本發(fā)明是根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院(NationalInstitutesofHealth)資助的合同(R01AI61739-01)。政府享有本發(fā)明的某些權(quán)利。背景移植器官或組織從供體至宿主患者的移植是某些醫(yī)學(xué)程序和治療方案的特征。雖然努力通過宿主-供體組織配型來避免移植物排斥，但是在供體器官被導(dǎo)入宿主的移植程序中，通常需要免疫遏制療法以維持供體器官在宿主中的活力。然而盡管廣泛使用了免疫遏制療法，器官移植排斥仍可發(fā)生。同種異體移植物組織的急性移植物排斥(AR)是涉及同種異體移植物中同種抗原的T-細胞識別、共刺激信號、活化T細胞對效應(yīng)分子的加工和移植物內(nèi)的炎性反應(yīng)的復(fù)雜免疫反應(yīng)。循環(huán)白細胞的活化和向同種異體移植物的募集是這一過程的關(guān)鍵特征。AR的早期檢測是移植受體(包括腎移植受體)護理中的主要臨床問題之一。腎功能障礙發(fā)作之前的AR檢測允許用積極的免疫遏制成功治療這一病癥。在不具有AR的患者中降低免疫遏制以使藥物毒性最小化也同樣重要。因此，監(jiān)測移植物受體中的AR反應(yīng)，包括預(yù)測、診斷和表征AR，是本領(lǐng)域中關(guān)注的。本發(fā)明滿足了這些和其它需要。發(fā)明概述提供了用于監(jiān)測具有移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應(yīng)，例如以預(yù)測、診斷和/或表征AR反應(yīng)，包括受治療者中的移植物存活的方法。在實踐該主題方法時，評估來自所述受治療者的樣品例如血液或活檢樣品中至少一種基因的表達水平以監(jiān)測受治療者，例如在核酸和/或蛋白水平進行評估。還提供了可用于實踐該主題方法的組合物、系統(tǒng)、試劑盒和計算機程序產(chǎn)品。所述方法和組合物可用于多種應(yīng)用。本發(fā)明的方面包括監(jiān)測已接受移植物(如同種異體移植物)的受治療者的急性排斥(AR)反應(yīng)的方法，所述方法包括：(a)評估來自所述受治療者的樣品中至少一種基因的表達水平以獲得基因表達結(jié)果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組：NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1(也稱為NAMPT)和PSEN1；和(b)采用所述基因表達結(jié)果來在所述受治療者中預(yù)測AR反應(yīng)的發(fā)作、診斷AR反應(yīng)、和/或表征AR反應(yīng)，由此監(jiān)測所述受治療者的AR反應(yīng)。在某些實施方式中，評估上述5種基因的組的所有基因的表達水平。在某些實施方式中，評估步驟還包括評估選自以下的一種或多種的另外的基因的表達水平：CFLAR、RNF-130、IFNGR1、ITGAX和RYBP。在某些實施方式中，評估以上所列的全部10種基因的表達水平。在某些實施方式中，評估步驟包括測定所述樣品的所述至少一種基因的表達產(chǎn)物。在某些實施方式中，所述表達產(chǎn)物是核酸轉(zhuǎn)錄物，而在其它實施方式中，所述表達產(chǎn)物是蛋白。在某些實施方式中，評估步驟包括RT-PCR測定。在某些實施方式中，所述RT-PCR測定是定量RT-PCR測定。在某些實施方式中，所述樣品是血液樣品。在某些實施方式中，所述同種異體移植物是腎同種異體移植物。在某些實施方式中，采用所述基因表達結(jié)果來提前6到3個月預(yù)測AR反應(yīng)的發(fā)生。在某些實施方式中，采用所述基因表達結(jié)果來將AR反應(yīng)表征為類固醇抗性AR反應(yīng)。本發(fā)明的方面包括用于確定AR反應(yīng)中被排斥的組織的身份的方法，所述方法包括評估來自所述受治療者的樣品中選自以下的一種或多種的至少一種基因的表達水平：NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1(也稱為NAMPT)、PSEN1、CFLAR、RNF-130、IFNGR1、ITGAX和RYBP，以獲得基因表達結(jié)果，并采用該基因表達結(jié)果來確定被排斥的組織的身份。這一測試不僅僅適用于許多組織的移植排斥，包括腎、心臟、肝、肺和腸移植物。本發(fā)明的方面包括用于為已接受移植物的受治療者確定免疫遏制方案的方法，所述方法包括：(a)評估來自所述受治療者的樣品中至少一種基因的表達水平以獲得基因表達結(jié)果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組：NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1(也稱為NAMPT)和PSEN1；和(b)采用所述基因表達結(jié)果以為所述受治療者確定免疫遏制方案。在某些實施方式中，評估上述5種基因的組的所有基因的表達水平。在某些實施方式中，評估步驟還包括評估選自以下的一種或多種的另外的基因的表達水平：CFLAR、RNF-130、IFNGR1、ITGAX和RYBP。在某些實施方式中，評估以上所列的全部10種基因的表達水平。本發(fā)明的方面包括用于監(jiān)測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應(yīng)的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：(a)基因表達評估元件，該基因表達評估元件配置為用于評估來自所述受治療者的樣品中至少一種基因的表達水平以獲得基因表達結(jié)果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組：NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1(也稱為NAMPT)和PSEN1；和(b)表型確定元件，該表型確定元件采用所述基因表達結(jié)果來在所述受治療者中預(yù)測AR反應(yīng)的發(fā)作、診斷AR反應(yīng)、和/或表征AR反應(yīng)，由此監(jiān)測所述受治療者的AR反應(yīng)。在某些實施方式中，評估上述5種基因的組的所有基因的表達水平。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件包括用于測定樣品的所述至少一種基因的表達產(chǎn)物的至少一種試劑。在某些實施方式中，所述至少一種基因的表達產(chǎn)物是核酸轉(zhuǎn)錄物，而在其它實施方式中，所述表達產(chǎn)物是蛋白。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件包括所述至少一種基因特異性的PCR引物。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件還配置為用于評估選自以下的一種或多種的另外的基因的表達水平：CFLAR、RNF-130、IFNGR1、ITGAX和RYBP。在某些實施方式中，評估以上所列的全部10種基因的表達水平。在某些實施方式中，所述表型確定元件包括包括所述至少一種基因的參考表達值。本發(fā)明的方面包括用于監(jiān)測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應(yīng)的試劑盒，所述試劑盒包括：(a)基因表達評估元件，該基因表達評估元件用于評估樣品中至少一種基因的表達以獲得基因表達結(jié)果，其中所述至少一種基因選自由以下組成的組：NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1(也稱為NAMPT)和PSEN1；和(b)表型確定元件，該表型確定元件采用所述基因表達結(jié)果來在所述受治療者中預(yù)測AR反應(yīng)的發(fā)作、診斷AR反應(yīng)、和/或表征AR反應(yīng)，由此監(jiān)測所述受治療者的AR反應(yīng)。在某些實施方式中，評估上述5種基因的組的所有基因的表達水平。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件還配置為用于評估選自以下的一種或多種的另外的基因的表達水平：CFLAR、RNF-130、IFNGR1、ITGAX和RYBP。在某些實施方式中，評估以上所列的全部10種基因的表達水平。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件包括對以上所述的一種或多種基因特異的PCR引物對(如用于RT-PCR測定基因表達)。在某些實施方式中，所述基因表達評估元件包括對所述5種基因的組的全部5種基因特異的PCR引物對，而在其它實施方式中，所述基因表達評估元件包括對以上所列的全部10種基因特異的PCR引物對。本發(fā)明的方面包括用于監(jiān)測已接受同種異體移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應(yīng)的計算機程序產(chǎn)品，其中當(dāng)裝載于計算機上時，所述計算機程序產(chǎn)品配置為采用來自從所述受治療者獲得的樣品的基因表達結(jié)果來確定AR監(jiān)測結(jié)果，和以用戶可讀格式向用戶提供所述AR監(jiān)測結(jié)果，其中所述AR監(jiān)測結(jié)果選自在所述受治療者中預(yù)測AR反應(yīng)的發(fā)作、診斷AR反應(yīng)、和/或表征AR反應(yīng)，其中所述基因表達結(jié)果包括選自以下的一種或多種的表達數(shù)據(jù)：NKTR、MAPK9、DUSP1、PBEF1和PSEN1。在某些實施方式中，所述表達結(jié)果包括來自所述5種基因的組的全部基因的表達數(shù)據(jù)。在某些實施方式中，所述表達結(jié)果包括選自以下的一種或多種的另外的基因的表達數(shù)據(jù)：CFLAR、RNF-130、IFNGR1、ITGAX和RYBP。在某些實施方式中，所述表達結(jié)果包括以上所列的全部10種基因的表達數(shù)據(jù)。定義為了方便，將說明書、實施例和所附權(quán)利要求書中采用的某些術(shù)語集于此處?！凹毙耘懦饣駻R”是當(dāng)移植的組織為免疫學(xué)上外源時，組織移植受體的免疫系統(tǒng)的排斥。急性排斥的特征為移植的組織被受體的免疫細胞浸潤，所述免疫細胞執(zhí)行其效應(yīng)功能并破壞移植的組織。急性排斥的發(fā)作是迅速的，并且在人類中通常發(fā)生于移植手術(shù)后幾周內(nèi)。一般而言，可用免疫遏制藥物抑制或遏制急性排斥，所述免疫遏制藥物諸如雷帕霉素、環(huán)孢菌素A、抗-CD40L單克隆抗體和類似藥物?！奥砸浦才懦饣駽R”在人類中一般發(fā)生于移植物移入后數(shù)月至數(shù)年，甚至發(fā)生于存在急性排斥的成功免疫遏制時。纖維化是所有器官移植物類型的慢性排斥中常見的因素。慢性排斥典型地可通過特定器官特征性的一系列具體疾患來描述。例如，在肺移植物中，此類疾患包括氣道的纖維增生性破壞(閉塞性細支氣管炎)；在心臟移植物或心臟組織的移植物中，諸如瓣膜換置術(shù)中，此類疾患包括纖維變性動脈粥樣硬化；在腎移植物中，此類疾患包括梗阻性腎病、腎硬化(nephrosclerorsis)、腎小管間質(zhì)性腎病變；和在肝移植物中，此類疾患包括消失型膽管綜合征。慢性排斥的特征還在于局部缺血性損傷、移植的組織的去神經(jīng)、高脂血癥和與免疫遏制藥物相關(guān)的高血壓。術(shù)語“移植物排斥”涵蓋急性和慢性移植物排斥二者。如本文所用的術(shù)語“嚴格測定條件”指適于產(chǎn)生具有充分互補性的核酸例如表面結(jié)合的核酸和溶液相核酸的結(jié)合對來提供測定中期望的特異性水平，而較不適于在不具有充足的互補性的結(jié)合成員之間形成結(jié)合對來提供期望的特異性的條件。嚴格測定條件是雜交和洗滌條件二者的總和或組合(總體)。在核酸雜交(如陣列雜交、DNA印跡雜交或RNA印跡雜交中)上下文中，“嚴格雜交條件”和“嚴格雜交洗滌條件”是序列依賴性的，并且在不同的實驗參數(shù)下是不同的?？捎糜阼b定本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸的嚴格雜交條件可包括，例如，在包括50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS的緩沖液中在42℃下的雜交，或在包括5×SSC和1％SDS的緩沖液中在65℃下的雜交，二者均以0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下洗滌。示例性嚴格雜交條件還可包括雜在40％甲酰胺、1MNaCl和1％SDS的緩沖液中在37℃下雜交和在1×SSC中在45℃下洗滌?？蛇x地，可采用與過濾器結(jié)合的DNA在0.5MNaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mMEDTA在65℃下的雜交和在0.1×SSC/0.1％SDS中在68℃下的洗滌。另外的嚴格雜交條件包括在60℃或更高和3×SSC(450mM氯化鈉/45mM檸檬酸鈉)下的雜交或在42℃下在含有30％甲酰胺、1MNaCl、0.5％肌氨酸鈉、50mMMES、pH6.5的溶液中的孵育。技術(shù)人員將容易理解，可利用替代但相當(dāng)?shù)碾s交和洗滌條件來提供相似嚴格性的條件。