用于移植和移植物排斥的體外預(yù)后和診斷的生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及新型肽、它們的衍生物和包含其的組合物，它們作為移植器官疼痛、尤其是移植或移植物排斥的預(yù)后或診斷中的工具的用途。
【專利說明】用于移植和移植物排斥的體外預(yù)后和診斷的生物標(biāo)志物
[0001]本發(fā)明涉及新型肽、它們的衍生物以及包含其的組合物，它們作為移植器官疼痛(distress)、特別是移植或移植物排斥的預(yù)后或診斷中的工具的用途。
[0002]腎在活生物體中的主要功能是清除血液的廢棄物或毒性物質(zhì)。腎損傷可損害腎結(jié)構(gòu)(腎小球或小管細(xì)胞缺失、纖維化和腎脈管系統(tǒng)改變)，這導(dǎo)致慢性腎排泄功能障礙(Lopez-Novoa等人，J Transl Med2011, 9:13)。慢性腎病的演化可通過關(guān)鍵病理事件例如腎單位功能活性的百分比、腎小球濾過率、腎排泄功能或通過血漿和尿生物標(biāo)志物(肌酸酐、尿酸……)的測量來監(jiān)測。按照腎功能障礙和腎損傷將慢性腎病的進(jìn)展分成了5個階段(Levey等人,Ann Intern Med2003, 139, 137-147)。階段1通常是其中腎功能障礙可被逆轉(zhuǎn)的沉默期，而晚期的階段4和階段5對應(yīng)于腎衰竭，并且需要腎替代療法例如透析或任何可行時的腎移植。
[0003]器官移植也可在其它器官系統(tǒng)例如循環(huán)系統(tǒng)(心臟)、消化系統(tǒng)(肝)和呼吸系統(tǒng)(肺)中發(fā)生?；加邪籽〉幕颊哌€可接受軟組織移植，即骨髓移植。
[0004]在歐洲每年進(jìn)行超過15000例腎移植、5000例肝移植、2000例心臟移植和1000例肺移植。器官移植通常是用于最終狀態(tài)器官衰竭的唯一治療。細(xì)胞和組織例如造血干細(xì)胞或心臟瓣膜也用于移植來恢復(fù)基本功能。不利事件和反應(yīng)例如移植或移植物排斥通常在接受者中發(fā)生。這可至少導(dǎo)致移植物的損害和最終導(dǎo)致其喪失。免疫抑制藥物的使用通過調(diào)節(jié)接受者的免疫應(yīng)答來幫助改善移植的結(jié)果。然而，這些藥物誘導(dǎo)一組對于患者不利的事件，所述事件限制他們的生活質(zhì)量或存活預(yù)期。最常見的副作用是腎毒性、癌癥和心血管事件。
[0005]已鑒定了移植或移植物排斥所基于的分子機(jī)制。免疫排斥是通過抗提供者細(xì)胞的接受者T細(xì)胞的活化介導(dǎo)的。接受者T細(xì)胞識別提供者的主要組織相容性復(fù)合物(MHC)I類編碼的抗原。T細(xì)胞和其它單核白細(xì)胞(例如B細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞)對移植器官的浸潤通過活化補(bǔ)體系統(tǒng)和單核細(xì)胞而促成損害移植物。CD4+和CD8+T細(xì)胞均參與急性細(xì)胞排斥。抗提供者M(jìn)HC I類和II類抗體的產(chǎn)生也與急性和慢性移植物損害相關(guān)。在慢性移植排斥中，接受者免疫應(yīng)答的活化可能不是排斥的唯一原因。其它原因例如纖維化、病毒感染或原始疾病的復(fù)發(fā)可能在移植排斥中起重要作用(Sanchez-Fueyo等人，Gastroenterology2011, 140，51-64)。
[0006]排斥發(fā)作通過常規(guī)臨床參數(shù)來診斷，所述參數(shù)對于移植器官是特異性的并且取決于遺傳因子，主要通過活組織檢查來確認(rèn)。目前，利用常規(guī)組織學(xué)檢查的組織同種異體移植物活組織檢查仍然是用于診斷經(jīng)移植的患者中排斥的金標(biāo)準(zhǔn)(Racusen等人，The Banff97 working classification of renal allograft pathology, Kidney International1999，55，713-723)。由于程序活組織檢查是侵入性方法，因此需要醫(yī)生的干預(yù)來收集移植器官的小塊組織。盡管這些測試相當(dāng)準(zhǔn)確地預(yù)測移植失敗，但它們通常在相對晚的時期檢測其，此時廣泛的組織損害已發(fā)生。組織損害發(fā)生前對移植失敗的早期檢測可能幫助醫(yī)生更高效地監(jiān)測免疫抑制藥物，使它們的副作用最小化、同時延長移植存活率。表明哪些患者處于隨后急性同種異體移植排斥和慢性同種異體移植功能障礙的最高風(fēng)險中的血清中蛋白質(zhì)的鑒定在開發(fā)可用于體液樣品的新型體外預(yù)后和診斷測定中可能是有幫助的。
[0007]鑒定用于移植和移植物排斥的生物標(biāo)志物仍然具有挑戰(zhàn)性。在過去十年中，已開發(fā)了不同的策略來鑒定此類標(biāo)志物。第一種策略在于就特定蛋白質(zhì)在免疫反應(yīng)系統(tǒng)中的已知影響而言選擇所述蛋白質(zhì)。US 2008/274910公開了 TIRC-7 (T細(xì)胞免疫應(yīng)答cDNA7)在腎移植患者血液中的增強(qiáng)的表達(dá)特征譜對于可導(dǎo)致移植排斥的免疫活化的早期活化是決定性的。
