專利名稱：一種預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的引物及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肝移植監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的引物及方法。
背景技術(shù)：
肝臟移植是終末期肝臟疾病的最有效的治療方案之一，肝移植術(shù)后受者面臨著嚴(yán)重的移植物急性排斥風(fēng)險(xiǎn)。近年來得益于術(shù)后免疫抑制劑廣泛應(yīng)用以及新型免疫抑制劑面世，全球肝移植中心平均急性排斥發(fā)生率約為15%至45%。
移植受者與供者間的遺傳差異是移植物排斥反應(yīng)主要誘因，來自免疫系統(tǒng)的T淋巴細(xì)胞在排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。急性排斥反應(yīng)的病理學(xué)判斷的重要標(biāo)準(zhǔn)就是移植肝匯管區(qū)中出現(xiàn)大量單核的炎性細(xì)胞浸潤。急性排斥過程中抗原遞呈細(xì)胞表面的B7家族蛋白與T細(xì)胞表面的配體作用，啟動(dòng)T細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)改變，調(diào)控T細(xì)胞的免疫活性；宿主T細(xì)胞一旦激活后，T細(xì)胞開始發(fā)生克隆增殖、分化為效應(yīng)細(xì)胞、遷移至移植物并加速移植物功能喪失。研究表明共刺激分子如B7家族蛋白，可作為抗移植物排斥的重要治療靶點(diǎn)。從蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來分析B7蛋白屬于IgG超家族，通常表達(dá)在APC細(xì)胞表面。目前研究得比較透徹的B7蛋白為B7-1和B7-2 (即⑶80和⑶86)，這兩個(gè)B7蛋白可結(jié)合不同的T細(xì)胞胞膜蛋白，發(fā)揮免疫共刺激或共抑制作用。例如當(dāng)B7-1或B7-2與T細(xì)胞表面的CD28結(jié)合時(shí)能夠傳遞共刺激信號(hào)，而與另一個(gè)配體CTLA-4結(jié)合時(shí)能夠傳遞共抑制信號(hào)。已有研究表明B7-H3可作為共刺激因子促進(jìn)⑶4+和⑶8+細(xì)胞增殖、IFN- Y分泌以及CD8+細(xì)胞毒活性。小鼠異基因型心臟移植模型研究表明，移植后的B7-H3基因敲除小鼠和對(duì)照組都發(fā)生排斥現(xiàn)象，但是對(duì)受者施用諸如環(huán)孢素A和雷帕鳴等免疫抑制劑后，B7-H3基因敲除小鼠的慢性排斥發(fā)生率顯著下降。此外B7-H3還表現(xiàn)出負(fù)向調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞的能力，如抑制T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子分泌等。一般認(rèn)為T細(xì)胞表面既有B7-H3共刺激配體，也具有共抑制配體，而TLT-2被認(rèn)為是B7-H3的免疫共刺激作用的配體。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域期盼著個(gè)體化治療的建立及應(yīng)用，在器官移植領(lǐng)域中個(gè)體化的免疫抑制方案也日益受到醫(yī)療工作者的關(guān)注。各種生物科學(xué)技術(shù)，如基因表達(dá)芯片、蛋白質(zhì)組、質(zhì)譜分析及全基因組相關(guān)性分析等手段正揭示著大量的分子標(biāo)志物(包括mRNA、miRNA、蛋白、小分子化學(xué)物質(zhì)以及SNP、SSR、L0H和CNV等遺傳標(biāo)簽)。這些標(biāo)志物往往參與著各種生理生化過程，可指示疾病診斷、分期以及臨床反應(yīng)、預(yù)后等?；颊弑舜碎g的遺傳特性決定了各種生理差異，促使醫(yī)療工作者能夠通過病患的遺傳特性及時(shí)預(yù)判移植物排斥反應(yīng)，并在機(jī)體組織發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)損傷前進(jìn)行干預(yù)。此外以上所述的各類標(biāo)志物皆可通過客觀手段進(jìn)行有效測(cè)定，避免了主觀判斷。研究表明細(xì)胞因子和共刺激分子的SNP與多種實(shí)體器官移植術(shù)后的急性排斥的發(fā)生相關(guān)，但是相關(guān)研究的發(fā)現(xiàn)并未近一步加強(qiáng)鑒別移植受者急性排斥風(fēng)險(xiǎn)，以及建立一套可定性定量的急排危險(xiǎn)鑒定模型，使受者獲得合理的免疫抑制治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的引物，利用該引物可以擴(kuò)增B7-H3基因SNP位點(diǎn)(rs2127015)及檢測(cè)其基因型。