專利名稱：一種治療肝臟移植排斥反應的懸液及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)用配制品，具體涉及一種治療肝臟移植排斥反應的懸液。
背景技術：
肝移植作為急、慢性肝功能衰竭的確切治療方法，被臨床廣泛接受和采用。國內僅2004年就完成肝移植達1800例，而在此之前從1976年到2000年，國內總計約510例。但是移植排斥反應卻大大影響了肝移植的成功率，如何解決排斥反應問題已經成為肝移植乃至器官移植學科進一步發(fā)展的主要障礙，也就成為當前移植醫(yī)學研究的熱點和重點方向。
目前臨床和基礎研究中用于治療肝臟排斥反應的方案可分為兩類使用免疫抑制劑和誘導免疫耐受。
新型免疫抑制劑的發(fā)展顯著降低了排斥反應發(fā)生率和藥物本身的毒副作用，確實在延長受體存活方面取得了重大進步。目前臨床所使用的免疫抑制劑，如環(huán)孢菌素A、FK506、雷帕霉素、賽尼哌等，其主要成分是化學制劑，或抗體蛋白。這些免疫抑制劑除了會帶來對心血管系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、以及神經系統(tǒng)等的長期不良影響外，由于受體免疫功能的非特異性抑制而引起的繼發(fā)性感染、腫瘤等的發(fā)生率明顯偏高。此外，高昂的藥物治療費用也始終是目前治療免疫排斥反應的重要缺憾。
誘導免疫耐受，即通過各種方式重新調整機體免疫系統(tǒng)，使受體免疫系統(tǒng)對移植物抗體特異性地不識別。根據理論依據的不同可分為兩大類方式一類是根據中央耐受理論設計的誘導方式，其中最為廣泛研究的是利用供體骨髓移植制造嵌合狀態(tài)以獲得供體器官耐受。但是這種誘導形式對于迄今仍占移植器官大多數(shù)來源的尸體供器官不適用。另一類是外周耐受誘導方式，其中研究較廣泛的是阻斷T細胞抗原識別共刺激信號，此類研究在動物實驗中獲得了延長移植物存活時間的效果。但由于針對MHC這類有著極豐富遺傳多樣性的抗原，人體T細胞中有相當高比例(約0.1％-10％)的克隆(Suchin EJ，et al.Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivonew answers to an old question.J.Immunol 2001；166973)能夠迅速發(fā)生識別并激活，產生一系列復雜的免疫反應，顯而易見僅阻斷其中幾個共刺激通路是不能完全解決臨床移植耐受的問題。所以，在臨床實驗中，它必須選擇性與免疫抑制劑如rapamycin等聯(lián)合使用以控制排斥反應。其它方案還有體內誘導擴增調節(jié)性T細胞，樹突狀細胞誘導耐受等，目前研究僅在嚙齒類動物實驗取得進展，大動物乃至臨床實驗的安全性和有效性還有待觀察?？傊?，由于問題本身的復雜性以及來自研究具體方式的多變性等種種原因，至今沿著單純耐受誘導的這條思路所取得的進展遠不如人意。

發(fā)明內容
在以往的對肝臟移植免疫排斥反應和骨髓干細胞分化能力研究的基礎上，本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)受體骨髓干細胞在免疫反應的選擇壓力下，受體干細胞較供體肝干細胞有生長和增勢的優(yōu)勢，并可以轉化為肝細胞，對肝移植排斥反應產生抑制作用。
因此，本發(fā)明充分利用受體骨髓干細胞的上述特性，解決肝臟移植排斥反應的技術問題。
本發(fā)明解決上述技術問題的技術方案是一種治療肝臟移植排斥反應的懸液，該懸液包含受體骨髓間充質干細胞和緩沖液，其中，受體骨髓間充質干細胞的濃度為0.25～1×106個/ml。
本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液中還包含濃度為0.25～1×106個/ml受體骨髓造血干細胞，該受體骨髓造血干細胞與受體骨髓間充質干細胞的配比為1∶1。
本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液中受體骨髓間充質干細胞和受體骨髓造血干細胞的最佳濃度均為0.5×106個/ml。
本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液中緩沖液可以是D-hanks緩沖液或PBS緩沖液，最好是PBS緩沖液。
本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)抽取受體骨髓，移入緩沖液，4℃下400～600g離心5～10min，棄上清，在沉淀物中加入紅細胞裂解液2ml，吹打混勻，靜置2～3min，再加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液8ml，混勻后4℃下400～600g離心5～10min，重復2次，棄上清，用緩沖液洗滌沉淀，并調整細胞濃度為3～10×105個/ml，制成全骨髓細胞懸液；(2)在所制得的全骨髓懸液中，加入70％Percoll分離液，4℃下600～800g離心15～20min，自上而下分成稀釋液層、有核細胞層、分離液層、紅細胞層，取呈乳白色絮狀的有核細胞層，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為1～5×106個/ml，移入的24孔板內，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至細胞完全貼壁，吸取上清液備用，貼壁細胞用0.25％胰酶消化后用緩沖液洗滌，最后用緩沖液稀釋成含受體骨髓間充質干細胞濃度為0.25～1×106個/ml的懸液即可。