[0008]更普遍的蛋白質(zhì)(不參與免疫系統(tǒng))例如TRIB-1 (—種MAP激酶激活劑)(W02007/138011)或溶菌酶(JP 2006/6177679)已被鑒定為分別用于腎或腸急性移植排斥的體外診斷和或預(yù)后的標(biāo)志物。在所有先前的實例中，使用了單種蛋白質(zhì)。
[0009]另一個策略是研究移植器官的轉(zhuǎn)錄特征譜。在W0 2004/074815中，發(fā)明人研究了在血管再灌注后15分鐘內(nèi)已知基因在移植腎組織上的表達(dá)，所述基因編碼介導(dǎo)免疫活化的促炎性或粘著蛋白和抗凋亡蛋白。結(jié)果顯示可從與臨床信息相結(jié)合的基因簇的差異表達(dá)預(yù)測延遲的移植物功能、急性排斥或延遲的排斥。
[0010]最近在移植排斥領(lǐng)域中開發(fā)了更加全局性的方法?；蚪M或蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已使得能夠進(jìn)行許多人類疾病的基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的特征分析(profiling)。
[0011]微陣列工具提供了檢測數(shù)百或數(shù)千個基因間差異表達(dá)的基因的模式的可能性。在W0 2010/083121中，發(fā)明人在微陣列平臺上篩查了已接受腎移植的患者的血液樣品的全基因組的表達(dá)水平，并且鑒定了一組其表達(dá)水平通過RT-PCR技術(shù)被證實的基因。利用所述基因表達(dá)特征譜來預(yù)先6至3個月預(yù)測急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。通過使用來自腎和心臟移植的基于活組織檢查的基因表達(dá)微陣列研究的電腦模擬(in silico)數(shù)據(jù)開發(fā)了類似的策略(Chen 等人，PLoS Computational Biology 2010, 6 (9), 1-12) ? 這引起鑒定了 3 個交叉器官急性排斥蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物即PECAM-1、CXCL-9和⑶44。
[0012]在心臟移植中，心臟同種異體移植排斥基因表達(dá)觀察(CARGO)研究引起開發(fā)了用于急性排斥的非侵入性、FDA承認(rèn)的商購可得的測試(www.allomap.com)。通過算法將20個基因的測量表達(dá)水平轉(zhuǎn)化成報告為評分的整數(shù)值。臨床醫(yī)生在測試時將該評分用于排斥概率的總體評價。該體外診斷可在移植后2個月至超過6個月之間進(jìn)行，以評價排斥。
[0013]使用iTRAQ-MALD1-T0F/T0F法對蛋白質(zhì)血漿濃度的測量鑒定了 18個具有差異相對濃度的蛋白質(zhì)組代碼(protein group code) (Cohen Freue 等人，Molecular&CellularProteomics 9.9 2010,1954-1967)。這些蛋白質(zhì)中的一些先前與急性腎移植排斥相關(guān)聯(lián)，例如參與補(bǔ)體系統(tǒng)的那些(MBL2-甘露糖結(jié)合蛋白C)、凝集級聯(lián)(SERPINA10和因子11)或炎性反應(yīng)(巨噬細(xì)胞刺激蛋白-MSPT-1和MSPT-9)。在此出版物中，作者還公開了通過心肌細(xì)胞分泌的稱為PI16的抗肥大蛋白，和稱為AFM的、白蛋白家族蛋白的維生素E結(jié)合成員，所述蛋白在腎功能中具有未知作用。本研究加強(qiáng)了下述想法:有可能鑒定出普遍存在于所有移植器官間的生物標(biāo)志物。
[0014]鑒定在急性和慢性排斥中具有未知作用的新型蛋白質(zhì)可能不僅提供用于器官排斥的預(yù)后和診斷的新型測定而且還提供用于治療干預(yù)的新型靶標(biāo)。因此，這可導(dǎo)致免疫抑制藥物的全部或部分撤出或者修改方案或改變使用的活性分子以允許接受者中的移植耐受。
[0015]雖然上述基因組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)構(gòu)成了強(qiáng)大的工具，其引起鑒別新型基因或蛋白質(zhì)作為急性或慢性移植物排斥的標(biāo)志物，但它們的實施仍然昂貴，并且它們在醫(yī)院并非總是可獲得的。因此，仍然需要備選的標(biāo)記物，其使得能夠簡單、快速且容易地實施用于移植和移植物排斥的預(yù)后及診斷的測定。
[0016]因此，本發(fā)明的目的之一是提供作為移植器官疼痛，尤其是移植和移植物排斥的特異性生物標(biāo)志物的新型蛋白質(zhì)。
[0017]本發(fā)明不僅允許在數(shù)分鐘內(nèi)診斷而且還允許在數(shù)分鐘內(nèi)預(yù)后移植或移植物排斥。