一種預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的引物，包括一對(duì)PCR擴(kuò)增引物和用于對(duì)擴(kuò)增片段測(cè)序的延伸引物，其中PCR擴(kuò)增弓丨物包括正向引物GGGAAATAACCAGTITTATggggaaga；反向引物TGCATTTTCAAAACCCCagtga； 其中，延伸引物為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGATCGATAATCTTGT TCTTAATCC。本發(fā)明還提供了一種預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括(I)檢測(cè)受者B7-H3基因單堿基突變位點(diǎn)rs2127015的基因型；(2)檢測(cè)受者是否感染HBV ；(3)計(jì)算受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)A ；A = -1. 122+1. 493XB+0. 817XC其中，當(dāng)所述基因型為T/T和C/T時(shí)，B = 1，當(dāng)所述基因型為C/C時(shí)，B = O ;如受者已感染HBV，C = 1，如受者未感染，C = O。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)為(a)從受者外周血中提取基因組DNA ；(b)以基因組DNA為模板，利用引物對(duì)a進(jìn)行PCR擴(kuò)增，收集擴(kuò)增產(chǎn)物；(c)利用延伸引物b對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確定B7-H3基因單堿基突變位點(diǎn)rs2127015的基因型；弓丨物對(duì)a 的正向引物為GGGAAATAACCAGTTTTATggggaaga ；弓丨物對(duì)a 的反向引物為TGCATTTTCAAAACCCCagtga ；延伸引物b為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGATCGATAATCTTGT TCTTAATCC。本發(fā)明設(shè)計(jì)的弓I物特異性好，能有效擴(kuò)增rs2127015位點(diǎn)周圍的DNA片段，通過延伸引物可以對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行正確測(cè)序，確定rs2127015位點(diǎn)的基因型。本發(fā)明方法操作簡單，預(yù)測(cè)受者發(fā)生急性排斥的型敏感性達(dá)為69. 8%，特異性未54. 7%。


圖1為B7-H3和TLT-2基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)引物表。圖2為B7-H3和TLT-2基因單核苷酸多態(tài)性與移植肝急性排斥發(fā)生的相關(guān)性分析表。圖3為B7-H3和TLT-2基因單倍型分析圖，SNPl至SNPll分別代表rsl 1072431、rsll574495、 rsl2593558、 rsl2594627、 rs2127015、 rs3816661、 rs7176654、 rs4714431、rs6915083、rs7754593 和 rs9394767。
圖4為B7-H3和TLT-2基因單倍型與移植肝急性排斥發(fā)生的相關(guān)性分析表。圖5為移植受者原發(fā)病與急性排斥發(fā)生的相關(guān)性分析表。圖6為本發(fā)明急排風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型的AUROC分析圖；實(shí)線表示ROC曲線，虛線為參照線。
具體實(shí)施例方式一、人群選擇共入組患者388名，其中341名男性、47名女性、年齡21至69歲。在回顧性研究中入組患者299名，為2006至2009年進(jìn)行肝臟移植手術(shù)受者。前瞻性研究中入組受者89名，為2010至2011年進(jìn)行肝臟移植手術(shù)受者。入組受者的病因包括了乙肝感染、肝細(xì)胞肝癌、重型肝炎和肝硬化失代償。
二、免疫抑制方案移植術(shù)后首月他克莫司血藥濃度控制在10_12ng/mL,第一年其它月份中濃度控制在8-10ng/mL,此后控制在5-8ng/mL。期間嗎替麥考酹酯每天用量為l_2g。皮質(zhì)類固醇激素的施用方法為，手術(shù)當(dāng)天施用IOOOmg潑尼松龍，繼而在術(shù)后第一天施用240mg甲基強(qiáng)的松龍，其后每天降低甲基強(qiáng)的松龍用量，至術(shù)后2月時(shí)停藥。三、急性排斥定義急性排斥通過肝臟活檢、Banff病理分級(jí)明確，術(shù)后6月內(nèi)發(fā)生的排斥反應(yīng)被認(rèn)為是急性排斥。四、DNA提取及基因型鑒定基因組DNA提取自移植受者外周血，提取設(shè)備采用Promega公司Maxwell 16自動(dòng)化DNA提取儀，提取步驟參照相應(yīng)說明文件。通過Hapmap網(wǎng)站分析B7-H3和TLT-2基因SNP位點(diǎn)信息，入選SNP位點(diǎn)需符合最小等位基因頻率不低于20%以及r2不小于O. 8。