若本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液中還包含濃度為0.25～1×106個/ml受體骨髓造血干細胞，那么所述懸液的制備方法由以下步驟組成(1)抽取受體骨髓，移入緩沖液，4℃下400～600g離心5～10min，棄上清，在沉淀物中加入紅細胞裂解液2ml，吹打混勻，靜置2～3min，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液8ml，混勻后，4℃下400～600g離心5～10min，重復2次，棄上清，再用緩沖液洗滌沉淀，并調整細胞濃度為3～10×105個/ml，制成全骨髓細胞懸液；(2)制得全骨髓細胞懸液后，加入70％Percoll分離液，4℃下600～800g離心15～20min，自上而下分成稀釋液層、有核細胞層、分離液層、紅細胞層，取呈乳白色絮狀的有核細胞層，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為1～5×106個/ml，移入的24孔板內，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至細胞完全貼壁，吸取上清液備用，貼壁細胞用0.25％胰酶消化后用緩沖液洗滌，并用緩沖液將受體骨髓間充質干細胞濃度稀釋至0.5～2×106個/ml；(3)取備用的上清液并收集未貼壁的細胞，對其進行原代培養(yǎng)至可見細胞集落大量出現(xiàn)，鋪滿培養(yǎng)孔底部，用緩沖液沖洗將集落沖離培養(yǎng)孔底部，并用緩沖液調整受體骨髓造血干細胞濃度至0.5～2×106個/ml；(4)將步驟2得到的含受體骨髓間充質干細胞的緩沖液與步驟3得到的含受體骨髓造血干細胞的緩沖液按1∶1的比例混合即可。
上述方法中所用的主要試劑如下1、紅細胞裂解液精密稱取NH4Cl 0.83g、KHCO30.1g和EDTA2Na 0.004g溶于1000ml三蒸水。
2、0.25％的胰蛋白酶消化液其中胰蛋白酶(Trypsin borine pancres)0.25g，EDTA 0.02g，均購于Gibco公司。
3、PBS緩沖液(0.1M)精密稱取NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO42.08g，KH2PO40.20g溶于1000ml三蒸水。
4、D-hanks緩沖液NaCl 8.00g、KCl 0.40g、Na2HPO4.H2O 0.06g、KH2PO40.35g、酚磺酞0.02g溶于1000ml三蒸水。
5、DMEM培養(yǎng)液購于美國Sigma公司。
6、胎牛血清購于Hyclone公司。
7、Percoll分離液購于美國Sigma公司。
在實際生產過程中，需要對本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液抽樣檢測與監(jiān)控。
具體檢測方法如下
取細胞懸液0.5ml加入試管，再加入0.5ml 0.4％臺盼蘭染液，混勻，靜置1-2分鐘。同時，準備好血細胞計數(shù)板及蓋玻片。將細胞懸液吸出少許，適量滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置0.5分鐘后，細胞培養(yǎng)常用倒置光學顯微鏡鏡下觀察。計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×10000，分別統(tǒng)計細胞總濃度，以及死細胞(深藍色)濃度，用細胞總濃度減去死細胞濃度即為本發(fā)明所述懸液的濃度。
本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液，由于其中骨髓干細胞取自受體本身，因此不僅能有效治療肝臟移植排斥反應，而且安全性極高，幾乎沒有不良反應，更無外源性污染和疾病傳播問題；此外，還具有骨髓細胞采集方便、簡單，不存在來源緊缺問題的優(yōu)點。
下面將通過動物實驗證明本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液能有效治療肝臟移植排斥反應。
實驗材料(一)實驗動物供體為雌性清潔級Wistar大鼠，體重200～300g；受體為雌性清潔級SD大鼠，體重200g～300g；雄性SD大鼠(提供受體特異性骨髓干細胞)，體重80～100g。供體體重等于或略低于受體。以上動物均由第一軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。
(二)主要試劑1、紅細胞裂解液精密稱取NH4Cl 0.83g、KHCO30.1g和EDTA2Na 0.004g溶于1000ml三蒸水。