在某些實施方式中，洗滌條件的嚴格性列出了決定核酸是否與表面結(jié)合的核酸特異性雜交的條件。用于鑒定核酸的洗滌條件可包括，例如：約pH7下約0.02M的鹽濃度和至少約50℃或約55℃至約60℃的溫度；或，約0.15MNaCl的鹽濃度，72℃，約15分鐘；或，約0.2×SSC的鹽濃度，至少約50℃或約55℃至約60℃的溫度，約15至約20分鐘；或，用含0.1％SDS的約2×SSC的鹽濃度的溶液在室溫下洗滌雜交復(fù)合體兩次，每次15分鐘，然后用含0.1％SDS的0.1×SSC在68℃下洗滌兩次，每次15分鐘；或等同條件。用于洗滌的嚴格條件還可以是，例如，0.2×SSC/0.1％SDS，42℃。嚴格測定條件的一個具體實例是在65℃下在總單價陽離子濃度為1.5M的基于鹽的雜交緩沖液中旋轉(zhuǎn)雜交(如2000年9月5號提交的美國專利申請第09/655,482號中所述，該專利申請的公開內(nèi)容通過引用并入本文)，然后在室溫下在0.5×SSC和0.1×SSC下洗滌。嚴格測定條件是至少與以上代表性條件同樣嚴格的雜交條件，其中如果與以上具體條件相比，在給定的條件集下大致上沒有另外的缺乏提供期望特異性的足夠互補性的結(jié)合復(fù)合體產(chǎn)生，則認為該給定的條件集是至少同樣嚴格的，其中“大致上不多于”意指少于約5倍多、一般少于約3倍多。其它嚴格雜交條件是本領(lǐng)域已知的，并且在適當(dāng)時也可采用。如本文所用，術(shù)語“基因”或“重組基因”指包括編碼多肽的開放可讀框的核酸，包括外顯子和(任選地)內(nèi)含子序列。術(shù)語“內(nèi)含子”指給定基因中存在的不被翻譯成蛋白質(zhì)的DNA序列，并且一般發(fā)現(xiàn)于DNA分子的外顯子之間。此外，基因可任選地包括其天然啟動子(即，非重組細胞即天然存在的細胞中基因的外顯子和內(nèi)顯子與其可操作地連接的啟動子)和相關(guān)的調(diào)控序列，并可具有或不具有AUG起始位點上游的序列，并且可包括或不包括非翻譯的先導(dǎo)序列、信號序列、下游非翻譯序列、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、多腺苷酸化信號、翻譯起始和終止序列、核糖體結(jié)合位點以及類似序列?！暗鞍拙幋a序列”或“編碼”特定多肽或肽的序列是當(dāng)置于適當(dāng)?shù)恼{(diào)控序列的控制下時，在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄(在DNA的情況下)和翻譯(在mRNA的情況下)成多肽的核酸序列。編碼序列的邊界由5'(氨基)末端的起始密碼子和3'(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列可包括但不限于，來自病毒、原核生物或真核生物mRNA的cDNA、來自病毒、原核生物或真核生物DNA的基因組DNA序列，和甚至合成的DNA序列。轉(zhuǎn)錄終止序列可位于編碼序列的3'。術(shù)語“參考”和“對照”可互換地使用以指觀察值可與之比較的已知值或已知值集。如本文所用的，已知意指該值代表已被理解的參數(shù)，例如，移植物存活或損失表型中標(biāo)志物基因的表達水平。術(shù)語“核酸”包括DNA、RNA(雙鏈或單鏈)、其類似物(如PNA或LNA分子)和衍生物。如本文所用的術(shù)語“核糖核酸”和“RNA”意指主要由核糖核苷酸組成的聚合物。如本文所用的術(shù)語“脫氧核糖核酸”和“DNA”意指主要由脫氧核糖核苷酸組成的聚合物。術(shù)語“mRNA”意指信使RNA?！肮押塑账帷币话阒讣s10個至100個核苷酸長度的核苷酸多聚物，而“多核苷酸”包括具有任何數(shù)量的核苷酸的核苷酸多聚物。本申請中使用的術(shù)語“蛋白”和“多肽”是可互換的?！岸嚯摹敝赴被岬木酆衔?氨基酸序列)，而不涉及該分子的具體長度。因此，多肽的定義中包括肽和寡肽。該術(shù)語也不涉及或包括多肽的翻譯后修飾，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化和類似修飾。包括在該定義中的有，例如，含有一個或多個氨基酸類似物的多肽、具有置換的連接的多肽、以及本領(lǐng)域中已知的其它修飾，包括天然存在的和非天然存在的修飾二者。術(shù)語“評價”和“評估”可互換地使用以指測量的任何形式，并包括確定元件是否存在。術(shù)語“確定”、“測量”、“評價”和“測定”可互換地使用，并包括定量和定性確定二者。評價可以是相對的或絕對的?！霸u價...的存在”包括確定存在的某物的量以及確定該物是否存在。本申請中采用的某些縮寫包括以下：AR：急性排斥；AZA：硫唑嘌呤；BKV：BK病毒；CMV：巨細胞病毒；CSA：環(huán)孢菌素A；DSA：供體特異性抗體；EBV：埃巴病毒；FDR：假發(fā)現(xiàn)率；FK：FK506；HCT：血細胞比容；LRD：活體親屬供體；MMF：麥考酚酸嗎乙酯；PBL：外周血白細胞；PAM：微陣列預(yù)測分析；PRA：板反應(yīng)性抗體；Q-PCR：定量實時聚合酶鏈反應(yīng)；ROC：接收器工作特性；SAM：微陣列顯著性分析；STA：穩(wěn)定的；SNS：NIH-CCTPTU01資助的隨機化多中心兒科腎移植物的患者的基于類固醇對比無類固醇的移植研究(SNS01)；WBC：白細胞。附圖簡述圖1.研究設(shè)計概述。本研究劃分為2個具體部分：在研究的部分1中：我們在3種不同的微陣列平臺，即Affymetrix、Agilent和cDNA陣列上進行了外周血樣品的代表性微陣列分析。通過將轉(zhuǎn)錄物定位至人類基因組織(HUGO)基因名稱比較從3種平臺產(chǎn)生的陣列數(shù)據(jù)。使用共同的顯著性閾值(FDR<10％)，對每個數(shù)據(jù)集進行適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)化程序，然后進行SAM分析以鑒定AR中顯著調(diào)節(jié)的基因。525種基因是跨3種平臺差異表達的AR特異性基因中共同的。選擇32基因-集用于選自用于微陣列的樣品中的34種樣品的初步驗證(驗證集)。在測試的32種基因中，10種最顯著的基因(p<0.03)在42個獨立的樣品(確認集1)中進行進一步確認。使用來自確認集1的5種最顯著的基因的表達產(chǎn)生回歸模型。然后將這一模型應(yīng)用于64個樣品的第二獨立集(確認集2)用于真實的AR分類。在該研究的部分2中，我們對AR之前(preAR；n＝27)和AR之后(postAR；n＝30)收集的配對血液樣品進行縱向5-基因Q-PCR分析，其中將回歸模型應(yīng)用于57個系列AR樣品。圖2.5基因-集的基因表達的驗證和確認。外周血樣品陣列跨共同的525基因-集的聚類顯示樣品按診斷表型聚類。這里顯示了在Affymetrix陣列上運行的59個樣品的聚類(圖2A)；跨在所有3種陣列平臺上差異表達的525種重疊基因觀察到樣品按表型聚類(參見圖5)，而與樣品采集、加工或多個臨床混淆因素?zé)o關(guān)。樣品跨525的基因按表型(AR或STA)聚類。這里僅顯示了在Affymetrix陣列上運行的樣品的代表性聚類數(shù)據(jù)。顯示了選擇的10基因-集的總結(jié)表達，如在其中一種陣列平臺(Affymetrix)上測量的(圖2B)。顯示了全血樣品中的Affymetrix微陣列數(shù)據(jù)的SAM分析的倍數(shù)變化和q評分。顯示了表達Q-PCR樣品的驗證集的同樣10個基因的表達(圖2C)。Q-PCR的倍數(shù)變化是AR和STA樣品之間的平均差異；Q-PCR表達差異的顯著性通過T檢驗確定，其中p<0.05視為顯著的。在血液樣品的獨立確認集(確認集1)中，顯示了最顯著的5個基因的表達。未在陣列分析中使用的新的血液樣品同樣通過跨5種基因的表型(AR或STA)分離(圖2D)。確認集1中使用的樣品的5種基因的倍數(shù)變化和p值顯示于圖2E。圖3.接收器工作特性(ROC)曲線。使用邏輯回歸模型分析，從獨立樣品(確認集1)的5基因Q-PCR表達數(shù)據(jù)產(chǎn)生預(yù)測模型。通過ROC評分＝95.2％顯示該模型的特異性和靈敏度。將回歸模型應(yīng)用于獨立樣品集(確認集2)，其中5基因的表達明顯地將AR與STA分離(非監(jiān)督聚類)，并且當(dāng)與STA比較時，差異表達的5基因在AR中是顯著不同的(p<0.02).圖4.在臨床移植物功能障礙之前通過5基因-集血液采樣預(yù)測急性排斥。將回歸模型應(yīng)用于移植后前兩年的不同時間在STA樣品集的患者中順序采集的樣品(圖4A)，以評估在移植后不同時間預(yù)測為AR的概率。STA樣品分組為在移植后0至3個月內(nèi)、3至6個月內(nèi)、6至12個月內(nèi)和12至24個月內(nèi)采集的樣品。每個血液樣品具有配對的活檢以證實血液樣品采集時移植物中AR的不存在。使用腎移植后不同時間的5基因-集的協(xié)調(diào)表達計算所有STA樣品的AR概率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。如所見的，任何STA樣品在移植后任何時間被預(yù)測為AR的可能性少于50％。存在2個錯誤分類的STA樣品(具有58％的AR概率評分的S99，和具有72％的AR預(yù)測評分的S88；參見圖9)。具有錯誤分類的STA樣品的兩個患者在血液采樣6個月內(nèi)顯示發(fā)展活檢證明的AR。在右圖(圖4B)中，顯示了活檢證明AR時采集的血液樣品、以及在AR樣品之前(preAR)1-3個月內(nèi)和3-6個月內(nèi)采集的樣品(作為協(xié)議樣品采集的一部分)的AR概率的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。如所見的，血液樣品分類為AR的概率(一般為75-100％)與AR的活檢診斷強烈一致。根據(jù)AR診斷強化免疫遏制(類固醇脈沖或抗體)后，AR預(yù)測概率下降，證明5基因-集特征的AR預(yù)測概率通過增強的免疫遏制降低。AR集中所有樣品的AR預(yù)測概率在所有preAR、AR和postAR樣品中顯著高于任何STA樣品(p<0.001)，表明發(fā)展AR的患者可比移植后從未發(fā)展AR的患者具有更高的免疫活化閾值。圖5提供了顯示跨樣品制備(A)或跨不同的微陣列平臺(B)的每個發(fā)現(xiàn)平臺內(nèi)的AR顯著基因和如通過SAM(q<10％)確認的重疊顯著基因的Venn圖。重疊的525基因(標(biāo)雙下劃線的)與STA樣品相比在AR中受到統(tǒng)計學(xué)顯著的(超幾何檢驗；p<0.001)調(diào)節(jié)，并且是AR共有的，不管與不同陣列平臺的雜交是否使用采集外周血的不同方法。圖6A顯示了基因列表和使用Q-PCR測定的基因的ABI探針I(yè)D。圖6B顯示了跨驗證集(17AR、17STA)中的34個血液樣品通過Q-PCR測定的10-基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達值。圖7是參考文獻中指明在AR中差異表達的3個基因的跨驗證集的34個樣品的陣列和Q-PCR的基因表達值的總結(jié)。圖8顯示了通過Q-PCR的跨確認集1中的42個獨立血液樣品(21AR和21STA)的10基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達值。圖9顯示了通過Q-PCR的跨確認集2的64個獨立血液樣品(32AR和32STA)的5基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達值。圖10比較了跨10基因集(上圖)和5基因集(下圖)的AR的不同分類模型。圖11顯示了對所有Q-PCR實驗檢查的18個人口統(tǒng)計學(xué)和臨床混淆因素。圖12顯示了確定圖11中的18個參數(shù)作為5-基因集表達的潛在混淆因素的任何影響的Pearson關(guān)聯(lián)和t-檢驗(如果需要)的結(jié)果。圖13是圖12中的結(jié)果的圖形表示。圖14顯示了活檢Banff等級、小管周C4d陽性和體液與細胞AR和AR預(yù)測概率之間的關(guān)聯(lián)。圖15.圖A顯示AR發(fā)作之前和之后6個月內(nèi)采集的配對樣品的AR預(yù)測概率。圖B顯示比較AR時的AR預(yù)測評分對比preAR和postAR評分的p值。圖C是圖A中的數(shù)據(jù)的圖形表示。圖D是顯示STA樣品中的AR概率的圖。圖E顯示圖D所示的圖中使用的數(shù)據(jù)。圖16顯示使用Ingenuity系統(tǒng)(IPA；2008)的跨3個陣列平臺的重疊525基因的生物學(xué)相關(guān)性分析。圖17是圖16中顯示的信息的圖形表示。圖18顯示交叉引用進行的樣品和測定的表格。具體實施方式描述提供了監(jiān)測具有移植物的受治療者的急性排斥(AR)反應(yīng)，例如以預(yù)測、診斷、和/或表征AR反應(yīng)的方法。在實踐該主題方法中，評估至少一種基因在來自受治療者的樣品例如血液或活檢樣品中的表達水平，例如核酸和/或蛋白水平，以監(jiān)測該受治療者。還提供了在實踐該主題方法中有用的組合物、系統(tǒng)、試劑盒和計算機程序產(chǎn)品。所述方法和組合物可用于多種應(yīng)用。在更詳細地描述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于所描述的具體實施方式，因為這些實施方式當(dāng)然可以變化。還應(yīng)理解，本文使用的術(shù)語僅是出于描述特定實施方式目的，而不意圖限制，因為本發(fā)明的范圍將僅受所附權(quán)利要求的限制。