[0018]本發(fā)明涉及包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1或由其組成的肽，或源自SEQ ID N0:1的肽，所述肽與SEQ ID NO: 1的氨基酸1至11具有至少65%的同一性，條件是所述肽不是天然病毒蛋白質(zhì)。
[0019]在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的肽由氨基酸序列SEQ ID NO: 1或源自SEQ ID N0:1的肽組成，所述肽與SEQ ID NO: 1的氨基酸1至11具有至少65%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少95%的同一性，條件是所述肽不是天然病毒肽。 [0020]“天然病毒蛋白質(zhì)”意指這樣的蛋白序列，所述蛋白序列包含、對應(yīng)于、存在于或以其它方式源自可在病毒的基因組中發(fā)現(xiàn)的任何蛋白序列。作為天然病毒蛋白質(zhì)的實例，將弓丨述來自HIV的gag蛋白。
[0021]在優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的肽與SEQ ID N0:1的氨基酸1至11具有至少70%,更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%和最優(yōu)選至少95%的同一'I"生。
[0022]表述“肽”意指連續(xù)的線性氨基酸鏈。該連續(xù)氨基酸鏈可來自天然來源或人工(來自化學(xué)合成)。肽的化學(xué)合成法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0023]氨基酸序列SEQ ID NO: 1的肽的片段也是本發(fā)明的部分。肽的片段意指在SEQ IDNO: 1的肽的11個氨基酸中選擇的至少5個連續(xù)氨基酸鏈，其能夠結(jié)合針對SEQ ID N0:1的肽產(chǎn)生的抗體。
[0024]可通過所述肽的序列改變獲得的氨基酸序列SEQ ID NO: 1的肽的變體也是本發(fā)明的部分。這些改變可包括置換、缺失、插入或突變。
[0025]修飾的或不尋常的氨基酸也可包含在這類變體中。還可按照本領(lǐng)域中的已知方法修飾存在于末端N或C基團(tuán)上的氨基酸部分的側(cè)鏈上的官能團(tuán)。此類衍生物包括例如羧基的酯、脂肪族酰胺和游離氨基的N-酰基衍生物。此外，可使氨基酸經(jīng)受翻譯后修飾例如糖基化、唾液酸化、乙?；?、甲基化、酰胺化、硫酸化、甲?；蛄姿峄?。
[0026]可能是鹽化的肽的、包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1或由其組成的肽及其變體也是本發(fā)明的部分。羧基的鹽包括無機(jī)鹽，例如與有機(jī)堿如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸的鈉、鉀、鈣鹽。氨基的鹽包括例如與無機(jī)酸例如鹽酸或與有機(jī)酸例如醋酸的鹽。
[0027]SEQ ID N0:1 的肽被稱為 VEA195。
[0028]包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1或由其組成的肽源自從移植的或植入的宿主分離的具有25-30kDa的分子量的血清蛋白質(zhì)。
[0029]本發(fā)明還涉及編碼上文中定義的肽的分離的核酸分子，特別是能夠編碼包含氨基酸序列SEQ ID NO: 1或由其組成的肽或源自SEQ ID NO: 1的肽的核酸序列，條件是所述肽不是天然病毒肽，其中所述核酸是SEQ ID N0:2或其片段，條件是所述核酸分子不是天然病
毒核酸。[0030]“天然病毒核酸”意指這樣的核酸序列，所述核酸序列包含、對應(yīng)于、存在于或以其它方式源自可在病毒的基因組中發(fā)現(xiàn)的任何核酸序列。作為天然病毒核酸的實例，將引述來自HIV的gag基因。
[0031]由于遺傳密碼的簡并性，編碼SEQ ID NO: 1的氨基酸的密碼子可在其3個位置中的任何位置上不同。例如氨基酸賴氨酸可由AAA或AAG密碼子(第三位置上的差異)指定。
[0032]術(shù)語“核酸分子”意指單鏈或雙鏈DNA分子，或單鏈或雙鏈RNA分子，所述RNA分子直接從DNA分子推演而來，或雜合DNA/RNA分子，所述核酸分子編碼本發(fā)明的肽。
[0033]本發(fā)明還涉及包含可操作地連接至表達(dá)載體的上述核酸分子的重組核酸構(gòu)建體。
[0034]表述“可操作地連接的”意指前述核酸分子以共價方式連接至表達(dá)載體，從而允許核糖體翻譯所述核酸分子，或允許RNA聚合酶產(chǎn)生編碼根據(jù)本發(fā)明的肽的mRNA。
[0035]術(shù)語“表達(dá)載體”意指由核酸制成的分子，特別是質(zhì)粒，其包含啟動子區(qū)域和任選地增強(qiáng)子區(qū)域。表達(dá)載體可包括其它基因例如抗生素抗性基因，為了選擇包含編碼根據(jù)本發(fā)明的肽的核酸分子的宿主細(xì)胞。使用前述表達(dá)載體的重組產(chǎn)生技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。
