大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，尤其涉及一種大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002]根據(jù)WHO統(tǒng)計:全球有6.5億感染各種肝病患者，最新統(tǒng)計每年約有200萬人死于各種肝病。我國急慢性肝功能衰竭十分常見，據(jù)統(tǒng)計國內(nèi)每年此類患者達(dá)30萬。病死率高達(dá)80%。目前治療肝衰竭方法主要有:(I)內(nèi)科治療。(2)肝臟移植治療。(3)人工肝治療。而內(nèi)科治療效果不佳，外科治療中肝臟移植手術(shù)是目前公認(rèn)的最為有效的治療方法，但由于供體缺乏、技術(shù)難度高等原因，極大地限制了肝移植手術(shù)的廣泛開展，絕大部分病人在等待肝移植的過程中死亡。生物人工肝具有肝細(xì)胞解毒、轉(zhuǎn)化、合成等功能，可代替肝臟大部分功能。生物反應(yīng)器是整個生物人工肝的核心部分，其性能將直接關(guān)系到生物人工肝的支持效果。理想的生物人工肝生物反應(yīng)器應(yīng)達(dá)到如下標(biāo)準(zhǔn):(I)細(xì)胞密度達(dá)IXlO8 1(]個細(xì)胞/ml水平；(2)反應(yīng)裝置能根據(jù)需要任意增容，細(xì)胞培養(yǎng)量可達(dá)數(shù)升；(3)實現(xiàn)有效的營養(yǎng)物質(zhì)、氧氣及代謝產(chǎn)物雙向物質(zhì)傳輸，盡可能模擬肝細(xì)胞在體內(nèi)的微環(huán)境；(4)可進(jìn)行自動化在線細(xì)胞狀態(tài)、培養(yǎng)液PH值、氧濃度等方面檢測和調(diào)節(jié)功能，以便于醫(yī)護(hù)人員的監(jiān)督和操作；(5)肝細(xì)胞代謝功能至少達(dá)單層培養(yǎng)的水平，并至少保持2周以上；(6)便于凍存、運輸和裝配。
[0003]目前生物人工肝發(fā)展的核心問題是設(shè)計最佳的新型生物反應(yīng)器，實現(xiàn)體外肝細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)及其培養(yǎng)過程中肝細(xì)胞功能與活率的有效維持，同時能夠滿足臨床應(yīng)用的需要。目前國內(nèi)外在生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)上，至今為止可以分為以下4大類:
[0004]1、單層培養(yǎng)/平板式的生物反應(yīng)器:該類反應(yīng)器是將肝細(xì)胞直接種植于平板上，使得表面積與體積之比下降，反應(yīng)器細(xì)胞為單層培養(yǎng)，不能長期有效存活并保持功能與活性，且不易放大，無法達(dá)到臨床要求。
[0005]2、中空纖維型生物反應(yīng)器:目前該反應(yīng)器的研究上也取得了如下一些進(jìn)展:1)整合獨立的管道氧供系統(tǒng)，如混合型LSS-MELS系統(tǒng)；2)尋找新的膜材料或?qū)ΜF(xiàn)有的膜材料進(jìn)行改進(jìn)；3)在進(jìn)行肝細(xì)胞生物治療的基礎(chǔ)上整合增加活性炭等物理解毒治療，如LIVERaid系統(tǒng)；4)運用新的培養(yǎng)模式，如LSS系統(tǒng)通過共培養(yǎng)方式提高肝細(xì)胞的活性與功能。但該反應(yīng)器仍存在以下問題:(I)容積有限，細(xì)胞裝載量小，培養(yǎng)液與肝細(xì)胞交換面積有限，不利于體外規(guī)模化擴增；(2)半透膜的側(cè)孔易被細(xì)胞團堵塞，影響交換效率，亦不利于肝細(xì)胞的功能與活力的長期有效維持。
[0006]3、灌注床/支架生物反應(yīng)器:該反應(yīng)器是通過攪拌來使細(xì)胞及支架材料達(dá)到懸浮狀態(tài)，這種生物反應(yīng)器機械攪拌會產(chǎn)生一定剪切力，容易對細(xì)胞造成較大程度上的損傷，因而限制了其進(jìn)一步的運用。
[0007]4、包被懸浮生物反應(yīng)器:該生物反應(yīng)器是將肝細(xì)胞用一種半透膜材料包裹，制成多孔微囊，然后進(jìn)行灌注培養(yǎng).其缺點是由于半透膜的存在以及肝細(xì)胞間的相互聚集，導(dǎo)致囊內(nèi)外物質(zhì)能量的交換受限。肝細(xì)胞為貼壁依賴性細(xì)胞，如失去對支架材料的貼附，可促發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0008]縱觀以上現(xiàn)有技術(shù)，其一般存在反應(yīng)器物質(zhì)交換效率低下以及管路結(jié)構(gòu)繁雜等技術(shù)問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種增加反應(yīng)器物質(zhì)交換效率的、管路結(jié)構(gòu)簡潔的大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)，
[0010]為達(dá)到以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