2、0.25％的胰蛋白酶消化液其中胰蛋白酶(Trypsin borine pancres)0.25g，EDTA 0.02g，均購于Gibco公司。
3、PBS緩沖液(0.1M)精密稱取NaCl 8.00g，KCl 0.20g，Na2HPO42.08g，KH2PO40.20g溶于1000ml三蒸水。
4、D-hanks緩沖液NaCl 8.00g、KCl 0.40g、Na2HPO4.H2O 0.06g、KH2PO40.35g、酚磺酞0.02g溶于1000ml三蒸水。
5、DMEM培養(yǎng)液購于美國Sigma公司6、胎牛血清購于Hyclone公司7、Percoll分離液購于美國Sigma公司8、ABC免疫組化試劑盒購于Roche公司9、原位雜交試劑盒購于Roche公司
10、堿性磷酸酶抗地高辛抗體購于硝基四氮唑藍和5-溴-4-3-吲哚磷酸混合液(BCIP/NBT)11、地高辛標記的大鼠Sry基因探針購于上海生物工程公司(5′-DIG-GGGAGTGTTGGGATAGGTAGGAGC-3′)(5′-DIG-TCGGCTTCTGTAAGGCTTTTCCACT-3′)12、0.5％封閉蛋白液50ml13、2×SSC300mM NaCl 30mM檸檬酸鈉14、0.1×SSC15mM NaCl 1.5mM檸檬酸鈉0.2M Tris-HCl(三)主要實驗儀器超凈工作臺(Thermo Forma型)美國高速低溫離心機(Universal 16R型)德國Hettich公司細胞計數(shù)板浙江玉醫(yī)相差顯微鏡(CK-2)日本Olympus公司電子分析天平(ER120型)美國微量加樣器(Eppendorf)德國恒溫水浴箱(Grant)德國CX7全自動生化分析儀美國Beckman公司石臘切片機德國Leica公司風熱式電熱恒溫干燥箱廣州市電熱干燥設備廠顯微器械手術包上海醫(yī)療器械廠生產Satinsky鉗德國Martin公司生產7/0及8/0無損傷手術縫線上海醫(yī)用縫合線廠生產套管用不同粗細的市售棉棒制成門靜脈套管及肝下下腔靜脈套管，在體部刻槽。用一次性硬膜外麻醉導管(浙江嘉興市蘇嘉醫(yī)療器械廠)制成膽管支架管。
二、實驗方法(一)實驗分組將上述SD受鼠隨機分組，共5組。
A組僅行原位肝移植術，術中不行門靜脈注射，作為空白對照。
B組行原位肝移植術，術中門靜脈注射PBS緩沖液0.5ml。
C組行原位肝移植術，術中門靜脈注射本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液(含受體間充質干細胞和受體造血干細胞各5×105個/ml)0.5ml。
D組行原位肝移植術，術中門靜脈注射本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液(含受體間充質干細胞5×105個/ml)0.5ml。
E組行原位肝移植術，術中門靜脈注射受體造血干細胞懸液0.5ml(5×105個/ml)。
手術前一天開始給予受體大鼠亞治療劑量的環(huán)孢素A，0.25mg/kg，肌注，1次/天×14天，幫助手術后的受體大鼠渡過超急性排斥期。術后燈照復溫1h。術后三天內給予10％葡萄糖水，單籠喂養(yǎng)。
(二)觀察指標和方法1.一般情況體重、神態(tài)、飲食、活動、毛發(fā)、黃疸等。
2.存活時間。
3.肝功能測定正常大鼠及受鼠移植術后1周分別尾靜脈采血運用CX7全自動生化分析儀，用直接活力測定法測定血清丙氨酸氨基轉移酶(Alanine transaminase，ALT)及血清總膽紅素(Total bilirubin，TBil)。
4.組織病理學檢查肝移植急性排斥反應的組織病理學診斷標準按照Williams等的方法，根據移植肝的組織病變情況，將急性排斥反應的程度分為4級0級 匯管區(qū)有淋巴細胞浸潤，但無明顯的組織膽道損傷。對急性排斥反應無診斷價值。
1級 輕度排斥；輕度的以淋巴細胞為主的匯管區(qū)細胞浸潤，伴有輕度的血管內皮炎和膽道損傷。
2級 中度排斥；匯管區(qū)較重的淋巴細胞浸潤并伴膽管損害及延伸到肝小葉內，伴有肝細胞局灶性壞死，但無小葉中央壞死或橋接壞死。
3級 重度排斥；匯管區(qū)顯著的淋巴細胞浸潤，伴有間質出血及缺血性肝細胞壞死或肝實質橋接壞死。
本實驗中急性排斥反應的診斷標準為病理改變在1級或1級以上。
5.Sry原位雜交染色設立嚴格的對照組陰性對照為雌性Wistar大鼠肝臟Sry原位雜交；陽性對照為雄性SD大鼠肝臟Sry原位雜交。
(1)探針的準備將探針配成50pmoL/μl的母液，-20℃保存，臨用前稀釋成10pmoL/μl。
(2)玻片的處理
去污劑浸泡一晚，大量自來水沖洗，然后蒸餾水沖洗。
干燥后，浸入丙酮中3分鐘。
玻片用蒸餾水略加清洗后，干燥備用。
(3)肝臟組織切片的準備C組、D組、E組受鼠術后60天、90天分別切取1cm×1cm×0.5cm大小肝臟標本，4％中性緩沖甲醛液固定72小時以上，石蠟包埋。
常規(guī)切片肝臟組織切片撈于涂有粘片劑的玻片上。
切片處理先置60℃烘片30分鐘。二甲苯脫臘，逐級酒精至水清洗。
臨用前配制蛋白酶K(Proteinase K)溶液實驗之前將蛋白酶K 10mg/ml、0.1ml/支分裝，-20℃保存，用時取1支用無菌雙蒸水10倍稀釋使用，4℃可保存一個星期。