[0036]本發(fā)明還涉及包含上述重組核酸構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
[0037]術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指任何活細(xì)胞，特別是真核細(xì)胞，但也指細(xì)菌細(xì)胞，或包含轉(zhuǎn)錄和/或翻譯裝置(machinery)和任選地來自細(xì)胞的細(xì)胞器的任何無生命介質(zhì)，其允許擴(kuò)增前述核酸構(gòu)建體和/或產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的肽。
[0038]本發(fā)明還涉及特異性結(jié)合表位的抗體或其片段，所述表位包含序列SEQ ID N0:1或所述肽的片段或由其組成。`
[0039]在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的抗體或其片段特異性結(jié)合表位，所述表位由序列SEQID NO: 1或所述肽的片段組成。
[0040]術(shù)語“抗體”意指屬于任何物種例如人、小鼠、大鼠、兔或山羊物種的抗體?？贵w也可以是嵌合抗體，即包含源自不同物種的部分的抗體。還可將抗體人源化?？贵w還可以是包含至少一個互補(bǔ)位的抗體片段例如Fab、F(ab’)2或scFv片段。本發(fā)明的抗體可以是多克隆或單克隆抗體。單克隆抗體也可以是抗獨特型單克隆抗體或抗獨特型抗體的Fab片段。本發(fā)明的抗體可以是天然抗體或重組抗體。
[0041]術(shù)語“特異性”意指肽與一種抗體相互作用而基本上不與在結(jié)構(gòu)上不與前述抗體相似的另一種抗體相互作用。
[0042]產(chǎn)生多克隆或單克隆抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。通常地，可將SEQID NO: 1的肽與高分子量載體蛋白一起注射至非人哺乳動物(例如小鼠、兔、山羊或綿羊)，以引發(fā)良好的免疫應(yīng)答。可在將動物處死之前數(shù)次進(jìn)行免疫接種方案。隨后在層析柱上純化動物血清，以分離目標(biāo)單克隆或多克隆抗體。
[0043]通常，單克隆抗體產(chǎn)生自對分泌針對SEQ ID NO: 1的肽產(chǎn)生的抗體的雜交瘤的選擇。這樣的雜交瘤產(chǎn)生自利用SEQ ID NO: 1的肽免疫接種的非人哺乳動物的脾細(xì)胞與非人哺乳動物的骨髓瘤細(xì)胞之間的融合。基于它們分泌能夠結(jié)合SEQ ID NO: 1的肽的能力進(jìn)行雜交瘤的選擇。
[0044]在優(yōu)選實施方案中，靶向氨基酸序列SEQ ID N0:1或源自SEQ ID N0:1的肽的抗體被于2011年5月4日在布達(dá)佩斯條約下在參考號CNCM 1-4479、CNCM 1-4480和CNCM 1-4481下保藏在CNCM(國立微生物保藏中心，巴斯德研究所，25rue du DocteurRoux, 75724巴黎CedeX15，法國)的雜交瘤分泌，所述雜交瘤為本發(fā)明的部分。
[0045]本發(fā)明還涉及于2011年5月4日分別在參考號CNCM I_4479、CNCM 1-4480和CNCM1-4481 下保藏在 CNCM 的雜交瘤 2C7D10E5、4H7A7G9 和 1H8C9C10C7。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的肽具有免疫原性，即VEA195肽能夠在注射后誘導(dǎo)哺乳動物的體液免疫應(yīng)答。已從其鑒定了 VEA195肽的完整蛋白質(zhì)在移植排斥中的確切功能還不知道。由于無人可預(yù)測該蛋白質(zhì)對移植排斥是具有有益還是有害的作用，可開發(fā)兩種治療性策略來避免移植排斥。如果需要該蛋白質(zhì)的存在，則在利用包含編碼VEA195肽所源自的接受者蛋白質(zhì)的多核苷酸的質(zhì)粒進(jìn)行移植之前或同時向接受者施用一劑或多劑DNA疫苗可能是有幫助的。在W0 2009/114735中通過使用由包含編碼Bax促細(xì)胞凋亡蛋白的多核苷酸的質(zhì)粒組成的DNA疫苗測試了該方法。相反地，如果需要該蛋白質(zhì)不存在，則可能通過使用針對所述VEA195肽特異性產(chǎn)生的固定抗體來開發(fā)VEA195肽所源自的完整蛋白質(zhì)的耗竭。本領(lǐng)域技術(shù)人員可能使用下述程序:其中從患者的循環(huán)采血以在將其返回循環(huán)之前對其施用耗竭方法。例如，可將針對VEA195肽產(chǎn)生的抗體結(jié)合至在身體之外循環(huán)血液的裝置的樹脂柱。已從其鑒定了 VEA195肽的25-30kDa的蛋白質(zhì)將被保留在柱子上，而全血被返回至經(jīng)移植的患者的身體。該蛋白質(zhì)從血液循環(huán)的快速耗竭可能限制移植或移植物排斥。
[0047]本發(fā)明的另一個目的是提供包含至少一種上文中定義的肽或抗體的組合物。