當(dāng)提供值的范圍時，應(yīng)理解該范圍的上限和下限之間的每個中間值(除非上下文另外清楚指明，至下限單位的十分之一)和在所稱范圍內(nèi)的其它聲稱值或中間值涵蓋在本發(fā)明內(nèi)。這些更小范圍的上限和下限可獨立地包括在更小的范圍內(nèi)，并且也涵蓋在本發(fā)明內(nèi)，符合所稱范圍內(nèi)任何特別排除的限值。當(dāng)所稱范圍包括一個或兩個限值時，排除所包括的限值中的任一個或兩個的范圍也包括在本發(fā)明中。某些范圍在本文中呈現(xiàn)時數(shù)值前有術(shù)語“約”。術(shù)語“約”在本文用于提供對其前的準(zhǔn)確數(shù)字、以及接近或近似于該術(shù)語前的數(shù)字的數(shù)字的文字支持。在確定數(shù)字是否接近或近似于具體陳述的數(shù)字時，接近或近似的未陳述的數(shù)字可以是在其所呈現(xiàn)的上下文中，提供所述具體陳述的數(shù)字的實質(zhì)等同的數(shù)字。除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解的含義相同的含義。雖然與本文所描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料也可用于實踐或測試本發(fā)明，但是現(xiàn)在描述了代表性的示例方法和材料。本說明書中引用的所有出版物和專利通過引用并入本文，如同具體和單獨地指明每個單獨的出版物或?qū)＠ㄟ^引用并入，并通過引用并入本文以結(jié)合所引用的出版物公開和描述所述方法和/或材料。任何出版物的引用是因為其在申請日之前公開，而不應(yīng)解釋為承認本發(fā)明沒有資格因為先前的發(fā)明而早于這樣的出版物。另外，所提供的出版日期可能與實際出版日期不同，這可能需要獨立地確認。應(yīng)注意，如本文和所附權(quán)利要求中所用的，除非上下文另外清楚指明，單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。還應(yīng)注意的是，權(quán)利要求可撰寫為排除任何任選的要素。因此，此聲明意圖充當(dāng)結(jié)合引用權(quán)利要求要素使用諸如“僅僅”、“僅”和類似術(shù)語的排除性術(shù)語、或使用“負”限制的先行基礎(chǔ)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員閱讀本公開后將明白的，本文描述和例證的每個單獨實施方式具有離散的組件和特征，這些組件和特征可容易地與其它多種實施方式的任何實施方式的特征分離或組合，而不背離本發(fā)明的范圍或精神。任何所述方法可按所述的事件順序或以邏輯上可行的任何其它順序進行。如上所概括的，本發(fā)明涉及在受治療者中監(jiān)測AR反應(yīng)的方法、以及用于實踐該主題方法的試劑和試劑盒。在進一步描述本發(fā)明時，首先描述了該主題方法，然后綜述了用于實踐該主題方法的試劑和試劑盒。監(jiān)測急性排斥反應(yīng)的方法如以上所綜述的，本發(fā)明提供用于監(jiān)測已接受移植物的受治療者的AR反應(yīng)的方法。在某些實施方式中，監(jiān)測受治療者以預(yù)測是否將發(fā)生AR反應(yīng)，其中所述方法可在AR反應(yīng)發(fā)生前6到3個月預(yù)測AR。在某些實施方式中，監(jiān)測受治療者以確定是否存在持續(xù)的AR反應(yīng)。在某些實施方式中，監(jiān)測受治療者以表征發(fā)生或已發(fā)生的AR反應(yīng)，例如來確定先前的AR反應(yīng)的嚴重度和/或類別，例如AR反應(yīng)是否為/曾為類固醇抗性AR反應(yīng)。在某些實施方式中，本發(fā)明包括確定AR反應(yīng)中被排斥組織的身份的方法。本發(fā)明的方面還包括用于確定已接受移植物例如同種異體移植物的受治療者的免疫遏制方案的方法。因此，本發(fā)明的某些實施方式提供評估，例如以預(yù)測的方式，包括移植物的受治療者中的移植物存活的方法。例如，主題方法可用于確定受治療者是否將發(fā)動針對移植物的AR反應(yīng)，在缺乏有效的免疫遏制干預(yù)下，該AR反應(yīng)將造成移植物組織的喪失。因此，本發(fā)明提供評估移植患者或受治療者中的移植物是將存活或?qū)适У姆椒?。在某些實施方式中，所述方法可被視為確定移植受治療者是否具有移植物存活表型即其中移植物將存活的表型的方法。移植物存活表型是特征為長期移植物存活的存在的表型?！伴L期”移植物存活意指在當(dāng)前取樣之外移植物存活至少約5年，盡管發(fā)生AR的一次或多次先前發(fā)作。在某些實施方式中，確定已發(fā)生至少一次急性排斥(AR)發(fā)作的患者的移植物存活。因此，這些實施方式是確定或預(yù)測AR后的移植物存活的方法。在移植療法例如免疫遏制療法上下文的某些實施方式中，確定或預(yù)測移植物存活，其中免疫遏制療法是本領(lǐng)域已知的。在又其它的實施方式中，提供了確定急性排斥的類別和/或嚴重度(而不僅是其存在)的方法。如移植領(lǐng)域已知的，移植物器官、組織或細胞可以是同種的或異種的，以致移植物可以是同種異體移植物或異種移植物。感興趣的器官和組織包括但不限于：皮膚、心臟、腎、肝、骨髓和其它器官。在實踐主題方法中，測定受治療者或患者樣品，例如細胞或其集合，例如，組織，以監(jiān)測宿主的AR反應(yīng)。因此，主題方法的第一步是從感興趣的患者，即受治療者或患者具有至少一種移植物例如同種異體移植物的患者，獲得合適的樣品。樣品來源于任何初始的合適來源，其中感興趣的樣品來源包括但不限于許多不同的生理來源，例如腦脊液(CSF)、尿、唾液、淚液、組織來源樣品例如勻漿物(諸如移植的組織或器官的活檢樣品(包括但不限于腎、心臟、肺活檢))，和血液或其衍生物。在某些實施方式中，患者樣品的合適的初始來源是血液樣品。因此，這些實施方式的主題測定中采用的樣品一般是血液來源樣品。血液來源樣品可來自全血或其級分，例如血清、血漿、細胞級分等，其中在某些實施方式中樣品來源于從全血收獲的血液細胞。作為樣品來源特別受關(guān)注的是外周血單核細胞/淋巴細胞(PBMC/PBL)?？刹捎毛@得此類樣品的任何方便方案，其中合適的方案是本領(lǐng)域熟知的(如全血樣品的密度梯度分級分離)，并且代表性方案報道于下面的實驗部分。在實踐主題方法中，測定樣品以獲得選自表1的一種或多種基因的表達水平評估，例如表達譜，其中術(shù)語表達譜用于廣泛地包括基因組表達譜，例如感興趣的一種或多種基因的核酸轉(zhuǎn)錄物例如mRNA的表達譜，或蛋白質(zhì)組表達譜，例如一種或多種蛋白的表達譜，其中蛋白/多肽是所述感興趣的一種或多種基因的表達產(chǎn)物。因此，在某些實施方式中，僅評估表1中的1種基因的表達水平。在又其它實施方式中，評估表1中的兩種或更多種基因例如表1中的3、4或全部5種基因的表達水平。在某些實施方式中，還評估表1中列出的那些之外的一種或多種另外的基因的表達水平，其中在某些實施方式中，所述另外的基因選自表2中列出的那些。這里應(yīng)注意的是，包括評估表1和2中的基因的任何組合的表達水平的表達譜可用于監(jiān)測在移入的組織中已發(fā)展或易發(fā)展AR反應(yīng)的受治療者，包括評估表1和2中列出的全部10種基因的表達。表1.表達水平可用于監(jiān)測具有同種異體移植物的受治療者中的AR的5種基因表2.表達水平可用于監(jiān)測具有同種異體移植物的受治療者中的AR的5種另外的基因基因符號基因名稱NCBI基因ID編號CFLAR半胱天冬酶8和FADD-樣凋亡調(diào)節(jié)蛋白8837IFNGR1干擾素γ受體13459ITGAX整連蛋白αX3687RNF130環(huán)指蛋白13055819RYBP環(huán)1和YY1結(jié)合蛋白23429在最廣泛的意義上，表達評估可以是定性的或定量的。因此，當(dāng)檢測是定性的時，該方法提供靶分析物例如核酸或其它表達產(chǎn)物(如蛋白)是否存在于測定的樣品中的讀數(shù)或評估，例如評價。在又其它實施方式中，該方法提供靶分析物是否存在于測定的樣品中的定量監(jiān)測，即評估或評價測定的樣品中靶分析物例如核酸的實際量或相對豐度。在這樣的實施方式中，定量檢測可以是絕對的，或如果所述方法是檢測樣品中兩種或更多種不同的分析物例如靶核酸的方法，定量檢測可以是相對的。因此，當(dāng)用于定量樣品中的靶分析物例如核酸的上下文中，術(shù)語“定量”可指絕對或相對定量。絕對定量可通過包括一種或多種對照分析物的已知濃度并將靶分析物的檢測水平與已知的對照分析物進行參比(如通過產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線)來實現(xiàn)?？蛇x地，相對定量可通過比較兩種或更多種不同的靶分析物的檢測水平或量以提供所述兩種或更多種不同的分析物的每一種的相對定量，例如相對于彼此。此外，相對定量可使用對照或參考樣品確認，如基于陣列的測定以及定量PCR/RT-PCR分析(在下文進一步詳細描述)中通常所進行的。如以上所述，表1和2中顯示了可用于監(jiān)測受治療者的AR反應(yīng)的基因/蛋白、即在已具有、正在具有或?qū)⒕哂蠥R發(fā)作的受治療者中差異表達或以不同水平存在的基因/蛋白。應(yīng)注意，關(guān)于這些表格中的基因，詳細的信息包括準(zhǔn)確的序列信息可通過位于網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov的NCBIEntrez基因數(shù)據(jù)庫確定。然后通過選擇“基因”并搜索這些表格中列出的基因ID編號來獲得每個基因的詳細信息。在某些實施方式中，可測定表1和2中列出的那些之外的另外的基因，這些另外的基因包括表達水平/模式可用于確定AR反應(yīng)的其它基因以及表達水平/模式可用于評估另外的移植特征的基因，所述另外的移植特征包括但不限于：受治療者中的移植物耐受表型、血液中的慢性同種異體移植物損傷(慢性排斥)；免疫遏制藥物毒性或不良副作用，包括藥物誘導(dǎo)的高血壓；與腎病理學(xué)相關(guān)或?qū)е率荏w年齡相關(guān)移植物接受的差異的年齡或體重指數(shù)相關(guān)基因；全血中的免疫耐受標(biāo)志物；可能在移植結(jié)果中起作用的具有免疫調(diào)節(jié)作用的文獻研究中發(fā)現(xiàn)的基因。此外，可評估其它陣列測定功能相關(guān)基因，例如用于評價樣品質(zhì)量(探針位置中的3’-至5’-偏好)、基于活檢的研究中的采樣誤差、細胞表面標(biāo)志物和標(biāo)準(zhǔn)化基因以校準(zhǔn)雜交結(jié)果(這些類別中的示例性基因可見于2006年3月3號提交的美國專利申請第11/375,681號，該申請通過引用整體并入本文)。在某些實施方式中，評估另外的基因以確定已同種異體移植物的受治療者是否具有移植物耐受表型，例如，如2008年8月18日提交的臨時專利申請61/089,805中所述，該專利申請通過引用整體并入本文。移植物耐受表型意指受治療者不排斥已被引入到該受治療者中/上的移植物器官、組織或細胞。換言之，受治療者耐受或維持已移植于其的器官、組織或細胞。檢測的或鑒定的移植物耐受表型的特征是，其是在無免疫遏制療法時發(fā)生的表型，即它存在于未經(jīng)歷免疫遏制療法的受治療者，從而未向宿主施用免疫遏制劑。在這些實施方式中，除了評估表1和2中的一種或多種基因以確定具有同種異體移植物的受治療者中的AR反應(yīng)之外，還評估選自下面的表3和4的一種或多種基因以確定受治療者是否具有移植物耐受表型。表3和4中的基因的任何組合的評估可用于這樣的實施方式中，包括評估表3和4中的一個表格或兩個表格列出的全部基因的表達。表3：表達水平預(yù)測3種不同的受治療者類別(HD對比TOL對比CAN)的28種基因的列表。表4：在3種類別(HD對比SP對比IN)中或向上或向下顯著差異表達的基因列表(24種基因)。在某些實施方式中，獲得的表達譜是基因組或核酸表達譜，其中確定樣品中的一種或多種核酸例如感興趣的基因的核酸轉(zhuǎn)錄物的量或水平。在這些實施方式中，測定以產(chǎn)生診斷方法中采用的表達譜的樣品是為核酸樣品的樣品。核酸樣品包括多種不同核酸或不同核酸的群體，所述不同核酸包括診斷的細胞或組織的感興趣的表型決定基因的表達。核酸可包括RNA或DNA核酸，例如、mRNA、cRNA、cDNA等，只要樣品保留了獲得所述核酸的宿主細胞或組織的表達信息?？梢员绢I(lǐng)域已知的許多不同方式制備樣品，例如通過從細胞中分離mRNA，其中原樣使用所分離的mRNA、擴增所分離的mRNA、采用所分離的mRNA制備cDNA、cRNA等，如差異表達領(lǐng)域已知的。在某些實施方式中，使用標(biāo)準(zhǔn)方案從獲自診斷的受治療者的細胞或組織制備樣品，例如經(jīng)由組織的活檢，其中可產(chǎn)生這類核酸的細胞類型或組織包括其中存在待確定的表型的表達模式的任何組織，包括但不限于外周血淋巴細胞等，如以上所綜述的?？墒褂萌魏畏奖愕姆桨笍某跏己怂針悠樊a(chǎn)生表達譜。雖然已知產(chǎn)生表達譜的許多不同方式，諸如差異基因表達分析領(lǐng)域所采用的那些，但是產(chǎn)生表達譜的一個代表性的和方便的方案類型是基于陣列的基因表達譜產(chǎn)生方案。在某些實施方式中，此類應(yīng)用是其中采用核酸陣列的雜交測定，所述核酸陣列顯示待產(chǎn)生的譜中測定的/表征的每個基因的“探針”核酸。在這些測定中，首先從測定的初始核酸樣品制備靶核酸樣品，其中制備可包括用標(biāo)記物例如信號產(chǎn)生系統(tǒng)的成員標(biāo)記靶核酸。