[0011]—種大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)，其包括為動物細(xì)胞提供生長場所的細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器、為所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器提供氧氣的供氧器、儲存培養(yǎng)基的儲液瓶、用于驅(qū)動所述培養(yǎng)基在該系統(tǒng)內(nèi)流動的蠕動栗，以及將所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器、供氧器、儲液瓶、蠕動栗導(dǎo)通連接的循環(huán)管路；所述循環(huán)管路包括:第一分管路和第二分管路，其分別設(shè)有兩個夾管閥和開設(shè)在該兩個夾管閥之間的第一接口和第二接口 ；所述兩個分管路的左端相互連接形成第三接口 ；所述兩個分管路的右端相互連接形成第四接口 ；第三分管路，其左端和右端分別與所述第一接口和第二接口連接，并且所述第三分管路將所述供氧器、儲液瓶及蠕動栗串接起來；連接所述第一接口和細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器的第四分管路；以及連接所述第二接口和細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器的第五分管路。
[0012]對應(yīng)地，所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器設(shè)有分別與所述第四分管路和第五分管路連接的第一端口和第二端口。
[0013]優(yōu)選地，所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器為微載體生物反應(yīng)器。
[0014]進(jìn)一步地，該系統(tǒng)還包括在線檢測器；所述循環(huán)管路還包括以三通閥連接在所述第三分管路上的并且與所述在線監(jiān)測器串接的第六分管路。
[0015]更進(jìn)一步地，該系統(tǒng)還包括借助所述第三分管路而串接在所述蠕動栗與儲液瓶之間的加熱盤。
[0016]優(yōu)選地，所述供氧器為膜式氧合器。
[0017]為實現(xiàn)自動化，該系統(tǒng)還包括調(diào)節(jié)該系統(tǒng)中影響細(xì)胞培養(yǎng)條件的各組成部分的控制參數(shù)的總控制器。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢:
[0019](I)本發(fā)明的大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)，由蠕動栗提供循環(huán)動力，通過合理設(shè)計循環(huán)管路以及利用兩對夾管閥交替開放和關(guān)閉來控制液體(培養(yǎng)基)進(jìn)入反應(yīng)器罐體的方向，培養(yǎng)基的周期性雙向灌注可以防止反應(yīng)器罐體細(xì)胞代謝產(chǎn)物在一處堆積，以及避免發(fā)生灌注入口細(xì)胞供氧良好而罐體出口細(xì)胞缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)的情況，有效消滅培養(yǎng)死腔形成；
[0020](2)本發(fā)明的大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)，采用在外科手術(shù)中廣泛使用的膜式氧合器來作為供氧器，有效改善了動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中的氣體交換情況，有助于提高動物細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量；
[0021](3)本發(fā)明的大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)，設(shè)有在線檢測器，用于檢測培養(yǎng)基的PH和溶解氧含量，可以實時了解生物反應(yīng)器內(nèi)的微環(huán)境，可以及時根據(jù)監(jiān)測的數(shù)值對反應(yīng)器參數(shù)作出調(diào)節(jié)而改善反應(yīng)器罐體內(nèi)微環(huán)境，也可以避免因取樣檢測而發(fā)生污染；
[0022](4)本發(fā)明的大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)，對動物細(xì)胞采用微載體培養(yǎng)技術(shù)，把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼具兩者的優(yōu)點。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖，示出當(dāng)?shù)谝粖A管閥和第四夾管閥打開、第二夾管閥和第三夾管閥關(guān)閉時該系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)基的流動方向。
[0024]圖2為本發(fā)明大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖，示出當(dāng)?shù)谝粖A管閥和第四夾管閥關(guān)閉、第二夾管閥和第三夾管閥打開時該系統(tǒng)內(nèi)培養(yǎng)基的流動方向。
[0025]圖3為采用本發(fā)明大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)所培養(yǎng)的人肝細(xì)胞的生長情況。
【具體實施方式】