[0048]本發(fā)明的另一個目的是提供上文中定義的組合物，其用作用于評價移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的預(yù)后、診斷或監(jiān)測工具。
[0049]術(shù)語“預(yù)后”和“診斷”分別涉及確定移植或移植物排斥是否將在哺乳動物中發(fā)生或正在發(fā)生。
[0050]術(shù)語“移植器官疼痛”意指移植器官功能障礙或移植器官衰竭。器官功能的喪失可導(dǎo)致例如但不限于通常被器官清除的物質(zhì)的積累或器官不能進(jìn)行其生理合成代謝或分解代謝功能。器官衰竭可能與(但不限于)壞死、纖維化或炎癥過程相關(guān)。
[0051]例如，腎疼痛可與移植的腎的數(shù)種損害相關(guān)，例如急性腎小管壞死(ATN)、慢性間質(zhì)小管壞死(CITN)、移植后淋巴增生性疾病(PTLD)、毛細(xì)血管外腎小球腎炎或移植排斥(其為最聞等級的腎疼痛)。
[0052]移植器官疼痛不限于移植的腎，還可能在其它移植或植入的器官和組織(例如肺、心臟、肝和骨髓)中發(fā)生。
[0053]術(shù)語“移植”意指將細(xì)胞或組織引入來自相同物種的另一個個體(同種異體移植)或來自不同物種(異種移植)的接受者哺乳動物的身體以恢復(fù)被疾病或損害改變的功能。造血細(xì)胞、臍帶血細(xì)胞、胰腺β細(xì)胞舉例說明了最常進(jìn)行的細(xì)胞移植。提供了皮膚、骨髓、肝的部分或角膜的移植作為組織移植的實例。
[0054]術(shù)語“移植(transplant) ”意指將從提供者哺乳動物的身體取出的器官引入其器官不再能正確地發(fā)揮其功能的接受者哺乳動物的身體。當(dāng)器官提供者和器官接受者哺乳動物來自相同物種時，這稱為同種異體移植。當(dāng)器官提供者和器官接受者來自兩個不同物種時，發(fā)生異種移植。在哺乳動物中當(dāng)前大多數(shù)移植的器官是肺、腎、心臟、肝、胰腺和腸。所有先前提及的移植或移植物的類型被給出來舉例說明本發(fā)明的領(lǐng)域，但不應(yīng)當(dāng)被用于限制本發(fā)明的范圍。[0055]表述“移植或移植物排斥”意指移植的細(xì)胞、組織或器官被接受者的免疫系統(tǒng)部分或全部破壞。已鑒定了 3種類型的器官排斥:超急性、急性和慢性的。超急性排斥通常在移植的24小時內(nèi)發(fā)生。急性排斥在移植的前6個月內(nèi)發(fā)生，而慢性排斥可在移植后6個月至數(shù)年之間出現(xiàn)，盡管使用免疫抑制藥物。
[0056]本發(fā)明還提供用于預(yù)測或進(jìn)行哺乳動物的移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的方法，所述方法包括下列步驟:
[0057](i)測定SEQ ID N0:1的肽或所述肽的片段在所述哺乳動物的生物學(xué)樣品中的存
在或量。
[0058]在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于預(yù)測或進(jìn)行哺乳動物的移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的方法，其包括下述步驟:
[0059](i)測定針對SEQ ID N0:1的肽或所述肽的片段產(chǎn)生的抗體在所述哺乳動物的生物學(xué)樣品中的存在或量。
[0060]術(shù)語“哺乳動物”包括人以及其它動物例如豬、牛、馬、兔、貓、狗。哺乳動物可以是雌性的或雄性的、成年或兒童。
[0061]根據(jù)本發(fā)明，檢測或測定SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段的水平，或針對SEQ IDNO: 1的肽或所述肽的片段產(chǎn)生的抗體的水平可通過任何本領(lǐng)域中已知的技術(shù)、優(yōu)選通過使用免疫測定法來進(jìn)行。
[0062]術(shù)語“免疫測定”意指任何下述技術(shù):其中SEQ ID NO: 1的肽或針對SEQ ID NO: 1的肽特異性產(chǎn)生的抗體的水平是使用至少一種本說明書中在上文中定義的肽和/或抗體來測定的。免疫測定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的并且可具有各種形式，例如在固相或液相中、在一個或兩個步驟中、通過夾心或競爭性方法。
[0063]例如，可使用膠體金免疫層析測定(CIA) (Cao等人，Am.J.Trop.Med.Hyg.2007, 76(3)，553-558)。該類型的免疫測定特別容易實施并且在少于30分鐘中，優(yōu)選在少于20分鐘中，更優(yōu)選在10分鐘中獲得定性的結(jié)果。
[0064]抗原在生物學(xué)樣品中的存在可通過金膠體標(biāo)記的檢測抗體來顯露，所述抗體能夠通過識別與被捕獲抗體識別的位點不同的表位位點來結(jié)合目標(biāo)肽或蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，可使捕獲抗體結(jié)合至固體支持物，特別是醋酸纖維素膜，并且將金膠體標(biāo)記的抗體認(rèn)為是遷移抗體。
