滴易受環(huán)境因素的影響，相互融合，穩(wěn)定性較差。

陣列式數(shù)字PCR平臺發(fā)展至今可大致分為微孔板，集成流路微閥和集成流路微腔結構。微孔板平臺從早期的與傳統(tǒng)qPCR相同的96/384孔板到Life technology公司的OpenArray刻蝕孔板，雖然靈敏度提高，樣品耗量降低，但是人工移液器加樣易產(chǎn)生污染也無法快速精確取樣，若借助自動點樣儀或機械手等設備，又增加了儀器成本，而且較少的液滴分解數(shù)目始終限制了其精度和可測的動態(tài)范圍，應用受限。以微電子技術為基礎的微流控芯片加工技術的發(fā)展實現(xiàn)了微流控芯片的微型化、集成化、迅速高效、耗樣少以及適于現(xiàn)場檢測，令數(shù)字PCR擁有了更大的發(fā)展空間。典型的技術成果包括Fluidigm公司的BioMark^TM系統(tǒng)，系統(tǒng)外接機械泵，加壓控制芯片中的微閥隔斷通道，形成獨立的反應器，屬于在芯片中集成微閥的數(shù)字PCR平臺，但外接泵使芯片操作變得復雜，不利于快速、現(xiàn)場檢測。另外一種集成流路微腔結構，是利用各種設計原理，如玻璃滑片、離心作用、油相阻隔等，實現(xiàn)無閥式微腔，在擁有集成微型、迅速高效等所有優(yōu)勢的同時，更加簡化了操作，是未來數(shù)字PCR技術發(fā)展的趨勢。

PDMS(polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)是一種具有彈性的高分子聚合物，因其成本低，使用簡單，而且具有良好的光學特性，良好的絕緣性，良好的化學惰性以及良好的透氣性等特點，成為一種廣泛應用于微流控等領域的聚合物材料。在數(shù)字PCR領域，PDMS被廣泛用于制作液滴生成芯片，直接在PDMS芯片上進行數(shù)字PCR擴增及分析的例子較少，主要原因是一PDMS透氣性強，易造成樣本揮發(fā)，二是PDMS表面強疏水性，易吸附生物大分子，降低生物反應的效率。

近幾年來也有少數(shù)無閥式微腔PDMS芯片，并直接在片上進行PCR擴增的例子，他們針對PDMS揮發(fā)性問題主要采用兩種方法，旋涂聚對二甲苯或者在芯片上制備循環(huán)水壓力裝置防止揮發(fā)。旋涂聚對二甲苯所需工藝條件較為復雜，一般實驗室無法滿足該條件，且其水蒸氣透過率遠大于玻璃的水蒸氣透過率；而在芯片上制備循環(huán)水壓力裝置一方面大大提高芯片的成本，且增加了芯片制備及數(shù)字PCR反應操控的難度。針對PDMS表面性質(zhì)問題目前的方法主要采用預先充盈BSA進行預封閉或者在PCR預混液中添加BSA和表面活性劑的方式。對基于微管道的數(shù)字PCR芯片預先充盈BSA進行預封閉的方法會因預封閉液去除不凈影響PCR反應液進樣，而在PCR預混液中添加BSA和表面活性劑會影響PCR反應效率，且封閉效果不佳。

本發(fā)明擬提供一種基于表面活性劑改性PDMS、無源進樣和“三明治”封裝結構的薄型數(shù)字PCR芯片及制作方法。本發(fā)明利用PDMS摻雜表面活性劑對PDMS進行改性，克服芯片表面對生物、化學分子的靜電吸附作用，利用PDMS天然空氣泵的特性將液體樣品自動進樣和分割成獨立反應單元，制備薄型PDMS及玻璃-改性PDMS-玻璃夾心結構，達到良好的抗水分揮發(fā)效果，與目前已有的數(shù)字PCR芯片技術相比，成本低，操作簡便，應用前景廣泛。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種基于表面活性劑改性PDMS的數(shù)字PCR芯片、制備方法和應用，建立一種基于PDMS材料的數(shù)字PCR方法，簡化制作方法和樣品操作，降低數(shù)字PCR成本，以利于該技術的推廣運用。

所述的PCR芯片是用一定量表面活性劑摻雜的PDMS材料制備PDMS數(shù)字PCR陣列芯片，利用預脫氣薄型PDMS芯片自身的高空氣溶解特性實現(xiàn)進樣和分配過程，并且制成玻璃-改性PDMS-玻璃的“三明治”夾心結構抑制水分揮發(fā)。