每片滴加20μl-30μl蛋白酶K，在37℃濕盒中消化孵育20-30min，消化過程中加硅化蓋玻片，防止液體蒸干。
(4)雜交蛋白酶K消化后，去除蓋玻片，用4％甲醛固定5分鐘。蒸餾水洗5分鐘。讓切片上的水分在室溫下自然干燥5分鐘，但只能讓切片上的水分減少，不能完全干燥。
每張切片加20μl探針；對照組切片加20μl不加探針的雜交液。
加蓋原位雜交專用的硅化蓋玻片，不能留有氣泡。置于95℃變性6分鐘。
把玻片放到冰上1分鐘。
將切片放入濕盒中，42℃，3小時。
(5)沖洗揭掉蓋玻片，30-37℃左右水溫2×SSC洗滌5分鐘×2次，0.1×SSC洗滌10min×1次。
(6)雜交分子的檢測---BCIP/NBT切片置于0.1MTBS緩沖液中，室溫2分鐘。
每張切片加20μl封閉液，室溫反應15分鐘。
用500倍封閉液稀釋堿性磷酸酶抗地高辛抗體，每張切片加20μl稀釋試劑，濕盒中37℃反應2小時。
0.1MTBS緩沖液洗10分鐘×3次。
0.2MTris-HCL，10mM MgCL2，平衡5分鐘。
將顯色劑BCIP/NBT用上述緩沖液1∶50稀釋，每張切片加20μl，至黑暗處顯色，一般5分鐘即可。
6.Sry原位雜交和甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(albumin)免疫組化雙重染色設立嚴格的對照組AFP免疫組化陰性對照為成熟大鼠肝臟，陽性對照為2周胎齡胎鼠肝臟；白蛋白免疫組化陰性對照為大鼠脾臟，陽性對照為成熟大鼠肝臟；原位雜交對照見上。
(1)獲取標本制作石蠟切片及脫臘程序同前。
(2)在切片上加1-3滴過氧化物酶阻斷劑五分鐘。
(3)用緩沖液漂洗標本5分鐘，要輕柔地沖洗標本，否則會使肝組織從片上滑脫。
(4)加1-3滴血清阻斷劑D孵浴15分鐘，甩干，仔細擦去多余的阻斷劑。加1-3滴抗生物素阻斷劑孵浴15分鐘。
(5)用緩沖液漂洗標本，甩干，仔細擦去多余的緩沖液，加1-3滴生物素阻斷劑孵浴15分鐘。
(6)用緩沖液漂洗標本，甩干，仔細擦去多余的緩沖液。
(7)加羊抗大鼠白蛋白單克隆抗體或羊抗大鼠AFP單克隆抗體37℃孵浴2小時，或加緩沖液設立對照。
(8)用緩沖液漂洗標本，洗三次(15分鐘)，甩干，仔細擦去多余的緩沖液。
(9)加1-3滴生物素標記的二抗37℃孵浴30-60分鐘。用緩沖液漂洗標本，洗三次(15分鐘)，甩干，仔細擦去多余的緩沖液。
(10)加1-3滴HSS-HRP孵浴30分鐘，用緩沖液漂洗三次(2分鐘)，甩干，仔細擦去多余的緩沖液。
(11)加兩滴DAB到2ml染料緩沖液中，取1-5滴新鮮配的DAB溶液孵浴3-20分鐘。
(12)在光鏡下注意觀察染色的程度保證合適的染色。用蒸餾水漂洗，然后緩沖液洗5分鐘。
(13)雜交蛋白酶K消化后，去除蓋玻片，用4％的甲醛固定5分鐘；蒸餾水洗5分鐘；讓切片上的水分在室溫下自然干燥5分鐘，但只能讓切片上的水分減少，不能完全干燥；每張切片加20μl探針，并設立嚴格的對照組(每張切片加20μl不加探針的雜交液)；加蓋原位雜交專用的硅化蓋玻片，不能留有氣泡，置于95℃變性6分鐘；
把玻片放到冰上1分鐘；將切片放入濕盒中，42℃，3小時。
(14)沖洗揭掉蓋玻片，30-37℃左右水溫2×SSC洗滌5分鐘×2次，0.1×SSC洗滌10分鐘×1次。
(15)雜交分子的檢測--BCIP/NBT切片置于0.1MTBS緩沖液中，室溫2分鐘；每張切片加20μl封閉液，室溫反應15分鐘；用封閉液1∶500稀釋堿性磷酸酶抗地高辛抗體，每張切片加20μl稀釋試劑，濕盒中37℃反應2小時；0.1MTBS洗10分鐘×3次；0.2MTris-HCL，10mM MgCL2，平衡5分鐘；將顯色劑BCIP/NBT用上述緩沖液1∶50稀釋，每張切片加20μl，至黑暗處顯色，一般5分鐘即可。
(三)統(tǒng)計學處理全部數(shù)據均由SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計學處理。生存分析采用近似時序檢驗(Log-Rank檢驗)，乘積極限法(Kaplan-Meier法)作生存曲線。多組間比較采用完全隨機方差分析，SNK法分析組間差異性。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異非常顯著。
三、實驗結果(一)、一般情況各組受體大鼠均于肝移植術后清醒，立起并可爬行，術后1天即可進食。A組及B組大鼠移植后5~7天出現(xiàn)耳廓皮膚黃染及尿色深黃，精神萎靡，反應遲鈍，毛發(fā)蓬亂無光澤，進食及活動減少，體重持續(xù)下降，尸檢時肝臟顏色稍淡，輕度腫脹，質地變硬，腹腔偶有少量腹水。C組、D組、E組大鼠術后活潑，反應靈敏，進食及活動好，毛發(fā)整齊光亮，未出現(xiàn)黃疸，體重下降不明顯。
(二)、存活時間各組大鼠肝移植術后的存活情況見表1，計算中位生存時間(Median survivaltime，MST)，生存曲線見圖1。C組、D組、E組比A組、B組生存時間明顯延長，有顯著差異(P＜0.05)；C組、D組比E組生存時間明顯延長，有顯著差異(P＜0.05)；C組、D組生存時間比較無顯著性差異(P＞0.05)；A組、B組生存時間比較無顯著性差異(P＞0.05)
表1各組大鼠肝移植術后存活情況