[0065]關(guān)于其它實例，可使用ELISA測定、放射免疫測定或任何其它檢測方法來顯露所形成的抗原-抗體復(fù)合物的存在。因此，可設(shè)想不同類型的配體和/或抗體的標(biāo)記(放射活性、酶促、熒光……)。
[0066]在移植或植入發(fā)生后數(shù)小時或數(shù)天，在來自經(jīng)移植或植入的接受者的生物學(xué)樣品上進(jìn)行SEQ ID NO: 1的肽或針對SEQ ID NO: 1肽的肽特異性產(chǎn)生的抗體的測量測定。生物學(xué)樣品可以是體液樣品或固體樣品例如移植器官或組織的活檢樣品。
[0067]表述“體液樣 品”意指適合用于根據(jù)本發(fā)明的方法的任何類型的樣品。生物學(xué)樣品可選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、尿樣或唾液樣品。
[0068]本發(fā)明還涉及用于移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的試劑盒，其包括:
[0069](i)至少一種適合于結(jié)合包含SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段或由其組成的表位的抗體，
[0070](?)至少一種適合用于結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物的偶聯(lián)至檢測系統(tǒng)的抗體，
[0071]和任選地至少一種SEQ ID N0:1的肽或所述肽的片段。
[0072]本發(fā)明還涉及SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段用作用于哺乳動物的移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的標(biāo)志物的用途。
[0073]本發(fā)明還涉及能夠編碼SEQ ID NO: 1的肽的SEQ ID NO: 2的核酸分子用作用于哺乳動物的移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的標(biāo)志物的用途。
[0074]術(shù)語“標(biāo)志物”還指“生物標(biāo)志物”，其涉及其表達(dá)調(diào)控對于移植或移植物排斥的預(yù)后或診斷有用的任何蛋白質(zhì)和/或核酸分子。
[0075]下列實施例1至4和圖1至2舉例說明本發(fā)明。
[0076]圖1表示已從其分離了 VEA195的蛋白質(zhì)的組織定位。按照實施例2對患有或未患有移植排斥的接受者進(jìn)行了腎活組織檢查:
[0077]A未患排斥的移植患者
[0078]B患有排斥的移植患者。
[0079]圖2顯示膠體金免疫層析測定(CIA)的結(jié)果。用于根據(jù)實施例3診斷器官接受者的血清中VEA195肽所源自的完整蛋白質(zhì)的條帶:
[0080](a)未患排斥的移植患者
[0081](b)患有排斥的移植患者
[0082]實施例l:25_30kDa的蛋白質(zhì)的分離、提取、純化和對應(yīng)于在25_30kDa的蛋白質(zhì)上鑒定的內(nèi)源免疫原性肽的VEA195肽的合成
[0083]1.1 方案
[0084]從腎移植患者收集了 5個血清樣品，通過蛋白G瓊脂糖4快速流動(Pharmacia, Uppsala,瑞典)清除了其人免疫球蛋白(IgG)。獲得了 15ml的總體積，并將其加載至Sephadex G-75 (Pharmacia, Uppsala,瑞典)色譜柱上用于使用氯仿甲醇3/1緩沖液進(jìn)行分離。收集了 200μ1級分的洗脫物，級分n° 4-5 (400 μ 1)的分析顯示出存在25-30kDa蛋白質(zhì)。
[0085]通過在4°C下、在4L的PBS中浸沒過夜，將所述400 μ 1于小管(Sigma-Aldrich,法國)中進(jìn)行透析方案。最后收集了終體積200 μ 1的透析物，并允許了鑒定出具有免疫原性性質(zhì)的1.2kDa的小序列。該級分的測序被定義為VEA195。隨后合成該肽。
[0086]通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法在自動化合成儀上裝配了 VEA195肽。簡要地，使用Boc/芐基策略進(jìn)行了固相肽合成。以5倍過量偶聯(lián)每一個氨基酸，在PyBPO、HObt和DIEA存在的情況下于DMF中進(jìn)行每一個偶聯(lián)。通過利用氟化氫的處理從樹脂切離的肽，并通過反相色譜進(jìn)行純化。合并具有高于95%純度的級分。
[0087]1.2 結(jié)果
[0088]通過分析質(zhì)譜法控制VEA195肽的身份(identity),并使用nucleosilC18250x4.6mm柱通過分析HPLC控制其純度。將10至60%的梯度的乙腈用于該純化。測量收集的級分的電勢差以獲得色譜特征譜。色譜特征譜上唯一的峰對應(yīng)于VEA195肽，將所述VEA195肽干燥、重懸于純水中，并隨后用于小鼠的免疫接種以產(chǎn)生特異性抗體。