制備靶核酸樣品后，將樣品與陣列在雜交條件下接觸，由此在與連接至陣列表面的探針序列互補的靶核酸之間形成復(fù)合物。然后定性地或定量地檢測雜交的復(fù)合體的存在?？捎糜诋a(chǎn)生主題方法中所用的表達譜的特異性雜交技術(shù)包括描述于美國專利No5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992(這些專利的公開內(nèi)容通過引用并入本文)；以及WO95/21265；WO96/31622；WO97/10365；WO97/27317；EP373203；和EP785280的技術(shù)。在這些方法中，如上所述地將“探針”核酸的陣列與靶核酸接觸，所述陣列包括測定其表達的每個表型決定基因的探針。接觸在雜交條件例如嚴格雜交條件下進行，然后除去未結(jié)合的核酸。所得的雜交核酸的模式提供關(guān)于所探測的每個基因的表達的信息，其中表達信息是關(guān)于基因是否表達，以及通常地以什么水平表達，其中表達數(shù)據(jù)即表達譜(如以轉(zhuǎn)錄組的形式)可以是定性和定量兩方面?？蛇x地，可采用用于定量樣品中的一種或多種核酸的水平的非基于陣列的方法，包括定量PCR、實時定量PCR和類似方法。(有關(guān)實時PCR的一般細節(jié)，參見Real-TimePCR:AnEssentialGuide(實時PCR：基礎(chǔ)指南)，K.Edwards等人編輯，HorizonBioscience，Norwich，U.K.(2004))。當(dāng)表達譜是蛋白表達譜時，可采用任何方便的蛋白定量方案，其中確定樣品中一種或多種蛋白的水平。代表性方法包括但不限于：蛋白質(zhì)組陣列、流式細胞術(shù)、標(biāo)準(zhǔn)免疫測定(如ELISA測定、蛋白質(zhì)印跡)、蛋白活性測定包括多重蛋白活性測定等。從測定的樣品獲得表達數(shù)據(jù)或表達譜之后，分析表達譜。在某些實施方式中，分析包括將表達譜與參考或?qū)φ兆V進行比較以監(jiān)測樣品所獲自/來源于的受治療者的AR發(fā)作。如本文所用的術(shù)語“參考”和“對照”意指用于解釋給定患者關(guān)于AR反應(yīng)的表達特征的基因表達的標(biāo)準(zhǔn)化模式或某些基因的表達水平。參考或?qū)φ兆V可以是獲自已知具有期望表型例如具有AR表型的細胞/組織的譜，并因此可以是正參考或?qū)φ兆V。此外，參考或?qū)φ兆V可以來自已知不具有期望的表型例如AR陰性表型(如STA或非移植的對照)的細胞/組織，并因此是負參考或?qū)φ兆V。在某些實施方式中，將獲得的表達譜與單一參考/對照譜進行比較以獲得關(guān)于AR反應(yīng)的信息。在又其它實施方式中，將獲得的表達譜與兩種或多種不同的參考/對照譜進行比較以獲得關(guān)于測定的細胞/組織的AR表型的更深入的信息。例如，可將獲得的表達譜與正參考譜和負參考譜進行比較以獲得關(guān)于細胞/組織是否具有特定AR表型的確認信息。獲得的表達譜和所述一種或多種參考/對照譜的比較可使用任何方便的方法進行，其中許多方法是陣列領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的，例如通過比較表達譜的數(shù)字圖像、通過比較表達數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫等。描述比較表達譜的方式的專利包括但不限于美國專利第6,308,170和6,228,575號，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。比較表達譜的方法也在以上描述。比較步驟得到關(guān)于獲得的表達譜與對照/參考譜如何相似或不相似的信息，采用所述相似/不相似信息來確定測定的細胞/組織的表型并由此提供監(jiān)測受治療者中的AR的方法。例如，獲得的基因表達譜與來自經(jīng)歷活性AR反應(yīng)的受治療者的對照樣品的基因表達譜的相似性表明測定的細胞/組織是來自經(jīng)歷AR的受治療者。同樣，獲得的基因表達譜與來自不曾具有(或不具有)AR發(fā)作(如STA)的受治療者的對照樣品的基因表達譜的相似性表明測定的細胞/組織來自未經(jīng)歷AR的受治療者。取決于與獲得的表達譜進行比較的參考/對照譜的類型和性質(zhì)，以上比較步驟產(chǎn)生關(guān)于測定的細胞/組織的許多不同類型的信息。因此，以上比較步驟可產(chǎn)生持續(xù)的AR反應(yīng)的正/負確定。在許多實施方式中，使用關(guān)于測定的細胞/組織的以上獲得的信息來預(yù)測受治療者是否將經(jīng)歷AR反應(yīng)，例如，在距收獲樣品的時間3到6個月內(nèi)，和/或來表征AR反應(yīng)，例如AR反應(yīng)是類固醇抗性的或敏感的。在某些實施方式中，AR的確定/預(yù)測可與移植物和其功能的另外特征的確定相聯(lián)合。例如，在某些實施方式中，技術(shù)人員可測定其它移植物相關(guān)的病理學(xué)，例如慢性排斥(或CAN)和/或藥物毒性(DT)(參見，例如2006年3月3日提交的美國專利申請第11/375,681號，其通過引用整體并入本文)。主題方法還可用于藥物基因組學(xué)應(yīng)用。在這些應(yīng)用中，首先根據(jù)本發(fā)明監(jiān)測受治療者/宿主/患者的AR，然后至少部分基于監(jiān)測結(jié)果使用確定的方案進行治療。例如，可使用方案諸如前面章節(jié)中描述的診斷方案評估宿主的AR存在或不存在。然后可使用利用監(jiān)測步驟的結(jié)果確定其合適性的方案治療受治療者。例如，當(dāng)預(yù)測受治療者在接下來3到6個月內(nèi)具有AR反應(yīng)時，可調(diào)節(jié)免疫遏制療法，例如增加或改變藥物，如AR治療/預(yù)防領(lǐng)域已知的。同樣，當(dāng)預(yù)測受治療者沒有目前和近期的AR時，可減少免疫遏制療法以降低DT的可能。在實踐主題方法中，通常在接受移植物或移植體后監(jiān)測受治療者的AR?？稍谝浦步邮芎蠛Y選受治療者一次或連續(xù)篩選受治療者，例如每周一次、每月一次、兩個月一次、半年一次、每年一次等。在某些實施方式中，在AR發(fā)作發(fā)生之前監(jiān)測受治療者。在某些其它實施方式中，在AR發(fā)作發(fā)生之后監(jiān)測受治療者。主題方法可用于許多不同類型的移植受治療者。在許多實施方式中，受治療者在哺乳動物類別內(nèi)，包括以下目：食肉動物(如狗和貓)、嚙齒類動物(如小鼠、豚鼠和大鼠)、兔類(例如兔)和靈長類動物(如人、黑猩猩和猴)。在某些實施方式中，動物或宿主，即受治療者(在本文也稱為患者)是人。所述方法可用于監(jiān)測許多不同類型的移植物。感興趣的移植物包括但不限于：移植的心臟、腎、肺、肝、胰腺、胰島、腦組織、胃、大腸、小腸、角膜、皮膚、氣管、骨、骨髓、肌肉、膀胱或其部分。表型決定基因的表達譜的數(shù)據(jù)庫還提供了AR反應(yīng)的表達譜的數(shù)據(jù)庫。此類數(shù)據(jù)庫將通常包括指示以下的一種或多種的來自移植受體的特定組織的表達譜：近期AR事件(在3到6個月內(nèi))、持續(xù)的AR反應(yīng)、先前的AR反應(yīng)和AR反應(yīng)的特征(如類固醇抗性/敏感的AR反應(yīng))?？梢远喾N介質(zhì)提供表達譜和其數(shù)據(jù)庫以利于其使用(如以用戶可訪問/可讀格式)?！敖橘|(zhì)”指含有本發(fā)明的表達譜信息的產(chǎn)品。本發(fā)明的數(shù)據(jù)庫可記錄在計算機可讀介質(zhì)上，例如可由采用計算機的用戶直接讀取和訪問的介質(zhì)。此類介質(zhì)包括但不限于：磁存儲介質(zhì)諸如軟盤、硬盤存儲介質(zhì)和磁帶；光存儲介質(zhì)諸如CD-ROM；電存儲介質(zhì)諸如RAM和ROM；和這些類別的組合諸如磁/光存儲介質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解目前已知的任何計算機可讀介質(zhì)如何用于創(chuàng)建包括本發(fā)明數(shù)據(jù)庫信息的記錄的產(chǎn)品。“記錄”指使用本領(lǐng)域已知的任何此類方法將信息存儲在計算機可讀介質(zhì)上的過程?？苫谟糜谠L問存儲信息的設(shè)備選擇任何方便的數(shù)據(jù)存儲結(jié)構(gòu)?？墒褂枚喾N數(shù)據(jù)處理程序和格式用于存儲，例如字處理文本文件、數(shù)據(jù)庫格式等。因此，主題表達譜數(shù)據(jù)庫是用戶可訪問的，即數(shù)據(jù)庫文件是以用戶可讀格式(如當(dāng)用戶控制計算機時，計算機可讀格式)保存的。如本文所用，“基于計算機的系統(tǒng)”指用于分析本發(fā)明的信息的硬件設(shè)備、軟件設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲設(shè)備。本發(fā)明的基于計算機的系統(tǒng)的最低硬件包括中央處理單元(CPU)、輸入設(shè)備、輸出設(shè)備和數(shù)據(jù)存儲設(shè)備。熟練的技術(shù)人員可容易理解，目前可用的基于計算機的系統(tǒng)的任何一種適合用于本發(fā)明。數(shù)據(jù)存儲設(shè)備可包括含有如上所述的本發(fā)明信息的記錄的任何產(chǎn)品，或可訪問此類產(chǎn)品的存儲器訪問設(shè)備?？墒褂枚喾N結(jié)構(gòu)格式的輸入和輸出設(shè)備來在本發(fā)明的基于計算機的系統(tǒng)中輸入和輸出信息，例如至和來自用戶。輸出設(shè)備的一種格式將擁有與參考表達譜的不同程度的相似性的表達譜排序。此類呈現(xiàn)形式為技術(shù)人員(或用戶)提供了相似性的排序，并鑒定測試表達譜中包含的與一種或多種參考譜的相似性程度。試劑、系統(tǒng)和試劑盒還提供了用于實踐一種或多種上述方法的試劑、系統(tǒng)和其試劑盒。主題試劑、系統(tǒng)和其試劑盒可有很大不同。感興趣的試劑包括專門設(shè)計用于產(chǎn)生AR表型決定基因的表達譜的試劑，即由一種或多種試劑構(gòu)成的基因表達評估元件。術(shù)語系統(tǒng)指試劑的集合，但是該集合是經(jīng)過編譯的，例如通過從相同或不同來源購買試劑的集合。術(shù)語試劑盒指一起提供例如銷售的試劑的集合。這種試劑的一種類型是代表感興趣的表型決定基因的探針核酸的陣列。許多不同的陣列形式是本領(lǐng)域已知的，其具有各種不同的探針結(jié)構(gòu)、基質(zhì)組成和連接技術(shù)(如點雜交陣列、微陣列等)。感興趣的代表性陣列結(jié)構(gòu)包括描述于以下的那些：美國專利No.5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992(這些專利的公開內(nèi)容通過引用并入本文)；以及WO95/21265；WO96/31622；WO97/10365；WO97/27317；EP373203；和EP785280。在某些實施方式中，陣列包括表1中所列的基因的至少一種的探針。因此，可采用表1中基因的任何組合的探針。因此，在某些實施方式中，陣列上代表的來自表1的基因的數(shù)目是至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少8個或更多，包括表1中所列的全部基因。主題陣列可僅包括表1中所列的那些基因，或它們可包括未列在表1中的另外的基因，諸如表達模式可用于評估另外的移植特征的基因的探針，所述另外的移植特征包括但不限于：血液中的慢性同種異體移植物損傷(慢性排斥)；免疫遏制藥物毒性或不良副作用，包括藥物誘導(dǎo)的高血壓；與腎病理學(xué)相關(guān)或?qū)е率荏w年齡相關(guān)移植物接受的差異的年齡或體重指數(shù)相關(guān)基因；全血中的免疫耐受標(biāo)志物；可能在移植結(jié)果中起作用的具有免疫調(diào)節(jié)作用的文獻研究中發(fā)現(xiàn)的基因；以及其它陣列測定功能相關(guān)基因，例如用于評價樣品質(zhì)量(探針位置中的3’-至5’-偏好)、基于活檢的研究中的采樣誤差、細胞表面標(biāo)志物和標(biāo)準(zhǔn)化基因以校準(zhǔn)雜交結(jié)果；和類似特征。當(dāng)主題陣列包括此類另外的基因的探針時，在某些實施方式中，代表的以及不直接或間接與移植相關(guān)的另外的基因的數(shù)目％不超過約50％，通常不超過約25％。在包括另外的基因的某些實施方式中，集合中的絕大多數(shù)基因是移植表征基因，其中絕大多數(shù)意指至少約75％、通常至少約80％和有時至少約85％、90％、95％或更高，包括其中集合中的基因100％為表型決定基因的實施方式。移植表征基因是表達可用來以某種方式表征移植功能(例如排斥的存在等)的基因。特別定制用于產(chǎn)生表型決定基因的表達譜的另一種類型的試劑是設(shè)計為選擇性擴增此類基因(如使用基于PCR的技術(shù)，例如實時RT-PCR)的基因特異性引物的集合?；蛱禺愋砸锖推涫褂梅椒枋鲇诿绹鴮＠?,994,076號，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。特別感興趣的是具有以下基因的引物的基因特異性引物的集合，所述基因為表1所列的基因的至少1個，通常為這些基因中的多個基因，例如至少2、4、8或更多個。在某些實施方式中，來自表1的所有基因在該集合中具有引物。