提取后的DNA樣本用IyL 1% agarose電泳對(duì)其樣本進(jìn)行質(zhì)量檢查以及濃度估計(jì)，然后根據(jù)估計(jì)的濃度將樣本稀釋到工作濃度5-10ng/y I。分別根據(jù)不同SNP位點(diǎn)配置PCR體系反應(yīng)體系(10μ I):其中包含 Ix GC buffer I (TAKARA)，3. OmM Mg2+，O. 3mM dNTP, IU HotStarTaq polymerase (Qiagen Inc. ), I μ I 樣本 DNA 和 I μ I 擴(kuò)增引物(見圖1)。PCR 循環(huán)程序95°C 2 分鐘；11 個(gè)循環(huán) X (94°C 20 秒，65°C -O. 5°C / 循環(huán) 40 秒，720C I 分 30 秒);24 循環(huán) X (94°C 20 秒，59°C 30 秒，72V1. 5 分鐘);72°C 2 分鐘；保持
4。。。PCR 產(chǎn)物純化，在 10 μ I PCR 產(chǎn)物中加入 IU SAP 酶和 IU Exonuclease I 酶，37°C溫浴I小時(shí)，然后75°C滅活15分鐘。SNaPshot多重單堿基延伸檢測(cè)反應(yīng)延伸反應(yīng)體系(ΙΟμΙ):包括5μ1 SNaPshot Multiplex Kit (ABI)，2 μ I 純化后多重PCR產(chǎn)物，1μ I延伸引物混合物(見圖1)，2μ I超純水。PCR反應(yīng)程序96°C I分鐘，28個(gè)循環(huán)X (96 V 10秒，50 V 5秒，60 V 30秒);持
續(xù) 4。。。延伸產(chǎn)物純化，在10 μ I延伸產(chǎn)物中加入IU SAP酶，37°C溫浴I小時(shí)，然后75°C滅活15分鐘。延伸產(chǎn)物上ABI3130XL測(cè)序儀取O. 5μ I純化后的延伸產(chǎn)物，與O. 5 μ lLizl20SIZE STANDARD，加入 9 μ I H1-Di 混勻，95°C變性 5 分鐘后上 ABI3130XL 測(cè)序儀；ABI3130XL測(cè)序儀上收集的原始數(shù)據(jù)用 GeneMapper 4. O (AppliedBiosystems Co. , Ltd. , USA)分析。五、相關(guān)性分析根據(jù)急性排斥反應(yīng)發(fā)生與否，將回顧性研究中入組的299名患者分成急排發(fā)生與未發(fā)生2組。列聯(lián)表形式，卡方檢驗(yàn)方法對(duì)各組中原發(fā)病、B7-H3以及TLT-2基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性分布進(jìn)行分析。圖2的結(jié)果顯示B7-H3基因rs2127015位點(diǎn)和TLT-2基因rs6915083和rs7754593位點(diǎn)與急性排斥相關(guān)性密切，P值均小于O. 05，統(tǒng)計(jì)具有顯著性意義。比值比(OR，odd ratio)提示B7-H3基因rs2127015位點(diǎn)T等位基因攜帶者以及TLT-2基因 rs6915083和rs7754593位點(diǎn)G等位基因攜帶者為急性排斥高風(fēng)險(xiǎn)患者。圖3、圖4表明，B7-H3及TLT-2基因各SNP位點(diǎn)間能夠形成單倍型，但各單倍型與急性排斥風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。圖5提示HBV感染與急性排斥相關(guān)，P值小于O. 05，具有顯著性差異；比值比結(jié)果乙肝感染患者發(fā)生急性排斥的風(fēng)險(xiǎn)更高。而后采用多因素分析方法對(duì)以上4個(gè)因子再次進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示僅HBV感染以及B7-H3基因的SNP位點(diǎn)rs2127015的多態(tài)性可作為肝移植后急性排斥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而TLT-2基因的rs6915083和rs7754593則未能通過統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。六、模型構(gòu)建卡方檢測(cè)表明受者的乙肝感染以及B7-H3基因rs2127015的T/T和C/T基因型都增加了受者術(shù)后急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，因此設(shè)定高風(fēng)險(xiǎn)因子為I (即乙肝感染和T/T、C/T基因型)，而低風(fēng)險(xiǎn)因子為O (即未感染乙肝和C/C基因型)，采用ROC回歸分析可建立模型，急性排斥風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)=-1. 122+1.493XB+0. 817XC(其中，當(dāng)所述基因型為T/T和C/T時(shí)，B =1，當(dāng)所述基因型為C/C時(shí)，B = O ;如受者已感染HBV，C = 1，如受者未感染，C = O)。