(三)、肝功能測定移植術后1周各組肝功能檢測結果見表2和圖2、圖3各組血清ALT、TBil均較正常值增高(P＜0.05)；C組、D組、E組血清ALT、TBil值明顯低于A組、B組，有顯著差異(P＜0.05)；C組、D組血清ALT、TBil無顯著差異(P＞0.05)，但都明顯低于E組，有顯著性差異(P＜0.05)；B的血清ALT、Tbil高于A組，有顯著差異(P＜0.05)。
表2各組大鼠肝移植術后1周血清肝功能變化(±S)

注為與A、B、C、D、E組比較P＜0.01，☆與A、B比較P＜0.01，△與B比較P＜0.01，★與E比較P＜0.01，C與D比較P＞0.05(四)、組織病理學檢查正常大鼠肝臟病理示肝細胞排列成索狀，圍繞中央靜脈成放射狀排列，匯管區(qū)無炎性細胞浸潤。
移植術后10天，A組和B組均呈急性中重度排斥反應。移植肝細胞索狀排列紊亂或消失，肝細胞出現(xiàn)氣球樣變，并可見大片狀壞死；中央靜脈血管擴張充血，血管壁及血管周圍炎性細胞浸潤；匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤，主要為淋巴細胞，膽管上皮壞死、脫落及增生，管壁炎性細胞浸潤，血管內膜損傷，有明顯出血。
移植術后60天、90天C、D、E各組均無明顯的急性排斥反應，僅見血管輕度擴張充血，肝細胞索狀排列較整齊，小葉結構清晰，肝細胞濁腫程度輕，僅見點狀壞死，及空泡形成，局部見肝細胞增生成團，核分裂明顯，可見多個核仁的肝細胞，匯管區(qū)炎性細胞浸潤少，見極少量的淋巴細胞和漿細胞浸潤，匯管區(qū)纖維增生不明顯，見多個小膽管增生，及少量血管內皮增生，無假小葉形成，匯管區(qū)血管內皮完整，內膜無纖維素樣壞死，血管壁無增厚及纖維化。
(五)、Sry原位雜交各組肝移植術后大鼠肝臟Sry陽性細胞百分率(即移植細胞的替代率)見表3和圖4。計算方法為隨機取10個高倍視野(×400)，計算Sry陽性細胞數(shù)占所有細胞數(shù)的比率。術后60天，C組、D組、E組大鼠肝臟中均見Sry陽性細胞，細胞核呈藍色，核仁呈深藍色，單個或多個核仁，細胞漿染色不明顯。C組和D組的替代率無顯著差異(P＞0.05)；但都明顯高于E組，有顯著性差異(P＜0.05)；表3各組肝移植術后大鼠移植細胞的替代率(±S)

注*與E比較P＜0.01，C與D比較P＞0.05(六)、Sry原位雜交和甲胎蛋白(AFP)免疫組化雙重標記Sry原位雜交與AFP免疫組化雙陽性細胞占Sry原位雜交陽性細胞百分率見表5，計算方法為隨機取10個高倍視野(×400)，計算雙陽性細胞數(shù)占Sry原位雜交陽性細胞數(shù)的比率。代表移植的受體特異性骨髓干細胞中有多少分化為肝細胞。
Sry原位雜交和AFP免疫組化雙陽性細胞百分率見表4和圖5。術后60天，C組、D組、E組大鼠肝臟中均見多個雙染的細胞，細胞核Sry陽性呈藍色，核仁呈深藍色，單個或多個核仁，細胞漿AFP陽性呈棕色。計算方法為隨機取10個高倍視野(×400)，計算雙陽性細胞數(shù)占所有細胞數(shù)的比率。C組和D組的Sry原位雜交和AFP免疫組化雙陽性細胞百分率無顯著差異(P＞0.05)，但都明顯高于E組；有顯著性差異(P＜0.05)。C組、D組、E組各組第60天和第90天，Sry原位雜交和AFP免疫組化雙陽性細胞百分率無明顯差異(P＞0.05)。
表4各組Sry原位雜交和AFP免疫組化雙陽性細胞百分率(±S)

注*與E比較P＜0.01，C與D比較P＞0.05表5 Sry原位雜交與AFP免疫組化雙陽性細胞占Sry原位雜交陽性細胞百分率(±S)

(七)、Sry原位雜交和白蛋白免疫組化雙重染色Sry原位雜交與白蛋白免疫組化雙陽性細胞占Sry原位雜交陽性細胞百分率見表7，計算方法為隨機取10個高倍視野(×400)，計算雙陽性細胞數(shù)占Sry原位雜交陽性細胞數(shù)的比率。該百分率代表移植的受體特異性骨髓干細胞中有多少分化為肝細胞。
Sry原位雜交和白蛋白免疫組化雙陽性細胞百分率見表6和圖6。術后60天，各組均見多個雙染的細胞，細胞核Sry陽性呈藍色，核仁呈深藍色，單個或多個核仁，細胞漿白蛋白陽性呈棕色。計算方法為隨機取10個高倍視野(×400)，計算雙陽性細胞數(shù)占所有細胞數(shù)的比率。C組和D組的Sry原位雜交和白蛋白免疫組化雙陽性細胞百分率無顯著差異(P＞0.05)，但都明顯高于E組，有顯著性差異(P＜0.05)，見表7。C組、D組、E組各組第60天和第90天，Sry原位雜交和白蛋白免疫組化雙陽性細胞百分率無明顯差異(P＞0.05)。
表6各組Sry原位雜交和白蛋白免疫組化雙陽性細胞百分率(±S)

注*與E比較P＜0.01，C與D比較P＞0.05
表7 Sry原位雜交與白蛋白免疫組化雙陽性細胞占Sry原位雜交陽性細胞百分率(±S)

C組、D組、E組各組，Sry原位雜交、AFP免疫組化雙陽性細胞百分率與Sry原位雜交、白蛋白免疫組化雙陽性細胞百分率比較無顯著性差異(P＞0.05)。
上述實驗表明，進行原位肝移植手術后接受本發(fā)明所述的治療肝移植排斥反應的懸液治療的大鼠的生存時間明顯延長，健康狀況良好，基本無急性排斥反應；從分子水平來看，受體骨髓干細胞分化為干細胞的百分率也高達85％以上。可見，本發(fā)明能有效治療肝移植排斥反應。