主題基因特異性引物集合可僅包括表1中所列的那些基因，或它們可包括未列在表1中的另外的基因的引物，諸如表達模式可用于評估另外的移植特征的基因的探針，所述另外的移植特征包括但不限于：血液中的慢性同種異體移植物損傷(慢性排斥)；免疫遏制藥物毒性或不良副作用，包括藥物誘導(dǎo)的高血壓；與腎病理學(xué)相關(guān)或?qū)е率荏w年齡相關(guān)移植物接受的差異的年齡或體重指數(shù)相關(guān)基因；全血中的免疫耐受標(biāo)志物；可能在移植結(jié)果中起作用的具有免疫調(diào)節(jié)作用的文獻研究中發(fā)現(xiàn)的基因；以及其它陣列測定功能相關(guān)基因，例如用于評價樣品質(zhì)量(探針位置中的3’-至5’-偏好)、基于活檢的研究中的采樣誤差、細胞表面標(biāo)志物和標(biāo)準(zhǔn)化基因以校準(zhǔn)雜交結(jié)果；和類似特征。當(dāng)主題陣列包括此類另外的基因的探針時，在某些實施方式中，代表的以及不直接或間接與移植相關(guān)的另外的基因的數(shù)目％不超過約50％，通常不超過約25％。在包括另外的基因的某些實施方式中，集合中的絕大多數(shù)基因是移植表征基因，其中絕大多數(shù)意指至少約75％、通常至少約80％和有時至少約85％、90％、95％或更高，包括其中集合中的基因100％為表型決定基因的實施方式。本發(fā)明的系統(tǒng)和試劑盒可包括上述陣列和/或基因特異性引物集合。所述系統(tǒng)和試劑盒還可包括各種方法中采用的一種或多種另外的試劑，諸如用于產(chǎn)生靶核酸的引物、dNTP和/或rNTP，其可以是預(yù)混合的或單獨的，一種或多種獨特標(biāo)記的dNTP和/或rNTP，諸如生物素化的或加Cy3或Cy5標(biāo)簽的dNTP、具有不同散射譜的金或銀顆粒，或其它合成后標(biāo)記試劑，諸如熒光染料的化學(xué)活性衍生物，酶，諸如反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和類似酶，各種緩沖介質(zhì)例如雜交和洗滌緩沖液，預(yù)制造的探針陣列、標(biāo)記的探針純化試劑和組分，像旋轉(zhuǎn)柱等，信號產(chǎn)生和檢測試劑，例如鏈霉親和素-堿性磷酸酶軛合物、化學(xué)熒光或化學(xué)發(fā)光底物和類似試劑。主題系統(tǒng)和試劑盒還可包括表型確定元件，在許多實施方式中，該元件是可采用的參考或?qū)φ毡磉_譜，例如通過合適的計算設(shè)備來基于“輸入”表達譜，例如已使用上述基因表達評估元件確定的表達譜，確定AR表型。代表性的表型確定元件包括如以上所述的表達譜例如參考或?qū)φ兆V的數(shù)據(jù)庫。除了以上組分之外，主題試劑盒還將包括用于實踐主題方法的說明。這些說明可以多種形式存在于主題試劑盒，其中的一種或多種可存在于試劑盒。這些說明可存在的一種形式是作為合適介質(zhì)或基質(zhì)上的打印信息，例如其上打印了信息的一張或多張紙、在試劑盒的包裝中、在包裝插入物中等。另一種工具可能是其上已記錄了信息的計算機可讀介質(zhì)，例如磁盤、CD等?？纱嬖诘牧硪还ぞ呤蔷W(wǎng)址，其可用于經(jīng)由互聯(lián)網(wǎng)訪問移動站點上的信息。任何方便的工具可存在于試劑盒中。通過例證方式提供下列實施例，而不意在限制。實驗實施例I方法研究設(shè)計收集此研究中提供外周血樣品的所有受體的患者人口統(tǒng)計學(xué)和臨床數(shù)據(jù)。不同研究集(驗證集、確認集1和確認集2)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差數(shù)據(jù)提供于圖11和表1(下面)。在每個樣品集內(nèi)，AR和STA表型具有匹配的人口統(tǒng)計學(xué)。為了詢問基于血液的基因用于AR診斷的表現(xiàn)而不考慮移植后的時間，故意選擇樣品研究集具有不同的平均移植后時間。表1該研究作為3個項目的總和進行(圖1)：在第一個項目中，我們進行了以2.5ml全血樣品(n＝106)或以5ml血液(n＝16)收集以分離外周血白細胞(PBL)的122個外周血樣品的橫向微陣列分析7。在單一時間點收集血液樣品，同時進行活檢，其中證實急性排斥10存在(60個AR樣品)或不存在(62STA樣品)。用于陣列雜交的樣品制備按照生產(chǎn)商的建議方案進行。將樣品與3個微陣列平臺之一雜交：Affymetrix(n＝75，54KHGU133Plus2陣列)、Agilent(n＝26，44K全人基因組寡核苷酸陣列)或LymphochipcDNA陣列(n＝21，32KcDNA克隆)。對每個陣列平臺應(yīng)用適當(dāng)?shù)奶结槞z測和標(biāo)準(zhǔn)化方法。樣品制備、陣列雜交和分析11121314的細節(jié)在補充方法(參見下文)中提供。所有微陣列數(shù)據(jù)文件是在登錄號GSE14067下在GEO中可獲得的。在第二個項目中，進行Q-PCR分析以驗證和確認選自項目1的陣列研究的基因。使用TaqMan基因表達測定產(chǎn)品(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)通過Q-PCR測量每個血液樣品中選擇的候選基因的信使RNA的表達。選擇32個基因用于先前用于微陣列的34個樣品(17AR、17STA；驗證集)中的Q-PCR驗證(參見補充方法/Q-PCR候選基因選擇標(biāo)準(zhǔn))，留下足夠數(shù)量和質(zhì)量的殘留RNA。在32個基因中，選擇10個最顯著的基因用于在42個獨立樣品(21AR、21STA；確認集1)和另外的64個獨立樣品(32AR、32STA；確認集2)上的確認。我們對獲自確認集1的10基因-集表達值應(yīng)用了多種分類模型15，包括線性判斷分析、5種不同的Bayesian模型、多層感知和邏輯回歸(多項式和線性)模型。使用確認集1建立這些模型中的每一個，并在確認集2上進行測試以評估它們的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。使用10基因-集中的5個基因的多項式邏輯回歸模型產(chǎn)生了最佳的總體表現(xiàn)。10基因中每個基因的引物列表、它們的相應(yīng)ABI探針I(yè)D、10個最顯著的基因通過Q-PCR的表達和使用的所有分類模型的比較均提供在圖7至10。在第三個項目中，我們對已系列采集外周血樣品的40名患者應(yīng)用用于AR預(yù)測建模的5-基因AR診斷模型，所述外周血樣品是在AR發(fā)作之前(preAR；n＝27樣品)和/或之后(postAR；n＝30樣品)采集的。對在AR發(fā)作之前1至6個月采集的配對的preAR血液樣品進行縱向5-基因Q-PCR分析以估計AR損傷的預(yù)測，甚至在移植物功能未受到擾動時。這些是研究中未與移植物活檢配對的僅有的樣品。對AR發(fā)作治療后1至6個月采集的postAR樣品(與用來隨訪AR解析的移植物活檢配對)進行相似的分析以詢問強化的免疫遏制對5基因-集特征的影響(圖1)。使用5-基因集的第一邏輯回歸模型顯示于以下方程中：使用最低5-基因集的第二邏輯回歸模型顯示于以下方程中：使用基于Stanford樣品的最低5-基因集的邏輯回歸模型顯示于以下方程中：在以上每個方程中，θ是給定的樣品屬于分類(AR或STA)之一的預(yù)測概率?；诮邮掌鞴ぷ魈匦?ROC)曲線，選擇閾值θ＝0.5用于最佳靈敏度和特異性，以確定預(yù)測類別為AR或STA表型。在確認集1中測試該模型，然后在確認集2中重新確認真實的AR分類。通過在測試集(確認集2)評估靈敏度、特異性、正預(yù)測值(PPV)和負預(yù)測值(NPV)來評價模型的準(zhǔn)確性。最后，在確認該模型用于AR診斷的穩(wěn)健性之后，使用該模型對在AR之前和之后順序采集的配對的血液樣品預(yù)測AR概率。統(tǒng)計學(xué)和生物信息學(xué)分析使用學(xué)生t-檢驗建立AR和STA樣品之間Q-PCR基因表達差異的顯著性。假發(fā)現(xiàn)率(FDR)<10％的所有差異視為統(tǒng)計學(xué)顯著的。按以下18個人口統(tǒng)計學(xué)和臨床變量對加工用于Q-PCR確認研究的所有樣品采集數(shù)據(jù)：移植后時間、受體年齡、受體性別、供體性別、供體來源、供體年齡、采樣時的巨細胞病毒/CMV、埃巴病毒/EBV和BK病毒/BKV病毒血癥、并發(fā)的細菌感染、供體特異性抗體(DSA)或板反應(yīng)性抗體(PRA)的存在、誘導(dǎo)療法的使用、維持類固醇使用、不同神經(jīng)鈣蛋白抑制劑藥物(FK506或環(huán)孢菌素A/CSA)的使用、不同抗代謝物(麥考酚酸嗎乙酯/MMF或硫唑嘌呤/AZA)的使用、血液采集時的白細胞(WBC)計數(shù)和血細胞比容(HCT)水平(圖11)。SNSO1樣品的數(shù)據(jù)通由PPD(DavidIkle)提供。如果需要，使用Pearson關(guān)聯(lián)和t-檢驗以確定所述的18種參數(shù)作為潛在的混淆因素對5-基因集的表達的任何影響(圖12)。由于大多數(shù)樣品具有用于評估的配對活檢，根據(jù)Banff評分等級(1＝Banff評分≤1A；2＝Banff評分≥1B)將樣品劃分為2組；對于C4d+，確定是否≥10％小管周毛細血管(PTC)具有C4d沉積物(圖14)?？缙脚_525基因集的生物學(xué)意義使用以下來評估：PANTHER分類系統(tǒng)(http://www.pantherdb.org)和Ingenuity途徑分析(IPA；http://www.ingenuity.com)(參見圖16和17)。更多的信息提供于補充方法。結(jié)果通過跨平臺微陣列分析的外周血中的AR顯著基因通過將共同的和重疊的轉(zhuǎn)錄物定位至人類基因組織(HUGO)基因名稱，交叉比較了從3個陣列平臺產(chǎn)生的微陣列數(shù)據(jù)。因為每個陣列使用不同的基因集，這些基因集使用不同的探針I(yè)D表示，我們使用AILUN(http://ailun.stanford.edu)12來用現(xiàn)在的HUGO基因名稱重新注釋探針標(biāo)識符(ID)，這鑒定了所有3個平臺共有的10,357個共同基因。我們對3個重新注釋的陣列列表中的每一個應(yīng)用具有假發(fā)現(xiàn)率<10％的共同顯著性閾值的監(jiān)督的、二類別非配對微陣列顯著性分析(SAM11)分析。我們鑒定了在AR中顯著差異表達的Affymetrix陣列上的9710個基因、Agilent陣列上的8642個基因和cDNA陣列上的2805個基因。雖然每個平臺上有大量顯著性基因，但是在所有3個平臺上僅有525個基因差異表達(圖5)，而與血液樣品采集程序無關(guān)。Q-PCR驗證和確認(確認集1)選擇32個基因用于已在陣列研究中也使用的34個樣品(17AR、17STA)的初始Q-PCR驗證。根據(jù)這一數(shù)據(jù)，10個最顯著的基因(q<10％)在42個獨立血液樣品(確認集1；21AR、21STA)中進一步確認。這10個最顯著的基因的表達倍數(shù)變化與陣列數(shù)據(jù)一致、具有相同方向的倍數(shù)變化并且Q-PCR比微陣列具有更高的信號(圖1)，并且通過10-基因集的Q-PCR表達數(shù)據(jù)的非監(jiān)督聚類，樣品分離為AR或STA表型(圖2)。每個基因和每個樣品的單獨表達數(shù)據(jù)顯示于圖6B。對于從AR文獻中選擇的3個基因，F(xiàn)OXP316和GRZYB1718Q-PCR表達在AR中與在STA血液樣品中相比增加(分別為p＝0.001、p＝0.03)(圖7)，即使這些基因不在Affymetrix微陣列的顯著性基因列表中，并且在cDNA和Agilent平臺上，PFN119和GRZYB二者在AR中相反分別是下調(diào)的，通過Q-PCR在AR和STA樣品之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。因此這3個基因無一用于進一步的交叉確認研究。交叉確認(確認集2)和用于AR分類的預(yù)測建模顯示測試的10種分類模型(詳細見圖10)的最佳表現(xiàn)的多項式邏輯回歸模型得到了具有高置信度的用于AR預(yù)測的最低5基因模型，當(dāng)對確認集2的64個獨立樣品的Q-PCR數(shù)據(jù)進行檢驗時，ROC評分＝95.2％。5基因-集表達顯示優(yōu)異的AR和STA類別分離(圖3)，具有高AR預(yù)測評分，100％靈敏度、93.6％特異性、94.1％正預(yù)測值(PPV)和100％負預(yù)測值(NPV)。僅有的錯誤分類涉及2個STA樣品。兩個錯誤分類的STA樣品在該研究初始采樣后4和7個月發(fā)展臨床AR，暗示5基因-檢驗的AR預(yù)測可能比預(yù)測模型估計的更為穩(wěn)健。評估用于AR診斷的5基因-集的人口統(tǒng)計學(xué)、臨床和活檢混淆因素為檢查是否任何基線或采樣時的人口統(tǒng)計學(xué)、臨床或免疫遏制混淆因素可驅(qū)動5基因-集AR預(yù)測評分的分離，計算對18種不同的混淆因素(圖11)采集的數(shù)據(jù)的Pearson關(guān)聯(lián)系數(shù)，顯示對5基因-集的表達沒有混淆效應(yīng)(最大值|r|＝0.27)(圖12和13)。通過t-檢驗，DUSP1和PSEN1在具有陽性DSA的患者中具有更高表達(p<0.01)。相似地，我們還檢查了排斥的等級或類型對5基因-集的表達是否有影響(圖14)。未發(fā)現(xiàn)5基因-集AR概率預(yù)測和Banff評分(r＝-0.13)、體液對比細胞排斥(r＝0.07)和小管周C4d+的存在或不存在(r＝0.2)之間的關(guān)聯(lián)(圖14)。