[0089]實施例2:腎組織的免疫組織化學(xué)[0090]2.1 方案
[0091]將移植患者的經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的移植腎活檢組織切成5微米切片，并固定在載玻片上。按照制造商的推薦，在自動化染色系統(tǒng)(Ventana Medical SystemsTucson, Arizona USA)上對先前經(jīng)測序的來自25_30kDa蛋白質(zhì)的VEA195進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)測定。將這些載玻片于二甲苯中脫石蠟，通過3次乙醇通過脫水，并轉(zhuǎn)移至Ventana試劑盒(其包括封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性的溶液)。也將抗-VEA195小鼠單克隆抗體如2C7D10E5(E5)、4H7A7G9(G9)和1H8C9C10C7 (C7)插入在平臺上，并且在測定過程中自動化地以1:100的稀釋進(jìn)行分配。使這些載玻片在DAB Map (DAB= 二 -氨基-聯(lián)苯胺)中進(jìn)行顯色，并用蘇木精(Ventana)復(fù)染，最后于甲苯溶液(Eukit, CML, Nemours,法國)中固定。
[0092]2.2 結(jié)果
[0093]將它們示于圖1中。來自患有移植排斥的腎移植接受者的活檢組織在腎小球基底膜和腎的小管部分上都顯示典型的25-30kDa蛋白質(zhì)染色。小管細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)染色非常強(qiáng)(圖1-B)。在來自健康(即未經(jīng)歷移植排斥)腎移植接受者(圖1-A)的活檢組織中未出現(xiàn)25-30kDa蛋白質(zhì)染色。
[0094]實施例3:免疫-上升(ascendant)色譜結(jié)果
[0095]3.1 單克隆抗體合成
[0096]給每只小鼠注射約50 μ g的稀釋于PBS中的VEA195肽，注射總共4只小鼠。使用在完全弗氏佐劑中乳化的VEA195肽腹膜內(nèi)地進(jìn)行第一注射。在第21天和42天進(jìn)行新的注射，在第0、14、35和56天進(jìn)行測試放血。在完成最后一次測試放血后，進(jìn)行了 ELISA測試。在最后一次放血后 ，通過手術(shù)取出最佳反應(yīng)性小鼠的脾臟。將淋巴細(xì)胞分離，并將其置于培養(yǎng)基中。
[0097]為了使免疫球蛋白產(chǎn)生性淋巴細(xì)胞保持存活，將它們在聚乙二醇的存在下與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞系[骨髓瘤SP2/0-Agl4(ATCCCRL8287)]融合。在填充了 HAT培養(yǎng)基(次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)的平板上進(jìn)行融合和未融合的淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的分離。收集存活的細(xì)胞，且構(gòu)成雜交瘤。在抗原特異性抗體的存在下測試細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液，將雜交瘤細(xì)胞冷凍以進(jìn)一步生長。然后通過在多孔板中稀釋混合物來分離真正的單克隆抗體產(chǎn)生性雜交瘤細(xì)胞系。通過該方法，在一系列新細(xì)胞的選擇和克隆、ELISA和顯微鏡控制后，選擇了一個“母細(xì)胞”，其分泌一種獨特的抗體。
[0098]通過使用該技術(shù)，針對VEA195肽產(chǎn)生了 IgGl或IgG2K同種型單克隆抗體:2C7D10E5(E5)、4H7A7G9(G9)和 1H8C9C10C7(C7)。
[0099]3.2 免疫測定方案
[0100]在該測定中使用雙抗體夾心技術(shù)使得能夠在移植患者血清中檢測VEA195肽所源自的完整蛋白質(zhì)。該測試基于使用兩種針對VEA195肽產(chǎn)生的特異性抗體和針對小鼠Ig產(chǎn)生的非特異性抗體的免疫色譜法。單克隆E5捕獲抗體特異性識別VEA195的表位。綴合有膠體金的G9遷移抗體識別VEA195肽的第二表位?？剐∈驣g是用作陰性對照的對照捕獲抗體。將三種抗體線性地結(jié)合至醋酸纖維素膜上。將條帶浸沒在含有遷移緩沖液(Na2HP0450mM, BSA1%和NaN30，10%pH7.4，來自B10SYNEX)中的稀釋的患者血清的測定管中。由E5捕獲抗體-VEA195肽所源自的蛋白質(zhì)-綴合有膠體金的G9遷移抗體構(gòu)成的復(fù)合物形成測試線，并且由抗小鼠Ig捕獲抗體-綴合有膠體金的G9遷移抗體構(gòu)成的復(fù)合物形成對照線。綴合有膠體金的抗體的遷移沿著測試條帶進(jìn)行。10分鐘后讀取結(jié)果。當(dāng)測試線和對照線均為紅色時，其意指對應(yīng)的血清樣品是陽性的。如果僅對照線是紅色的，則表示陰性結(jié)果。
[0101]3.3 結(jié)果