圖1是各組大鼠肝移植術后生存曲線圖。
圖2是各組大鼠肝移植術后1周血清0TBil變化直方圖。
圖3是各組大鼠肝移植術后1周血清ALT變化直方圖。
圖4是各組肝移植術后大鼠肝臟移植細胞的替代率直方圖。
圖5是各組Sry原位雜交和AFP免疫組化雙陽性細胞百分率直方圖。
圖6是各組Sry原位雜交和白蛋白免疫組化雙陽性細胞百分率直方圖。
具體實施例方式
實施例11、配方0.5×106個/ml受體骨髓間充質干細胞，PBS緩沖液。
2、制備方法將同系受體大鼠乙醚麻醉后，在無菌條件下抽取股骨骨髓，移入PBS緩沖液中，400g，離心5分鐘，棄上清，沉淀以含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液緩慢沖洗懸浮，加入紅細胞裂解液2ml，吹打混勻2分鐘。400g離心10分鐘，棄上清，去除紅細胞，用PBS緩沖液洗滌2次。最后通過200目不銹鋼絲網過濾，用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，用PBS緩沖液調整細胞濃度為5×105個/ml，制成0.5ml全骨髓細胞懸液。制得全骨髓懸液后，加入70％Percoll分離液，600g，離心15分鐘，自上而下分成稀釋液層、呈乳白色絮狀的有核細胞層、分離液層、管底部分紅細胞，取稀釋液和分離液層之間的有核細胞層，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為2×105個/ml，移入的24孔板內，在37℃、5％CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)，觀察細胞貼壁生長情況，48小時后當細胞完全貼壁時，吸取上清液放入另一細胞瓶中，貼壁細胞用0.25％胰酶消化，并用PBS緩沖液洗滌2次，用200目不銹鋼絲網過濾，調整細胞濃度為0.5×106個/ml。
3、檢驗鑒定取上述細胞懸液0.5ml加入試管，再加入0.5ml0.4％臺盼蘭染液，混勻，靜置1-2分鐘。同時，準備好血細胞計數(shù)板及蓋玻片。將細胞懸液吸出少許，適量滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置0.5分鐘后，鏡下觀察。計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×10000，分別統(tǒng)計細胞總濃度，以及死細胞(深藍色)濃度。檢測結果間充質干細胞的活細胞總量為0.5×106個/ml。
4、使用方法在原位肝移植術即將完畢關腹前，在門靜脈緩慢注入本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液0.5ml。手術前一天給予受者亞治療劑量的環(huán)孢素A0.25mg/kg，肌注，1次/天×14天。
實施例21、配方0.25×106個/ml受體骨髓間充質干細胞，D-hanks緩沖液。
2、制備方法將同系受體大鼠乙醚麻醉后，在無菌條件下抽取股骨骨髓，移入D-hanks緩沖液中，400g，離心5分鐘，棄上清，沉淀以含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液緩慢沖洗懸浮，加入紅細胞裂解液2ml，吹打混勻2分鐘。400g離心10分鐘，棄上清，去除紅細胞，共用D-hanks緩沖液洗滌2次。最后通過200目不銹鋼絲網過濾，用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，用D-hanks緩沖液調整細胞濃度為3×105個/ml，制成0.5ml全骨髓細胞懸液。制得全骨髓懸液后，加入70％Percoll分離液，600g，離心15分鐘，分成稀釋液層、呈乳白色絮狀的有核細胞層、分離液層、管底部分紅細胞，取稀釋液和分離液層之間的有核細胞層，用15％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為2×105個/ml，移入的24孔板內，在37℃、5％CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)，觀察細胞貼壁生長情況，48小時后當細胞完全貼壁時，吸取上清液放入另一細胞瓶中，貼壁細胞用0.25％胰酶消化，并用D-hanks緩沖液洗滌2次，用200目不銹鋼絲網過濾，調整細胞濃度為0.25×106個/ml。
3、檢驗鑒定取上述細胞懸液0.5ml加入試管，再加入0.5ml0.4％臺盼蘭染液，混勻，靜置1-2分鐘。同時，準備好血細胞計數(shù)板及蓋玻片。將細胞懸液吸出少許，適量滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置0.5分鐘后，鏡下觀察。計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×10000，分別統(tǒng)計細胞總濃度，以及死細胞(深藍色)濃度。檢測結果間充質干細胞的活細胞總量為0.25×106個/ml。