這些數(shù)據(jù)支持5基因-集在外周血中的協(xié)同表達可以高置信度診斷AR，而與患者特征和通常使用的免疫遏制選擇、排斥時間或潛在的排斥損傷機制無關(guān)。在移植物功能障礙和臨床指示的活檢之前預(yù)測AR損傷我們將基于橫向樣品建立的AR回歸模型應(yīng)用于27個preAR血液樣品(在活檢證明AR發(fā)作之前、在任何臨床移植物功能障礙之前1至6個月順序采集)，作為移植后系列血液采樣方案的一部分。另外，還通過Q-PCR對在移植后1、3、6、12和24個月的活檢方案時采集的、來自不曾具有任何AR的58個獨特STA患者的70個系列血液樣品進行譜分析以用于5基因-集的AR預(yù)測。如圖4所示，在移植后不同時間點采集的STA樣品的5-基因特征保持“靜止”，具有低AR預(yù)測評分并且表達評分隨移植后時間幾乎沒有變化(圖4A)。但是，在AR患者組(圖4B；preAR、AR和postAR患者)中，5基因-集的表達水平在排斥患者中處于顯著(p<0.001)更高的水平(所有AR患者中>50％AR預(yù)測評分，對比所有STA患者<20％)，即使是在AR發(fā)作前6個月。這一發(fā)現(xiàn)表明，經(jīng)歷AR發(fā)作的患者在移植后在其外周血中具有可在臨床相關(guān)和活檢證明的AR發(fā)作之前定量測量免疫活化譜。值得注意的是，排斥發(fā)作3個月內(nèi)檢查的血液樣品的AR預(yù)測評分與AR時采集的樣品是相等的(圖4B)，提供了潛在的窗口用于免疫遏制強化以減輕或治療早期AR和/或發(fā)起更早的活檢。當(dāng)在AR時強化免疫遏制治療時(在此研究中為類固醇推注或胸腺細胞免疫球蛋白)，存在5-基因特征在接下來3個月的快速遞減，而無論AR治療藥物如何(圖4B)。圖15提供了每組樣品的平均AR概率及標(biāo)準(zhǔn)偏差和計算的肌酸酐清除20。討論移植活檢是目前AR診斷的黃金標(biāo)準(zhǔn)，但是受其侵入性本質(zhì)、難于獲得多個樣品和經(jīng)常僅在晚期組織損傷和臨床移植物功能障礙存在鑒定AR的限制。目前沒有可靠的血液測試可用于診斷和預(yù)測AR，因為許多臨床混淆因素(包括全血樣品中珠蛋白基因的過度表現(xiàn))驅(qū)動表達變化7，并且在過去，穩(wěn)健的基于血液的AR生物標(biāo)志物鑒定已受到小樣品量、實驗差異7、并發(fā)感染和組織排斥損傷的潛在分子異質(zhì)性1的阻礙。如以上所展示的，我們已鑒定了其在移植患者樣品(如外周血)中的表達評估可用于監(jiān)測AR反應(yīng)的高度嚴格的基因-集。這一基因集評估方法證明了跨多種不同的混淆因素的準(zhǔn)確性，所述混淆因素諸如樣品制備、受體和供體人口統(tǒng)計學(xué)、受體年齡、移植后時間、免疫遏制使用或并發(fā)感染的差異。我們已在152個獨立血液樣品中確認了用于非侵入性AR診斷的最低5基因集。5-基因集的表達足夠以高置信度水平在甚至臨床移植物功能障礙之前3個月預(yù)測活檢證明的AR。另外，與在非排斥者中相比，5-基因集的表達在排斥者中在活檢證明AR發(fā)作之前多達7個月是差異調(diào)節(jié)的，表明5基因-集在血液中的差異調(diào)節(jié)可用作免疫活化和將來AR風(fēng)險評價的尺度。因為5基因特征“標(biāo)準(zhǔn)化”為與具有強化免疫遏制的非排斥者STA患者中所見的那些更接近的水平，所以此基因-集的系列測量可充當(dāng)免疫“晴雨表”以定義個體患者的免疫活化閾值來在臨床移植物功能障礙許多個月之前預(yù)測AR。這是朝向移植受體中的個性化免疫遏制方案的重要且關(guān)鍵的步驟。參考文獻1.SarwalM，ChuaMS，KambhamN等人MolecularheterogeneityinacuterenalallograftrejectionidentifiedbyDNAmicroarrayprofiling(通過DNA微陣列譜分析鑒定的急性腎同種異體移植物排斥中的分子異質(zhì)性).NEnglJMed2003；349(2):125-38.2.FlechnerSM，KurianSM，SolezK等人Denovokidneytransplantationwithoutuseofcalcineurininhibitorspreservesrenalstructureandfunctionattwoyears(未使用神經(jīng)鈣蛋白抑制劑的新腎移植在兩年時保持腎結(jié)構(gòu)和功能).AmJTransplant2004；4(11):1776-85.3.KurianSM，F(xiàn)lechnerSM，KaoukJ等人Laparoscopicdonornephrectomygeneexpressionprofilingrevealsupregulationofstressandischemiaassociatedgenescomparedtocontrolkidneys(腹腔鏡檢查供體腎切除術(shù)基因表達譜分析揭示與對照腎相比應(yīng)激和缺血相關(guān)基因的上調(diào)).Transplantation2005；80(8):1067-71.4.MorgunA，ShulzhenkoN，Perez-DiezA等人Molecularprofilingimprovesdiagnosesofrejectionandinfectionintransplantedorgans(分子譜分析改善了移植的器官中排斥和感染的診斷).CircRes2006；98(12):e74-83.5.HotchkissH，ChuTT，HancockWW等人Differentialexpressionofprofibroticandgrowthfactorsinchronicallograftnephropathy(慢性同種異體移植物腎病中促纖維化因子和生長因子的差異表達).Transplantation2006；81(3):342-9.6.ParkW，GriffinM，GrandeJP，CosioF，StegallMD.Molecularevidenceofinjuryandinflammationinnormalandfibroticrenalallograftsoneyearposttransplant(移植后一年正常的和纖維化的腎同種異體移植物中損傷和炎癥的分子證據(jù)).Transplantation2007；83(11):1466-76.7.LiL，YingL，NaesensM等人Interferenceofglobingeneswithbiomarkerdiscoveryforallograftrejectioninperipheralbloodsamples(珠蛋白基因的干擾以及外周血樣品中用于同種異體移植物排斥的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)).PhysiolGenomics2008；32(2):190-7.8.DengMC，EisenHJ，MehraMR等人Noninvasivediscriminationofrejectionincardiacallograftrecipientsusinggeneexpressionprofiling(使用基因表達譜分析的心臟同種異體移植受體中排斥的非侵入性判斷).AmJTransplant2006；6(1):150-60.9.GwinnerW.Renaltransplantrejectionmarkers(腎移植物排斥標(biāo)志物).Worldjournalofurology2007；25(5):445-55.10.RacusenLC，SolezK，ColvinRB等人TheBanff97workingclassificationofrenalallograftpathology(腎同種異體移植物病理學(xué)的Banff97工作分類).KidneyInt1999；55(2):713-23.11.EfronB，TibshiraniR.Empiricalbayesmethodsandfalsediscoveryratesformicroarrays(用于微陣列的經(jīng)驗bayes方法和假發(fā)現(xiàn)率).GenetEpidemiol2002；23(1):70-86.12.ChenR，LiL，ButteA.AILUN:reannotatinggeneexpressiondataautomatically(AILUN：自動化重新注釋基因表達數(shù)據(jù)).NatureMethods2007；4(11):InPress.13.Perez-IratxetaC，AndradeMA.Inconsistenciesovertimein5％ofNetAffxprobe-to-geneannotations(5％NetAffx探針-至-基因注釋中隨時間的不一致).BMCBioinformatics2005；6:183.14.HarbigJ，SprinkleR，EnkemannSA.Asequence-basedidentificationofthegenesdetectedbyprobesetsontheAffymetrixU133plus2.0array(AffymetrixU133plus2.0陣列上的探針集檢測的基因的基于序列的鑒定).NucleicAcidsRes2005；33(3):e31.15.WittenIH，F(xiàn)rankE.DataMining:Practicalmachinelearningtoolsandtechniques(數(shù)據(jù)挖掘：實用機器學(xué)習(xí)工具和技術(shù)).第2版SanFrancisco:MorganKaufmann；2005.16.LiB，HartonoC，DingR等人Noninvasivediagnosisofrenal-allograftrejectionbymeasurementofmessengerRNAforperforinandgranzymeBinurine(通過測量尿中穿孔素和粒酶B的信使RNA的腎同種異體移植物排斥的非侵入性診斷).NEnglJMed2001；344(13):947-54.17.DugreFJ，GaudreauS，Belles-IslesM，HoudeI，RoyR.Cytokineandcytotoxicmoleculegeneexpressiondeterminedinperipheralbloodmononuclearcellsinthediagnosisofacuterenalrejection(急性腎排斥診斷中在外周血單核細胞中確定的細胞因子和細胞毒性分子基因表達).Transplantation2000；70(7):1074-80.18.SimonT，OpelzG，WieselM，OttRC，SusalC.SerialperipheralbloodperforinandgranzymeBgeneexpressionmeasurementsforpredictionofacuterejectioninkidneygraftrecipients(用于預(yù)測腎移植物受體中的急性排斥的系列外周血穿孔素和粒酶B基因表達測量).AmJTransplant2003；3(9):1121-7.19.VasconcellosLM，SchachterAD，ZhengXX等人Cytotoxiclymphocytegeneexpressioninperipheralbloodleukocytescorrelateswithrejectingrenalallografts(外周血白細胞中的細胞毒性淋巴細胞基因表達與排斥的腎同種異體移植物相關(guān)).Transplantation1998；66(5):562-6.20.SchwartzGJ，HaycockGB，EdelmannCM，Jr.，SpitzerA.Asimpleestimateofglomerularfiltrationrateinchildrenderivedfrombodylengthandplasmacreatinine(身高和血漿肌酸酐得出的兒童腎小球濾過率的簡單估計).Pediatrics1976；58(2):259-63.補充方法患者和樣品來自274名兒科和青少年腎同種異體移植物受體的274個獨特的外周血樣品采集于StanfordUniversity(n＝193)和其它SNS01中心(n＝81)(2002年至2007年)。所有血液樣品是在匹配的臨床指示的或方案移植物活檢時獲得的，所述活檢用于將樣品分類為急性排斥(AR；n＝109)1，或如果不存在AR或其它顯著的病變，則是穩(wěn)定的(STA，n＝108)。在將所有樣品包括到此研究之前，由單一病理學(xué)家(NK)重新評估所有樣品來證實急性排斥的診斷。在用于排斥的治療強化之前獲得AR樣品。還在AR前(preAR，n＝27)和在AR后(postAR，n＝30)采集另外57個序列樣品，并且還從STA患者的子集(n＝70)中采集系列移植后血液樣品。從所有受治療者獲得書面知情同意書。該研究得到StanfordInstitutionalReviewBoard和每個SNSO1中心的InstitutionalReviewBoard批準(zhǔn)。樣品采集、RNA提取、微陣列靶標(biāo)制備和雜交外周血樣品以全血(n＝106)或外周血白細胞(PBL；n＝16)形式采集。所有SNSO1樣品作為全血采集；來自Stanford的樣品在2002-2004年間是作為PBL采集的，而在2004-2007年間是作為全血或PBL采集的。對于從全血中提取的總RNA，2.5ml外周血采集在PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytiX，Qiagen)中，并使用PAXgene血液RNA試劑盒(PreAnalytiX，Qiagen)處理。對于從白細胞提取的RNA，5-10ml全血采集在肝素鈉管中。