[0102]將它們示于圖2中。兩條線存在于利用患有移植排斥的腎移植患者的血清進(jìn)行的條帶上(圖2-b):上方的線對應(yīng)于對照線，下方的條帶是測試線。僅可見對照線的是利用未患有移植排斥的腎移植患者的血清進(jìn)行的條帶測試(圖l_a)。
[0103]對總共20個腎移植患者的血清樣品進(jìn)行了膠體金免疫-色譜測定(CIA)與免疫組織化學(xué)(IHC)之間的比較研究(通過移植器官的蘇木精和伊紅染色的切片進(jìn)行)(表1，第17頁)。根據(jù)IHC標(biāo)準(zhǔn)確立了最終的診斷。所有的實驗都是用經(jīng)編碼和盲測的樣品進(jìn)行的。追溯性地和盲測地進(jìn)行通過CIA測定的分析，有時在通過病理學(xué)確定的診斷后數(shù)月進(jìn)行。結(jié)果集中在表1中。
[0104]`
【權(quán)利要求】
1.肽，其由氨基酸序列SEQID N0:1或衍生自SEQ ID NO: 1的肽組成，所述肽與SEQ IDNO: 1的氨基酸1至11具有至少65%，更優(yōu)選至少75%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少95%的同一性，條件是所述肽不是天然病毒肽。
2.能夠編碼根據(jù)權(quán)利要求1的肽的核酸分子，其中所述核酸是SEQID N0:2或其片段，條件是所述核酸分子不是天然病毒核酸。
3.抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結(jié)合由根據(jù)權(quán)利要求1的肽或所述肽的片段組成的表位。
4.雜交瘤，其于2011年5月4日于布達(dá)佩期協(xié)議下、在參考編號CNCM1-4479、CNCM1-4480和CNCM 1-4481下被保藏在CNCM(巴黎)，其分泌如權(quán)利要求3中定義的抗體或其片段。
5.組合物，其包含至少一種權(quán)利要求1的肽或至少一種權(quán)利要求3的抗體。
6.權(quán)利要求5的組合物，其作為用于評估移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的預(yù)后、診斷或監(jiān)測工具的用途。
7.用于預(yù)測或進(jìn)行哺乳動物中移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的方法，其包括下列步驟:(i)測定所述哺乳動物的生物學(xué)樣品中SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段的存在或量。
8.用于預(yù)測或進(jìn)行哺乳動物的移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的方法，其包括下述步驟:(i)測定所述哺乳動物的生物`學(xué)樣品中針對SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段產(chǎn)生的抗體的存在或量。
9.權(quán)利要求7或8的任一項的方法，其中使用免疫測定法來測量SEQID NO: 1的肽或所述肽的片段，或針對SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段產(chǎn)生的抗體的水平。
10.權(quán)利要求7或9的任一項的方法，其中所述抗體由于2011年5月4日在布達(dá)佩斯條約下、在參考號CNCM 1-4479、CNCM 1-4480和CNCM 1-4481下保藏在CNCM(巴黎)的雜交瘤之一分泌。
11.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述生物學(xué)樣品是體液樣品。
12.用于移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的試劑盒，其包括:(i)至少一種適合于結(jié)合包含SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段或由所述肽或肽片段組成的表位的抗體，(?)至少一種適合用于結(jié)合抗體-抗原復(fù)合物的偶聯(lián)至檢測系統(tǒng)的抗體，和任選地至少一種SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段。
13.SEQ ID NO: 1的肽或所述肽的片段作為用于哺乳動物中移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的標(biāo)志物的用途。
14.能夠編碼SEQ ID N0:1的肽的SEQ ID NO:2的核酸分子作為用于哺乳動物中移植器官疼痛、特別是移植或移植物排斥的體外預(yù)后或診斷的標(biāo)志物的用途。
【文檔編號】C12N5/16GK103687870SQ201280035464
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月27日
【發(fā)明者】F·艾格巴利卡 申請人:比奧維阿萊夫股份有限公司