4、使用方法在原位肝移植術即將完畢關腹前，在門靜脈緩慢注入本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液1.0ml。手術前一天給予受者亞治療劑量的環(huán)孢素A0.25mg/kg，肌注，1次/天×14天。
實施例31、配方1×106個/ml受體骨髓間充質干細胞，PBS緩沖液。
2、制備方法將同系受體大鼠乙醚麻醉后，在無菌條件下抽取股骨骨髓，移入PBS緩沖液中，500g，離心5分鐘，棄上清，沉淀以含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液緩慢沖洗懸浮，加入紅細胞裂解液2ml，吹打混勻2分鐘。500g離心10分鐘，棄上清，去除紅細胞，共用PBS緩沖液洗滌2次。最后通過200目不銹鋼絲網過濾，用細胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，用PBS緩沖液調整細胞濃度為10×105個/ml，制成0.5ml全骨髓細胞懸液。制得全骨髓懸液后，加入70％Percoll分離液，800g，離心15分鐘，自上而下分成稀釋液層、呈乳白色絮狀的有核細胞層、分離液層、管底部分紅細胞，取稀釋液和分離液層之間的有核細胞層，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為2×105個/ml，移入的24孔板內，在37℃、5％CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)，觀察細胞貼壁生長情況，48小時后當細胞完全貼壁時，吸取上清放入另一細胞瓶中，貼壁細胞用0.25％胰酶消化，并用PBS緩沖液洗滌2次，用200目不銹鋼絲網過濾，調整細胞濃度為1×106個/ml。
3、檢驗鑒定取上述細胞懸液0.5ml加入試管，再加入0.5ml0.4％臺盼蘭染液，混勻，靜置1-2分鐘。同時，準備好血細胞技術板及蓋玻片。將細胞懸液吸出少許，適量滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置0.5分鐘后，鏡下觀察。計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×10000，分別統(tǒng)計細胞總濃度，以及死細胞(深藍色)濃度。檢測結果間充質干細胞的活細胞總量為1×106個/ml。
4、使用方法在原位肝移植術即將完畢關腹前，在門靜脈緩慢注入本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液0.25ml。手術前一天給予受者亞治療劑量的環(huán)孢素A0.25mg/kg，肌注，1次/天×14天。
實施例4
1、配方0.5×106個/ml受體骨髓間充質干細胞，0.5×106個/ml受體骨髓造血干細胞，PBS緩沖液。
2、制備方法將同系受體大鼠乙醚麻醉后，在無菌條件下抽取股骨骨髓，移入PBS緩沖液，4℃下600g離心8min，棄上清。在細胞沉淀中加入紅細胞裂解液2ml，吹打混勻，靜置2～3min，再加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液8ml，混勻。離心2次，條件同上。棄上清，用PBS緩沖液洗滌，離心2次，條件同上。用PBS緩沖液調整細胞濃度為10×105個/ml，制成全骨髓細胞懸液；制得全骨髓懸液后，加入70％Percoll分離液，4℃下800g離心20min，分成稀釋液層、呈乳白色絮狀的有核細胞層、分離液層、管底部分紅細胞，取稀釋液和分離液層之間的有核細胞層，用15％胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為5×106個/ml，移入的24孔板內，在37℃、5％CO2條件下，常規(guī)培養(yǎng)，48小時后當細胞完全貼壁時，吸取上清放入另一細胞瓶中備用，貼壁細胞用0.25％胰酶消化，并用PBS緩沖液洗滌，4℃下500g離心10min。用PBS緩沖液調整細胞濃度為0.5×106個/ml，制成受體骨髓間充質干細胞懸液；從上步驟的備用上清中收集未貼壁的細胞，進行原代培養(yǎng)48-72小時后可見細胞集落大量出現(xiàn)，鋪滿培養(yǎng)孔底部，用PBS緩沖液沖洗將集落沖離底孔，獲得含造血干細胞濃度較高的細胞懸液，用PBS緩沖液調整細胞濃度為0.5×106個/ml，制成受體骨髓造血干細胞懸液；將上述制得的受體骨髓間充質干細胞懸液和受體骨髓造血干細胞懸液按照1∶1的比例混合。
3、檢驗鑒定取上述細胞懸液0.5ml加入試管，再加入0.5ml0.4％臺盼蘭染液，混勻，靜置1-2分鐘。同時，準備好血細胞計數(shù)板及蓋玻片。將細胞懸液吸出少許，適量滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。靜置0.5分鐘后，鏡下觀察。計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/4×10000，分別統(tǒng)計細胞總濃度，以及死細胞(深藍色)濃度。檢測結果間充質干細胞的活細胞數(shù)量和造血紅細胞的活細胞數(shù)量均為0.5×106個/ml。