通過以離心初步分離白細胞和裂解紅細胞而回收白細胞2。使用RNeasyMidi試劑盒(QiagenInc，Valencia，CA)提取RNA。RNA濃度使用ND-1000(NanoDropTechnologies，Wilmington，DE)測量，并使用Agilent2100Bioanalyzer利用RNANanoChips(AgilentTechnologies，SantaClara，CA)評價RNA的完整性。RNA儲存于-80℃直至進一步用于微陣列和Q-PCR。用于Affymetrix和Agilent陣列雜交的樣品制備使用T7方案進行(T7)，該方案采用通過使用T7-Oligo(dT)引物的單循環(huán)cRNA合成。對于Affymetrix陣列，根據(jù)生產(chǎn)商的建議，總計2μg總RNA用于合成cRNA作為最終產(chǎn)物。cRNA與HumanGenomeU133Plus2.0陣列(AffymetrixInc.SantaClara，CA)雜交。根據(jù)生產(chǎn)商的建議，100ng總RNA用于Agilent陣列雜交。擴增的和純化的cRNA摻入有Cy5染料(測試樣品)或Cy3-染料(與cDNA陣列中使用的相同的共同參考)，將兩種標(biāo)記的樣品的混合物應(yīng)用到AgilentWholeHumanGenomeOligo微陣列44k或4x44k上。含有32,000cDNA克隆(12,400個已知的獨特基因)的cDNA微陣列3使用成熟的方案進行處理，針對共同參考(來自多個腫瘤系的RNA池)在每個通道中使用2μgRNA。使用GenePix4000(AxonInstruments，UnionCity，CA)掃描雜交的Affymeterix和cDNA微陣列，并用GenePixPro軟件包分析熒光圖像。通過使用AgilentDNA微陣列掃描儀掃描Agilent載玻片?；虮磉_譜分析使用不同的標(biāo)準(zhǔn)進行不同陣列平臺的探針檢測。對于AffymetrixHG133plus2.0陣列，在計算和測量探針?biāo)綇姸群唾|(zhì)量后，使用dChip軟件(DNA-ChipAnalyzer，www.dchip.org)將原始陣列數(shù)據(jù)Quartile-Quartile標(biāo)準(zhǔn)化，包括中值強度、探針集異常值百分比和單一探針異常值百分比。對于Agilent44k，對至少一種陣列應(yīng)用log2紅色通道/綠色通道>0.5的絕對值截留；數(shù)據(jù)在GeneSpring中標(biāo)準(zhǔn)化。對于LymphochipcDNA陣列，使用通道1強度/介質(zhì)背景強度的平均值>1.5，和/或通道2強度/介質(zhì)背景強度的標(biāo)準(zhǔn)化平均值)>1.5。數(shù)據(jù)在StanfordMicroarray數(shù)據(jù)庫(Stanford)標(biāo)準(zhǔn)化。所有基因表達值轉(zhuǎn)化為log2以用于進一步分析?；趯⑥D(zhuǎn)錄物(探針集)定位至人類基因組織(HUGO)基因名稱來定位跨所有平臺的獨特基因。定量實時PCR(Q-PCR)用于Q-PCR的探針選自AppliedBiosystems(ABI)的每個基因的RefseqID。所用的探針的列表顯示于圖6A。首先從11μl的500ng總RNA轉(zhuǎn)錄cDNA，在1μl10mMdNTP和1μl300ng/μl隨機六聚體中在65℃下變性15min。將7μlQ-PCR混合物[4μl5×結(jié)合緩沖液、1μl0.1MDTT、1μlSuperScriptIIIRT(Invitrogen)、1μlRNaseOUT(Invitrogen)]添加到最終20μl的變性RNA管。RT反應(yīng)在PCR熱循環(huán)儀中進行，在50℃持續(xù)60min，72℃持續(xù)15min，然后加入1μlRNaseH，在37℃持續(xù)30min，以將剩余的RNA模板消化掉。Q-PCR按照生產(chǎn)商的方案進行，但有改動。將cDNA稀釋至1.25ng/μl。定量RT-PCR反應(yīng)在384-孔板在含有4μlcDNA(5ng)、1μlTaqMAN探針和5μl2x基因表達主混合物緩沖液(ABI，F(xiàn)osterCity，CA)的10μl體積中進行。Q-PCR反應(yīng)按生產(chǎn)商建議的循環(huán)條件(95℃，10min；40個循環(huán)：95℃，15s，60℃，30s)在ABI7700序列檢測儀(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)中運行。使用比較CT方法計算RNA表達的相對量。將表達值對平板上的18S核糖體RNA和對照樣品(StratageneUniversalRNA)標(biāo)準(zhǔn)化。研究設(shè)計該研究作為3個項目的總和進行(圖1)：在第一個項目中，我們進行了以PAXgeneTM血液RNA管(PreAnalytiX，Qiagen)中的2.5ml全血樣品(n＝106)或以肝素鈉管中的5ml血液(n＝16)收集以分離外周血白細胞(PBL)的122個外周血樣品的橫向微陣列分析。對于此分析，在與其中急性排斥被確認為存在(60AR樣品)或不存在(62STA樣品)的活檢匹配的單一時間點采集血液樣品。將樣品與3個微陣列平臺之一雜交：Affymetrix(n＝75，54KHGU133Plus2陣列)、Agilent(n＝26，44K全人基因組寡核苷酸陣列)或LymphochipcDNA陣列(n＝21、32KcDNA克隆)。通過將共同的和重疊的轉(zhuǎn)錄物定位至人類基因組織(HUGO)基因名稱，交叉比較了從3個陣列平臺產(chǎn)生的微陣列數(shù)據(jù)。使用微陣列顯著性分析(SAM，4)以假發(fā)現(xiàn)率(FDR)<10％的共同顯著性閾值鑒定每個平臺上的顯著性基因列表。我們鑒定了在所有3個平臺上在AR中顯著差異表達的525個共同基因。在第二個項目中，選擇32個基因用于先前用于微陣列的34個樣品(驗證集)中的Q-PCR驗證。在通過Q-PCR測試的32個基因中，選擇最顯著的10個基因用于在42個獨立樣品(確認集1)和另外的64個獨立樣品(32AR、32STA；確認集2)上的進一步確認。我們對確認集1中的10基因-集應(yīng)用了多種分類模型，包括線性判斷分析、5種不同的Bayesian模型、多層感知和邏輯回歸(多項式和線性)模型。將這些模型中的每一個應(yīng)用于64個樣品的獨立集(確認集2)以評估它們的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度。使用10基因-集中的5個基因的多項式邏輯回歸模型產(chǎn)生了最佳的總體表現(xiàn)。在第三個項目中，我們對已系列采集外周血樣品的30名患者應(yīng)用5-基因AR診斷模型以預(yù)測AR，所述外周血樣品是在AR發(fā)作之前(n＝27樣品)和之后(n＝30樣品)采集的。對在AR發(fā)作之前1至6個月采集的配對的preAR血液樣品進行縱向5-基因Q-PCR分析以估計AR損傷的預(yù)測，甚至在移植物功能未受到擾動時。這些是研究中未與移植物活檢配對的僅有的樣品。對AR發(fā)作治療后1至6個月采集的樣品(與用來隨訪AR解析的移植物活檢配對)進行相似的分析以詢問強化的免疫遏制對5基因-集特征的影響(圖1)。項目1–跨多個微陣列平臺發(fā)現(xiàn)AR特異性基因跨3個微陣列平臺的外周血樣品基因表達譜分析在274個獨特外周血樣品中，103個獨特樣品(47AR，56STA)與來自3個不同平臺的122個微陣列的(60AR，62STA)雜交。在這103個外周血樣品中，75個在AffymetrixHGU133plus2.0微陣列、26個在Agilent微陣列且21個在cDNA微陣列上雜交。出于質(zhì)量控制目的，17個樣品在2個或多個平臺上雜交。對于在1個以上平臺上雜交的樣品，代表性跨平臺關(guān)聯(lián)如下所示：在cDNA和Agilent之間，r＝0.6；在Affymetrix和Agilent之間，r＝0.8(參見圖18中顯示的樣品和測定的交叉參考)。微陣列顯著性分析我們應(yīng)用微陣列顯著性分析(SAM4)來鑒定所有3個平臺上差異表達的AR基因。在SAM分析之前，將基因表達值轉(zhuǎn)化為log2。假發(fā)現(xiàn)率(FDR)<10％用作所有平臺的閾值。使用此閾值，我們鑒定了在AR中顯著差異表達的Affymetrix陣列上的5285個基因、Agilent陣列上的8642個基因和cDNA微陣列上的2805個基因(圖5)。因為每個陣列平臺使用不同的基因集，這些基因集使用不同的探針I(yè)D表示，我們使用AILUN(http://ailun.stanford.edu)5來用現(xiàn)在的Entrez基因ID重新注釋探針標(biāo)識符(ID)。使用Entrez基因ID，我們鑒定了在所有3個平臺上差異表達的525個基因(圖5)。在同一FDR下，當(dāng)與Affymetrix和Agilent平臺相比時，cDNA平臺顯示具有最少數(shù)目的顯著性AR基因(數(shù)據(jù)未顯示)。雖然這些研究顯示仔細選擇的表型的跨平臺陣列比較是鑒定基因特異性特征的有力方法，但是跨所有平臺的一部分重疊基因顯示跨3個平臺的相反的倍數(shù)變化，表明跨陣列平臺的克隆ID可能存在潛在的問題67。本研究中選擇用于確認的最可靠的基因是跨3個平臺具有相同的倍數(shù)變化的那些。除了從微陣列分析中選擇候選基因用于確認之外，我們包括了叉頭框P3(FOXP3)、穿孔素(PFN1)和粒酶B(GRZYB)8910，因為之前報道這些基因在血液中在AR下是增加的。項目2–通過Q-PCR驗證和確認AR特異性基因用于Q-PCR的候選基因選擇標(biāo)準(zhǔn)本研究第二個項目的目的是使用Q-PCR證實從第一個項目獲得的結(jié)果，并鑒定可用于AR特異性血液生物標(biāo)志物的進一步確認研究的更小的基因集。我們基于以下標(biāo)準(zhǔn)從525個重疊基因中選擇了32個基因：i)12個基因被選擇作為跨所有3個平臺的生物學(xué)相關(guān)并且差異表達的基因(上調(diào)的基因：IFNGR1、RNF130、PBEF1、ITGAX、RYBP、CFLAR、PSEN1；下調(diào)的基因：NKTR、GOLGA8A、IL32、MCM7和NFATC3)，ii)17個基因被選擇為在至少2個平臺上以倍數(shù)變化>1.5和q<3％生物學(xué)相關(guān)并且差異表達(上調(diào)的基因：DUSP1、SLP1、IL8RAP、STAT3、F2RL1、FCGR1A、IL6R、PTPRC、STAT1、IL1RAP、TLR8、TNFAIP6；下調(diào)的基因：MAPK9、PHLDA1、PTPN11、ZP70、PLCG1)，iii)基于先前公布的關(guān)于其作為基于血液的AR生物標(biāo)志物的潛能的數(shù)據(jù)選擇3個基因；穿孔素或PFN111，粒酶B或GRZYB1011和叉頭框P3基因、FOXP38。通過Q-PCR的驗證使用TaqMan基因表達測定產(chǎn)品(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)在34個樣品中(驗證集；17AR、17STA)證實32個基因在AR中的表達。這些樣品先前已在一種或多種陣列上運行，并基于剩余樣品具有足夠的RNA數(shù)量和質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)來選擇樣品。用于10個基因的每個基因的引物列表和它們相應(yīng)的ABI探針I(yè)D提供于圖6A。10個最顯著的基因的表達顯示于圖6B。對于每個基因，當(dāng)使用基因組DNA作為模板時，這些測定沒有產(chǎn)生熒光信號，這證實了所述測定僅測量mRNA。核糖體RNA18s用作內(nèi)源性RNA和cDNA質(zhì)量對照。選擇18s作為對照基因是基于在陣列實驗中該基因跨AR樣品以及在AR和STA樣品之間具有恒定的基因表達。為了控制在不同日期進行的PCR之間的可能變異，在每次Q-PCR運行中還在UniversalHumanReferenceRNA評價所有基因的表達。測定是高度可重復(fù)的，對于在UniversalHumanReferenceRNA評價的每個基因，6次運行的變異系數(shù)小于0.18。Q-PCR在384-孔板中進行，每個基因表達測量以兩個重復(fù)進行。使用比較CT方法計算RNA表達的相對量。除了確認微陣列結(jié)果之外，項目2的另一目的是細化可用于確認為獨立患者樣品中的AR生物標(biāo)志物的更小的嚴格基因集的選擇。我們從通過Q-PCR確認的32個基因中選擇了10個最顯著的基因。使用學(xué)生t-檢驗建立通過Q-PCR的AR和STA樣品之間的基因表達差異的顯著性。對于p<0.05，所有差異均視為統(tǒng)計學(xué)顯著的。接下來在42個獨立樣品(確認集1；21AR，21STA)中通過Q-PCR確認這10個基因在AR中的顯著表達差異(圖8)。用于AR的分類建模為了證實血液AR診斷中最低基因集的最佳分類模型，我們對10-基因集12應(yīng)用了10種不同的分類模型。所用的分類模型包括經(jīng)由回歸的分類(ClassificationViaRegression)、Bayesian模型的變體(NaiveBayes、MultinomialNaiveBayes、BayesNet等)、多層感知、邏輯回歸(多項式和線性)和序列最小優(yōu)化(sequentialminimaloptimization)。使用確認集1的Q-PCR數(shù)據(jù)訓(xùn)練這些模型中的每一個，并使用來自64個獨立樣品(確認集2；32AR、32STA)的Q-PCR數(shù)據(jù)對其進行重新確認(圖9)。