本發(fā)明所述的芯片的制備包括芯片的制備、樣品的自動進樣分離以及PCR擴增。所敘述的芯片制備材料為玻璃可用一般的載玻片或蓋玻片、PDMS、表面活性劑以及礦物油(如液體石蠟等)。具體制作步驟包括：

1.芯片的制備

由于芯片上進行PCR擴增的反應器是一個個獨立的柱形反應腔，所以PCR樣品會與四周的PDMS表面接觸，疏水表面的靜電吸附作用成為抑制PCR擴增的巨大障礙。另外，PDMS的高透氣性特點促使樣品透過其發(fā)生嚴重揮發(fā)，導致擴增失敗。

表面活性劑(surfactant)是一類兩親性分子，一端為親水基團，另一端為疏水基團；親水基團常為極性基團，如羧酸、磺酸、硫酸、氨基或胺基及其鹽，羥基、酰胺基、醚鍵等也可作為極性親水基團；而疏水基團常為非極性烴鏈，如8個碳原子以上烴鏈。表面活性劑在溶液的表面能定向排列，加入少量就能使溶液體系的界面狀態(tài)發(fā)生明顯變化。本發(fā)明先將一定量的表面活性劑混合在PDMS單體中，具體是每100gPDMS單體中摻入0.1～1g表面活性劑，混合均勻，PDMS芯片交聯(lián)固化后，表面活性劑的疏水基團與PDMS結合，親水基團朝向外側在PDMS表面形成一層單分子層，降低表面張力，從而提高表面親水性，減少對生物分子的吸附。這里常規(guī)生物反應中使用的表面活性劑均可，包括Triton 100，Tween 20，span 80或甜菜堿等。

玻璃的水蒸氣透過率5.0×10^-21cm²/(s·mmHg)遠小于聚對二甲苯的水蒸氣透過率2.3×10^-7，所以本發(fā)明直接使用玻璃-薄型PDMS-玻璃的夾心結構，如圖1所示，頂層蓋玻片與底層載玻片的厚度分別為150～570μm，中間為有圖形結構的PDMS芯片，芯片層厚度為0.5～2mm，PDMS底面分布有微通道和微反應腔，下面的PDMS涂層是涂抹在底層載玻片上的，作為微通道和微反應腔的底面，目的是使微通道和微反應腔的底整個封閉環(huán)境保持相同的表面性質(zhì)。該夾心結構有效降低水分揮發(fā)作用，且操作更加簡單。

2.樣品進樣分離

微流控芯片包括進樣、微腔陣列、出樣三個區(qū)域，其中的微腔陣列區(qū)是有微通道銜接各個獨立的柱形反應腔。利用PDMS的高透氣性特點，直接將鍵合在載玻片上的芯片抽真空，取出后，PDMS芯片自身的高負壓可實現(xiàn)液體樣品的自動進樣和跟隨其后的油相對反應腔的自動阻斷隔離，從而形成穩(wěn)定的獨立反應腔室。為降低PDMS側面對樣品的揮發(fā)同時又要使其自身負壓值滿足完整進樣，芯片的厚度必須控制在一定范圍內(nèi)。經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)，設計多個出樣口通道和腔，有利于在出口形成更大的負壓，增大進樣的動力。PDMS芯片厚度約0.5-2mm，能達到無源進樣的效果。

3.PCR擴增

將進樣完畢的芯片平放在具有原位PCR功能的PCR儀上進行擴增，擴增的變性溫度與復性、擴增溫度均與反應腔內(nèi)所包裹PCR混合液的條件相同，或者根據(jù)原位PCR儀的性能進行適當調(diào)整。

本發(fā)明所述的PCR擴增的方法與常規(guī)數(shù)字PCR方法比，耗材成本低，操作簡單，擴增結果易于觀察和統(tǒng)計分析，所需實驗設備一般實驗室即可滿足。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種基于表面活性劑改性PDMS、無源進樣和“三明治”封裝結構的數(shù)字PCR芯片方法。本發(fā)明具有以下先進性：

[1]本發(fā)明在PDMS中摻入表面活性劑，改變了PDMS表面性質(zhì)，減少芯片對酶、核酸、熒光染料等的吸附能力，提高了芯片上PCR擴增效率，提高了檢測結果的信噪比。