繼而采用AUROC方法分析，確定該模型對(duì)急性排斥發(fā)生預(yù)測(cè)的敏感性和特異性分別為69. 8%和54. 7% (如圖6所示)。根據(jù)模型對(duì)各受者急排風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)分，所有受者可以為3組(大于I分、I分到O分和小于O分)，即高、中、低風(fēng)險(xiǎn)組。其中高、中風(fēng)險(xiǎn)組的急排發(fā)生率為20. 8%和11. 2 %，而低風(fēng)險(xiǎn)組的急排發(fā)生率僅為4. 3 %。七、模型前瞻性驗(yàn)證募集89例2010至2011年間行肝移植手術(shù)的患者，根據(jù)其乙肝感染及B7-H3基因rs2127015位點(diǎn)多態(tài)性計(jì)算各個(gè)患者的急性排斥風(fēng)險(xiǎn)分值并依據(jù)得分分組，而后對(duì)89位患者進(jìn)行至少6個(gè)月的隨訪，明確受者急性排斥發(fā)生情況。最后發(fā)現(xiàn)高中低風(fēng)險(xiǎn)組受者發(fā)生急性排斥的風(fēng)險(xiǎn)分別為17. 0%,9. 5%以及4. 8%。以上結(jié)果表明利用該模型能夠較好得預(yù)測(cè)急性排斥發(fā)生，該模型便于臨床工作者對(duì)移植受者采用個(gè)體化免疫治療方案。
權(quán)利要求
1.一種預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的引物，包括一對(duì)PCR擴(kuò)增引物和用于對(duì)擴(kuò)增片段測(cè)序的延伸引物 其中PCR擴(kuò)增引物包括 正向引物GGGAAATAACCAGTITTATggggaaga ； 反向引物=TGCATTTTCAAAACCCCagtga ； 其中延伸引物為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGATCGATAATCTTGT TCTTAATCC。
2.一種預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括 (1)檢測(cè)受者B7-H3基因單堿基突變位點(diǎn)rs2127015的基因型； (2)檢測(cè)受者是否感染HBV； (3)計(jì)算受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)A;A = -1. 122+1. 493XB+0. 817XC 其中，當(dāng)所述基因型為T/T和C/T時(shí)，B = 1，當(dāng)所述基因型為C/C時(shí)，B = O ;如受者已感染HBV，C = 1，如受者未感染，C = O。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(I)為 (a)從受者外周血中提取基因組DNA; (b)以基因組DNA為模板，利用引物對(duì)a進(jìn)行PCR擴(kuò)增，收集擴(kuò)增產(chǎn)物； (c)利用延伸引物b對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確定B7-H3基因單堿基突變位點(diǎn)rs2127015的基因型； 引物對(duì) a 的正向引物為=GGGAAATAACCAGTTTTATggggaaga ； 引物對(duì)a的反向引物為=TGCATTTTCAAAACCCCagtga ； 延伸引物b為TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACAGATCGATAATCTTGT TCTTAATCC。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測(cè)肝移植術(shù)后受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的引物即方法，引物包括一對(duì)PCR擴(kuò)增引物和用于對(duì)擴(kuò)增片段測(cè)序的延伸引物，分別如SEQ ID NO.13～15所示，該方法包括(1)檢測(cè)受者B7-H3基因單堿基突變位點(diǎn)rs2127015的基因型；(2)檢測(cè)受者是否感染HBV；(3)計(jì)算受者急性排斥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)指數(shù)A；A＝-1.122+1.493×B+0.817×C。本發(fā)明方法操作簡單，預(yù)測(cè)受者發(fā)生急性排斥的型敏感性達(dá)為69.8％，特異性未54.7％。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103014162SQ20121054361
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者余曉波, 周琳, 謝海洋, 鄭樹森 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院