[0026]以下結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0027]參考圖1，本發(fā)明的大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)包括細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器1、儲液瓶2、加熱盤3、蠕動栗4、供氧器5、在線檢測器6以及將上述各個部件有序?qū)ㄟB接的循環(huán)管路7。本實施例中，上述各部件的連接順序依次為細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器I一一儲液瓶2一一加熱盤3—一蠕動栗4一一供氧器5—一細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器1，上述連接形成本系統(tǒng)的主循環(huán)管路；進(jìn)一步地，所述在線檢測器6并聯(lián)連接在所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器I和儲液瓶2之間。
[0028]具體地，所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器I是動物細(xì)胞的生長場所，培養(yǎng)過程完成后可以從該細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器I中收獲動物細(xì)胞或者動物細(xì)胞的目標(biāo)代謝物。針對動物細(xì)胞的生長特點，所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器I優(yōu)選采用微載體生物反應(yīng)器；進(jìn)一步地，針對人肝細(xì)胞C3A的培養(yǎng)，可以采用Cytodex3微載體。為優(yōu)化動物細(xì)胞的培養(yǎng)微環(huán)境，所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器I的罐體的上下兩側(cè)分別開設(shè)用于灌注培養(yǎng)基的第一端口 11和第二端口 12。
[0029]所述儲液瓶2用于儲存新鮮的液體培養(yǎng)基，該儲液瓶2的瓶口設(shè)有雙孔瓶塞，所述瓶塞的兩孔分別連接用于流入或流出液體培養(yǎng)基的管道。
[0030]所述加熱盤3為電致發(fā)熱器件，該加熱盤3會對流經(jīng)該加熱盤3的液體培養(yǎng)基進(jìn)行加熱，以滿足動物細(xì)胞在體外擴增中對溫度的要求。
[0031]所述蠕動栗4為在所述培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)內(nèi)流動的液體培養(yǎng)基提供流動的驅(qū)動力，可以利用對應(yīng)的控制裝置調(diào)節(jié)該蠕動栗4的流速等影響液體培養(yǎng)基循環(huán)的參數(shù)。
[0032]所述供氧器5為所述細(xì)胞工廠細(xì)胞反應(yīng)器I提供動物細(xì)胞體外擴增所需的氧氣，所述“氧氣”并不是純氧，而是5%的二氧化碳和95%氧氣的混合氣，據(jù)此，采用在外科手術(shù)中廣泛使用的膜式氧合器來作為所述供氧器5，可以優(yōu)化液體培養(yǎng)基的氣體交換過程，保證液體培養(yǎng)基的氧含量滿足動物細(xì)胞體外擴增的要求。
[0033]所述在線檢測器6通過一個三通閥761與該系統(tǒng)的主循環(huán)管路并聯(lián)連接，用于根據(jù)需要在線檢測培養(yǎng)基的PH值和溶解氧的含量，檢測所得的實時數(shù)據(jù)用于指導(dǎo)該培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)的其他器件的參數(shù)的調(diào)節(jié)。
[0034]所述循環(huán)管路7包括第一分管路71、第二分管路72、第三分管路73、第四分管路74、第五分管路75和第六分管路76。其中，所述第一分管路71上設(shè)有第一夾管閥712和第二夾管閥713，并且在所述兩個夾管閥之間的管路上開設(shè)第一接口 711 ;所述第二分管路72上設(shè)有第三夾管閥722和第四夾管閥723，并且在所述兩個夾管閥之間的管路上開設(shè)第二接口 721 ;進(jìn)一步地，所述第一分管路71的左端和第二分管路72的左端相互連接形成第三接口 731，所述第一分管路71的右端和第二分管路72的右端相互連接形成第四接口 732 ;所述第三分管路73的左端與所述第三接口 731連接，該第三分管路73的右端與所述第四接口 732連接，并且該第三分管路73將所述儲液瓶2、加熱盤3、蠕動栗4和氧合器5串接；所述第四分管路74—端與所述第一接口 711連接，另一端通過所述第一端口 11與所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器I連接；所述第五分管路75的一端與所述第二接口 721連接，另一端通過所述第二端口 12與所述細(xì)胞工廠生物反應(yīng)器I連接；所述第六分管路76的一端通過三通閥761與所述第三分管路73連接，另一端連接所述在線檢測器6。
[0035]進(jìn)一步地，所述第一夾管閥712、第二夾管閥713、第三夾管閥722和第四夾管閥723的開、閉狀態(tài)影響了該培養(yǎng)動物細(xì)胞的系統(tǒng)中液體培養(yǎng)基的流動方向，具體情況如下:
[0036](I)如圖1所示，假設(shè)所述蠕動栗4驅(qū)動液體培養(yǎng)基向左流動，所述第一夾管閥712和第四夾管閥723處于打開的狀態(tài)，所述第二夾管閥713和第三夾管閥722處于關(guān)閉的狀態(tài)；該系統(tǒng)中的液體培養(yǎng)基從所述儲液瓶2從左側(cè)流出，沿所述第三分管路73依次經(jīng)過所述