4、使用方法在原位肝移植術即將完畢關腹前，在門靜脈緩慢注入本發(fā)明所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液0.5ml。手術前一天給予受者亞治療劑量的環(huán)孢素A0.25mg/kg，肌注，1次/天×14天。
權利要求
1.一種治療肝臟移植排斥反應的懸液，該懸液包含受體骨髓間充質干細胞和緩沖液，其中，受體骨髓間充質干細胞的濃度為0.25～1×106個/ml。
2.根據權利要求1所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液，其特征在于還包含濃度為0.25～1×106個/ml受體骨髓造血干細胞，該受體骨髓造血干細胞與受體骨髓間充質干細胞的配比為1∶1。
3.根據權利要求2所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液，其特征在于受體骨髓間充質干細胞和受體骨髓造血干細胞的濃度均為0.5×106個/ml。
4.根據權利要求1、2或3所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液，其特征在于緩沖液是D-hanks緩沖液或PBS緩沖液。
5.根據權利要求1、2或3所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液，其特征在于緩沖液是PBS緩沖液。
6.權利要求1所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)抽取受體骨髓，移入緩沖液，4℃下400～600g離心5～10min，棄上清，在沉淀物中加入紅細胞裂解液2ml，吹打混勻，靜置2～3min，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液8ml，混勻后，4℃下400～600g離心5～10min，重復2次，棄上清，再用緩沖液洗滌沉淀，并調整細胞濃度為3～10×105個/ml，制成全骨髓細胞懸液；(2)制得全骨髓細胞懸液后，加入70％Percoll分離液，4℃下600～800g離心15～20min，自上而下分成稀釋液層、有核細胞層、分離液層、紅細胞層，取呈乳白色絮狀的有核細胞層，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為1～5×106個/ml，移入的24孔板內，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至細胞完全貼壁，吸取上清液備用，貼壁細胞用0.25％胰酶消化后用緩沖液洗滌，最后用緩沖液稀釋成含受體骨髓間充質干細胞濃度為0.25～1×106個/ml的懸液即可。
7.權利要求2或3所述的治療肝臟移植排斥反應的懸液的制備方法，該方法由以下步驟組成(1)抽取受體骨髓，移入緩沖液，4℃下400～600g離心5～10min，棄上清，在沉淀物中加入紅細胞裂解液2ml，吹打混勻，靜置2～3min，然后加入含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液8ml，混勻后，4℃下400～600g離心5～10min，重復2次，棄上清，再用緩沖液洗滌沉淀，并調整細胞濃度為3～10×105個/ml，制成全骨髓細胞懸液；(2)制得全骨髓細胞懸液后，加入70％Percoll分離液，4℃下600～800g離心15～20min，自上而下分成稀釋液層、有核細胞層、分離液層、紅細胞層，取呈乳白色絮狀的有核細胞層，用含15％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為1～5×106個/ml，移入的24孔板內，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)至細胞完全貼壁，吸取上清液備用，貼壁細胞用0.25％胰酶消化后用緩沖液洗滌，并用緩沖液將受體骨髓間充質干細胞濃度稀釋至0.5～2×106個/ml；(3)取備用的上清液并收集未貼壁的細胞，對其進行原代培養(yǎng)至可見細胞集落大量出現(xiàn)，鋪滿培養(yǎng)孔底部，用緩沖液沖洗將集落沖離培養(yǎng)孔底部，并用緩沖液調整受體骨髓造血干細胞濃度至0.5～2×106個/ml；(4)將步驟2得到的含受體骨髓間充質干細胞的緩沖液與步驟3得到的含受體骨髓造血干細胞的緩沖液按1∶1的比例混合即可。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種治療肝臟移植排斥反應的懸液，該懸液包含受體骨髓間充質干細胞和緩沖液，還包含受體骨髓造血干細胞。本發(fā)明所述的懸液的制備方法是先從受體骨髓中分離得到的受體骨髓間充質干細胞和受體骨髓造血干細胞，再將受體骨髓間充質干細胞調制成細胞濃度為0.25～1×10
文檔編號A61K35/28GK1943785SQ20061012281
公開日2007年4月11日 申請日期2006年10月17日 優(yōu)先權日2006年10月17日
發(fā)明者高毅, 汪艷, 潘明新, 張志 , 徐小平, 單毓強 申請人:南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院