由于PDMS材料表面的高疏水性及對非極性物質(zhì)的強吸附性，在生物反應中，一定要對其進行表面修飾。常規(guī)數(shù)字PCR芯片在PCR預反應液里添加表面活性劑，以達到PDMS表面優(yōu)先吸附活性劑，抑制對生物分子的吸附，但是低濃度的表面活性劑很難達到足夠的封閉效果，而高濃度的表面活性劑通常對PCR反應的酶反應會產(chǎn)生抑制作用。所以本發(fā)明人直接將表面活性劑摻雜在PDMS單體中，待其固化后，表面活性劑就會聚集在PDMS表面，以降低表面張力，提高表面親水性，從而減少對生物分子的吸附，保證了實驗的穩(wěn)定性。

[2]簡易玻璃-薄層PDMS-玻璃夾心封裝方法，實現(xiàn)高抗水分揮發(fā)性。

已報道的集成流路微腔數(shù)字PCR芯片的抗揮發(fā)方法一般是在微陣列芯片層上噴涂一層聚對二甲苯防揮發(fā)層，所需工藝條件較為復雜，且它的抗揮發(fā)性能較玻璃弱。本發(fā)明直接利用載玻片和蓋玻片將一薄層PDMS芯片夾在中間，由此，只要控制芯片的厚度，上下兩層玻璃可以達到很好的抗揮發(fā)性，滿足PCR擴增的需要，且操作簡單。

[3]本發(fā)明所涉及的數(shù)字PCR方法與目前數(shù)字PCR芯片技術相比，成本低，操作簡便，與常規(guī)PCR試劑兼容性強，且實驗室常規(guī)試驗設備即可滿足試驗需要。

目前市售的數(shù)字PCR芯片，無論液滴式還是陣列式，多采用特制的儀器設備產(chǎn)生液滴、分孔加樣或加壓產(chǎn)生腔體，擴增后讀取信號，整套設備價格昂貴，非一般實驗室可以承受，不利于數(shù)字PCR技術的普及。本發(fā)明所涉及數(shù)字PCR方法，無需各種外界動力泵實現(xiàn)進樣和分液，數(shù)據(jù)讀取只需一般的熒光顯微鏡即可滿足需要，且芯片材料采用PDMS，成本很低，整個芯片制備方法非常簡單，在同一芯片上完成進樣分離、PCR擴增、結果觀察，有利于推廣數(shù)字PCR技術的應用。

總之，本發(fā)明提供的數(shù)字PCR芯片設計方法降低了PDMS對生物分子的靜電吸附，有效提高了液滴的穩(wěn)定性和抗揮發(fā)性，從而提高了PCR的擴增效率。而且與目前已報道的數(shù)字PCR芯片技術相比，成本低，操作簡便，應用前景非常廣泛。

附圖說明

圖1：數(shù)字PCR微陣列芯片結構。

圖2：液體樣品自動進樣和油相分離過程。

圖3：數(shù)字PCR微陣列芯片檢測EGFR基因的熒光結果。

具體實施方式

下面通過具體的實施例來解釋本發(fā)明的實質(zhì)性的特點和顯著進步，但本發(fā)明決非僅局限于實施例。

實施例1：模具的設計和制作

本發(fā)明在研究了多種芯片腔體形狀、微通道尺寸、鍵合和進樣方式對液體流阻和穩(wěn)定性的影響基礎上，最后發(fā)現(xiàn)微通道銜接柱形腔體，芯片熱鍵合后，利用其自身真空負壓進樣的方式，樣品能快速導入、自動分離，且微反應腔中樣品穩(wěn)定性較好。

芯片結構是由進樣區(qū)、陣列區(qū)及出樣區(qū)三部分組成(見圖1中的PDMS微陣列芯片層)。首先用CAD軟件設計圖案打印掩膜板，然后利用負性光刻膠SU8 3050在硅片上分層制作微管道和微反應腔。進樣區(qū)和出樣區(qū)微管道寬度160微米，盡量令進樣口到達每條主通道的距離相等，從而具有相同的流阻，同樣的設計宗旨應用在出樣區(qū)；此芯片陣列區(qū)微通道尺寸如下，但不僅限于此：主干線寬度80微米，銜接主干線和微腔的支線寬度30微米，柱形微反應腔直徑100微米，腔與腔之間距離為100微米，腔的總數(shù)為10000個，芯片圖形結構的高度為100微米。