在10個分類模型中，使用5個基因(DUSP1、MAPK9、NKTR、PBEF1、PSEN1)的多項式邏輯回歸模型表現(xiàn)最好(靈敏度＝100％、特異性＝93.8％、PPV＝94.1％1、NPV＝100％)。圖10提供了使用的所有分類模型的比較。使用5-基因集的第一邏輯回歸模型顯示于以下方程中：使用最低5-基因集的第二邏輯回歸模型顯示于以下方程中：使用基于Stanford樣品的最低5-基因集的邏輯回歸模型顯示于以下方程中：在以上每個方程中，θ是預(yù)測的概率?；诮邮掌鞴ぷ魈匦?ROC)曲線，選擇截斷θ＝0.5來確定預(yù)測類別為AR或STA表型。查詢?nèi)丝诮y(tǒng)計學(xué)和臨床混淆因素對5基因-集的影響對用于Q-PCR確認研究的所有處理樣品采集18種人口統(tǒng)計學(xué)和臨床變量的數(shù)據(jù)。SNSO1樣品的數(shù)據(jù)由PPD(BrandonGraham，JasonBerg，DavidIkle)提供。研究了下列18種變量：移植后時間、受體年齡、受體性別、供體性別、供體來源、供體年齡、采樣時的巨細胞病毒/CMV、埃巴病毒/EBV和BK病毒/BKV病毒血癥、并發(fā)的細菌感染、供體特異性抗體(DSA)或板反應(yīng)性抗體(PRA)的存在、誘導(dǎo)療法的使用、維持類固醇使用、不同神經(jīng)鈣蛋白抑制劑藥物(FK506或環(huán)孢菌素A/CSA)的使用、不同抗代謝物(麥考酚酸嗎乙酯/MMF或硫唑嘌呤/AZA)的使用、血液采集時的白細胞(WBC)計數(shù)和血細胞比容(HCT)水平(圖11)。計算Pearson關(guān)聯(lián)系數(shù)以確定18種不同的臨床參數(shù)作為潛在的混淆因素對5-基因集表達的任何影響(圖12)。該分析顯示，用于AR診斷的5基因-集的表達不受檢查的18種混淆因素中任何一種的影響(最大|r|＝0.27)。另外，對于具有分類值的13種臨床混淆因素(受體性別、供體性別、供體來源、無類固醇對比基于類固醇、CMV病毒血癥、EBV病毒血癥、BK病毒血癥、細菌感染、DSA、PRA、誘導(dǎo)療法的使用與否、FK506對比CSA的使用、MMF對比AZA的使用)進行t-檢驗。查詢AR嚴重度(BANFF評分)、AR類型(體液或細胞排斥)、AR時的小管周C4d陽性對5基因-集表達的影響接下來，檢查Banff評分、活檢時的小管周C4d+/-和體液或細胞排斥的存在、和用于AR診斷的5-基因集表達之間的任何相關(guān)性。因為大多數(shù)樣品具有用于評估的配對活檢，根據(jù)Banff評分等級(1＝Banff評分≤1A；2＝Banff評分≥1B)將樣品分成2組；對于C4d+，確定是否≥10％小管周毛細血管(PTC)具有C4d沉積物。未發(fā)現(xiàn)5基因-集的AR概率預(yù)測和Banff評分(r＝-0.13)、體液對比細胞排斥(r＝0.07)和小管周C4d+的存在或不存在(r＝0.2)之間的關(guān)聯(lián)(圖14)。項目3–在所示的移植物活檢和移植物功能障礙之前通過5基因-集預(yù)測AR損傷本研究中第三個項目的目的是測試具有5-基因集的模型是否可在任何移植物功能障礙或所示的活檢之前預(yù)測AR的發(fā)作。我們將我們的回歸模型應(yīng)用于在活檢證明的AR發(fā)作之前和之后1到6個月順序采集的樣品。所述樣品分組成以下類別：i)AR發(fā)作之前3到6個月采集的樣品，ii)AR之前0到3個月采集的樣品，iii)AR時采集的樣品，iv)AR發(fā)作后0到3個月采集的樣品，v)AR發(fā)作后3到6個月采集的樣品。提供了每組樣品的平均AR概率及標(biāo)準(zhǔn)偏差和計算的肌酸酐清除13。5基因-集的生物學(xué)相關(guān)性分析為了檢查可影響AR中外周轉(zhuǎn)錄組的關(guān)鍵生物學(xué)過程，我們使用PANTHER分類系統(tǒng)(http://www.pantherdb.org)將525個跨平臺AR特異性基因-集應(yīng)用于生物學(xué)相關(guān)性分析。這些分子途徑表明，關(guān)鍵途徑中的活躍蛋白質(zhì)運輸/轉(zhuǎn)運和脂類代謝參與免疫、細胞周期、凋亡和分化。Ingenuity途徑分析(http://www.ingenuity.com)顯示這些基因驅(qū)動參與凋亡的經(jīng)典途徑并受JAK/STAT途徑的調(diào)節(jié)(圖16)。補充方法的參考文獻1.RacusenLC，SolezK，ColvinRB等人TheBanff97workingclassificationofrenalallograftpathology(腎同種異體移植物病理學(xué)的Banff97工作分類).KidneyInt1999；55(2):713-23.2.LiL，YingL，NaesensM等人Interferenceofglobingeneswithbiomarkerdiscoveryforallograftrejectioninperipheralbloodsamples(珠蛋白基因的干擾以及外周血樣品中用于同種異體移植物排斥的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)).PhysiolGenomics2008；32(2):190-7.3.SarwalM，ChuaMS，KambhamN等人MolecularheterogeneityinacuterenalallograftrejectionidentifiedbyDNAmicroarrayprofiling(通過DNA微陣列譜分析鑒定的急性腎同種異體移植物排斥中的分子異質(zhì)性).NEnglJMed2003；349(2):125-38.4.EfronB，TibshiraniR.Empiricalbayesmethodsandfalsediscoveryratesformicroarrays(用于微陣列的經(jīng)驗bayes方法和假發(fā)現(xiàn)率).GenetEpidemiol2002；23(1):70-86.5.ChenR，LiL，ButteA.AILUN:reannotatinggeneexpressiondataautomatically(AILUN：自動化重新注釋基因表達數(shù)據(jù)).NatureMethods2007；4(11):InPress.6.Perez-IratxetaC，AndradeMA.Inconsistenciesovertimein5％ofNetAffxprobe-to-geneannotations(5％NetAffx探針-至-基因注釋中隨時間的不一致).BMCBioinformatics2005；6:183.7.HarbigJ，SprinkleR，EnkemannSA.Asequence-basedidentificationofthegenesdetectedbyprobesetsontheAffymetrixU133plus2.0array(AffymetrixU133plus2.0陣列上的探針集檢測的基因的基于序列的鑒定).NucleicAcidsRes2005；33(3):e31.8.LiB，HartonoC，DingR等人Noninvasivediagnosisofrenal-allograftrejectionbymeasurementofmessengerRNAforperforinandgranzymeBinurine(通過測量尿中穿孔素和粒酶B的信使RNA的腎同種異體移植物排斥的非侵入性診斷).NEnglJMed2001；344(13):947-54.9.DugreFJ，GaudreauS，Belles-IslesM，HoudeI，RoyR.Cytokineandcytotoxicmoleculegeneexpressiondeterminedinperipheralbloodmononuclearcellsinthediagnosisofacuterenalrejection(急性腎排斥診斷中在外周血單核細胞中確定的細胞因子和細胞毒性分子基因表達).Transplantation2000；70(7):1074-80.10.SimonT，OpelzG，WieselM，OttRC，SusalC.SerialperipheralbloodperforinandgranzymeBgeneexpressionmeasurementsforpredictionofacuterejectioninkidneygraftrecipients用于預(yù)測腎移植物受體中的急性排斥的系列外周血穿孔素和粒酶B基因表達測量).AmJTransplant2003；3(9):1121-7.11.VasconcellosLM，SchachterAD，ZhengXX等人Cytotoxiclymphocytegeneexpressioninperipheralbloodleukocytescorrelateswithrejectingrenalallografts(外周血白細胞中的細胞毒性淋巴細胞基因表達與排斥的腎同種異體移植物相關(guān)).Transplantation1998；66(5):562-6.12.WittenIH，F(xiàn)rankE.DataMining:Practicalmachinelearningtoolsandtechniques(數(shù)據(jù)挖掘：實用機器學(xué)習(xí)工具和技術(shù)).第2版SanFrancisco:MorganKaufmann；2005.13.SchwartzGJ，HaycockGB，EdelmannCM，Jr.，SpitzerA.Asimpleestimateofglomerularfiltrationrateinchildrenderivedfrombodylengthandplasmacreatinine(身高和血漿肌酸酐得出的兒童腎小球濾過率的簡單估計).Pediatrics1976；58(2):259-63.實施例II方法選擇來自肝和心臟移植患者的總計40倍和免疫遏制匹配的外周血樣品用于跨實施例I中鑒定的10基因-集的384-孔形式多重ABI-TaqManqPCR確認。其中16個樣品來自肝移植患者，8個AR和8個穩(wěn)定無排斥(STA)，24個樣品來自心臟移植患者(9AR；10STA)；對于病毒混淆因素控制，包括具有巨細胞病毒感染(CMV)的5STA樣品。顯著差異基因表達通過T檢驗確定，p<0.05視為顯著。結(jié)果對于肝移植中相同10基因-集確認，10基因中的2個(PSEN1和RYBP)是對于與STA相比確認外周血AR診斷高度顯著的(p＝0.05；p＝0.04)；剩余8基因顯示與腎移植中所見的相同方向的倍數(shù)變化，AR和STA之間沒有統(tǒng)計學(xué)顯著的差異。將從腎移植外周血得到的10基因-集產(chǎn)生的預(yù)測模型(ROC＝97.6％)應(yīng)用于肝樣品PCR數(shù)據(jù)集的AR分類，揭示了86％靈敏度、75％特異性、88％PPV和78％NPV的預(yù)測評分，16個樣品中的2AR和1STA被錯誤分類。對于心臟樣品中的10基因-集確認，10基因中的3個(CFLAR、ITGAX和NKTR)是在AR相比于STA中差異表達的(p＝0.04；p＝0.05；p＝0.01)。令人感興趣的是，這3個基因中的1個(CFLAR)顯示與先前的腎AR樣品(p＝0.002、倍數(shù)變化＝3.1)中所見的顯著的相反方向的倍數(shù)變化(p＝0.04、倍數(shù)變化＝-2.2)。此外，當(dāng)與AR相比時，3個基因中的2個在CMV方面是顯著下調(diào)的。肝和心臟之間不存在顯著差異表達的基因的重疊。測試的10個基因的身份顯示在對腎移植樣品的先前討論中。結(jié)論腎移植中的跨平臺微陣列分析中得到和測試的高度特異和靈敏的10基因生物標(biāo)志物可用于預(yù)測肝移植中的AR。10基因中的2個在肝和心臟的AR中是差異表達的，但是肝和心臟之間顯著差異調(diào)節(jié)的基因的無重疊表明排斥損傷不僅在不同的器官移植體之間共有共同的生物學(xué)途徑，而且還顯示組織特異性。測試的10基因可用于在肝和心臟移植物排斥中診斷AR，而無論排斥等級如何。盡管為清楚理解目的，已一定程度上通過例證和實施例詳細描述了本發(fā)明，但是借鑒本發(fā)明的教導(dǎo)，可對本發(fā)明進行某些變化和改動而不背離所附權(quán)利要求的精神或范圍對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是非常明顯的。因此，以上僅例證了本發(fā)明的原理。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠設(shè)計各種布置，這些布置雖然沒有在本文明確描述或顯示，但是其體現(xiàn)本發(fā)明的原理并包括在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。另外，本文所述的所有實施例和附條件的語言主要意在幫助讀者理解本發(fā)明的原理和發(fā)明人提出的推動本領(lǐng)域的概念，因此應(yīng)以非限制性方式解讀此類特別引述的實施例和條件。此外，本文引述本發(fā)明的原理、方面和實施方式以及其具體實施例的所有陳述意在包括其結(jié)構(gòu)和功能等同物。另外，此類等同物意在包括目前已知的等同物和將來開發(fā)的等同物，即無論結(jié)構(gòu)如何，開發(fā)用于執(zhí)行相同功能的任何元件。因此，本發(fā)明的范圍不意圖限制于本文顯示和描述的t示例性實施方式。相反，本發(fā)明的范圍和精神僅由所附權(quán)利要求體現(xiàn)。當(dāng)前第1頁1 2 3