實施例2：PDMS芯片的制備

在硅片模具制作完成后，通過軟刻蝕模塑法澆鑄PDMS芯片。首先將PDMS預聚體與固化劑按10:1(質(zhì)量比)混合，攪勻，然后再將該混合物按每100g加入0.1～2.0g表面活性劑(如tween 20、span 80、Triton100或甜菜堿等生物反應中常用的表面活性劑均可)的比例再次混合，攪勻，抽真空除氣，傾倒于上述模具上，另外在載玻片上薄涂一層同樣的混合液PDMS，一起靜置1h，固化后將模具上的PDMS剝離，打孔，將有管道面與涂層后的玻璃涂層面貼合在一起，排出貼面中的空氣，最后將貼合好的PDMS放入85℃的熱板上加熱10min，使其完全鍵合。本發(fā)明將表面活性劑直接摻雜在PDMS單體中，固化后表面活性劑聚集在PDMS表面。

實施例3：液體樣品的自動進樣和微滴陣列的生成

PCR預混液：此處PCR反應液與常規(guī)PCR反應液兼容，所述的PCR反應體系為：20μL預混液中包含10ul Roche 480Probe Premix，各250nM EGFR基因21外顯子上下游引物，200nM TaqMan探針，10ng基因組DNA。

首先制備PCR預混液即樣品，將樣品注入抽真空脫氣后的芯片進樣口，利用抽真空后PDMS芯片自身負壓作用抽吸樣品，樣品順著微通道逐漸注滿微通道及其兩邊的腔體(見圖2：進樣過程)，待所有反應腔中均注滿樣品后，在進樣口注入預先混合的油相，將一小塊脫氣的PDMS空白塊貼在芯片出樣口，為油相的導入提供動力，由于油相與水相界面張力的作用，油相進入微管道，將微管道多余樣品推出并填充微管道，實現(xiàn)微反應腔的分割(見圖2：油相分割過程)，使其成為一個個獨立的反應單元，形成圓形微滴陣列，杜絕了樣品交叉污染，同時摻了PDMS的油相在熱循環(huán)初期即受熱固化在微調(diào)通道內(nèi)，確保了反應液的穩(wěn)定性。在油相順利到達出樣口時，揭掉PDMS塊，用PDMS封閉進樣口及出樣口，并蓋上蓋玻片，防止PCR反應過程中的水分揮發(fā)。

實施例4：PCR擴增

將該芯片立即放入PCR儀上進行在片的原位PCR擴增(in situ PCR)，PCR循環(huán)程序為：95℃10min預變性，94℃15s，60℃30s循環(huán)，15個循環(huán)，94℃15s，58℃30s循環(huán)，25個循環(huán)，共40個循環(huán)。采用熒光顯微鏡觀察結果，CCD照相，計數(shù)熒光信號陽性微腔(見圖3)。可見每個圓柱形反應腔內(nèi)樣本保存完整，EGFR基因陽性模板檢測芯片有少量反應腔內(nèi)發(fā)出明亮的綠色熒光，陰性對照無熒光信號，說明發(fā)出明亮的綠色熒光的反應腔內(nèi)發(fā)生了PCR擴增，其反應結果為陽性。表明該芯片結構和實驗方法能確保樣本的穩(wěn)定性和抗揮發(fā)性，杜絕微反應室間發(fā)生交叉污染，成功實現(xiàn)微反應腔中單個分子的PCR擴增。

實施例5

①如圖1所示，下層的載玻片上預涂一薄層PDMS，該層PDMS與帶有微腔陣列的PDMS層有管道的一面鍵合。芯片管道包括三部分，進樣口區(qū)、微腔陣列區(qū)域和出樣口區(qū)。最后在最上面蓋上一層載玻片或蓋玻片防止水分揮發(fā)。

②如圖2所示，將樣品(黑色)注入抽真空脫氣后的芯片進樣口，在抽真空后PDMS芯片在自身負壓作用下，樣品自動注滿微腔體；然后在進樣口注入預先混合的油相(無色)，油相在負壓作用下進入微管道，并將微管道多余樣品推出并填滿管道，從而實現(xiàn)微反應腔中樣品的分割，使其成為一個個獨立的反應單元，形成圓形微滴陣列。

③如圖3所示，亮綠色圓點為PCR擴增陽性的微腔體，說明微腔體中含有至少一個拷貝的DNA模板；暗綠色圓點為PCR擴增陰性的微腔體，說明其中不含模板。亮綠色圓點的數(shù)量隨著芯片上模板濃度的升高而增多。陰性對照整個芯片未見擴增陽性信號。