專利名稱：一種乙型腦炎疫苗的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙型腦炎疫苗的純化方法，具體涉及一種利用分子篩層析和離子交換膜層析純化滅活病毒乙型腦炎疫苗的方法。
背景技術(shù)：
用現(xiàn)代生物技術(shù)改造傳統(tǒng)疫苗產(chǎn)品，提高傳統(tǒng)疫苗的安全性、保護效果并使疫苗生產(chǎn)過程的控制和產(chǎn)品質(zhì)量的控制完全達到現(xiàn)代制藥管理要求是國家重點支持的高新技術(shù)的發(fā)展方向(《高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)化“十一五”規(guī)劃》國家發(fā)展與改革委員會)。采用以大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)技術(shù)、大規(guī)模層析純化技術(shù)和新型制劑技術(shù)為核心的疫苗生產(chǎn)工藝是實現(xiàn)該目標的主要途徑。然而，這些新技術(shù)還有待于進一步發(fā)展。以純化技術(shù)為例，由于新疫苗生產(chǎn)工藝的基礎(chǔ)是傳代細胞，如何去除產(chǎn)品中的殘留DNA是疫苗安全性的重要因素，也是國家疫苗質(zhì)量標準的關(guān)鍵指標。現(xiàn)有的滅活病毒乙型腦炎疫苗的純化工藝流程一般是將病毒培養(yǎng)液通過過濾或者離心沉淀澄清后，經(jīng)超濾濃縮至一定體積，再加入一定濃度的甲醛或者β-丙內(nèi)酯滅活得到滅活病毒濃縮液，然后進一步提純抗原活性組分；或者是將病毒培養(yǎng)液通過過濾或者離心沉淀澄清后，首先加入一定濃度的甲醛或者β-丙內(nèi)酯滅活病毒，經(jīng)超濾濃縮至一定體積，然后進一步提純抗原活性組分。其中，獲得滅活的病毒濃縮液的工藝比較通用，而對滅活的病毒濃縮液進一步提純的方法卻有多種方法方法一向滅活的病毒濃縮液加入硫酸魚精蛋白后離心沉淀去除DNA，然后采用蔗糖密度梯度區(qū)帶離心方法進行提純；方法二 滅活的病毒濃縮液經(jīng)硫酸魚精蛋白沉淀后離心去除DNA，采用一種或多種分子篩層析柱一次或多次層析進行提純；方法三將滅活的病毒濃縮液經(jīng)蔗糖密度梯度區(qū)帶離心后，經(jīng)一步或多步離子交換柱去除DNA;方法四滅活的病毒濃縮液經(jīng)分子篩層析后，再采用離子交換柱進一步提純抗原。由此可見，傳統(tǒng)的生產(chǎn)提純的乙腦疫苗多采用超速離心技術(shù)進行純化，但由于超速離心設(shè)備昂貴，不易保養(yǎng)維修，一旦出現(xiàn)故障，問題往往比較嚴重，操作繁瑣，且不易保持無菌，在設(shè)備與人力的投入上都大大超過了使用層析技術(shù)所需的投入，不適于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。采用超速離心法提純抗原在純化效果上也無法有效地去除與病毒性質(zhì)相近的 DNA，而DNA含量又是影響產(chǎn)品安全性的一個重要因素。單步分子篩法是指得到滅活病毒濃縮液后，通過一種或多種分子篩填料進行層析提純。這種方法僅僅通過分子量大小不同的單一原理來分離雜質(zhì)，只能分開不同分子量的物質(zhì)，而對于相近分子量的物質(zhì)就算經(jīng)過更長的層析路徑也無法分離，對于與抗原分子量相近的雜質(zhì)，特別是DNA無法做到有效的去除。而且為了追求一步實現(xiàn)更高的蛋白去除率需要將抗原通過更長的層析路徑，病毒表面的蛋白難免受到破壞，降低了抗原的免疫原性，而為了保障足夠的效力，每次則需要加入更高含量的抗原，結(jié)果造成接種時出現(xiàn)更高概率的不良反應(yīng)。
傳統(tǒng)的離子交換層析采用離子交換填料作為柱層析介質(zhì)，而離子交換填料是在瓊脂糖或葡聚糖等顆粒的骨架上連接陽離子或者陰離子等基團，90%的基團是位于填料顆粒內(nèi)部，在分離純化例如病毒等大分子物質(zhì)時，大分子物質(zhì)無法進入顆粒膠的小孔內(nèi)，無法與孔內(nèi)的基團結(jié)合，造成了傳統(tǒng)填料載量無法滿足層析工藝的要求或者造成了 90%以上的浪費。因此，進一步探索滅活病毒乙型腦炎疫苗的純化方法具有重要的實際意義。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在提供一種改進的乙型腦炎疫苗的純化方法，該純化方法將分子篩層析和離子交換膜層析技術(shù)相結(jié)合對滅活的病毒濃縮液進行純化，能夠在保護疫苗的免疫原性的基礎(chǔ)上有效地去除雜質(zhì)，尤其是對產(chǎn)品安全性有重要影響的DNA，同時縮短了乙型腦炎疫苗的純化時間，降低了生產(chǎn)成本。用于實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種乙型腦炎疫苗的純化方法，該純化方法包括以下步驟(1)將滅活的乙型腦炎病毒濃縮液經(jīng)聚丙烯葡聚糖分子篩柱層析，洗脫溶劑為pH 為7. 5 8. 5的磷酸緩沖液，紫外檢測器波長^Onm處檢測；(2)收集第一洗脫峰，以帶有季銨陽離子的醋酸纖維素膜進行離子交換層析膜層析，采用線性洗脫且洗脫溶劑由體積比為緩沖液A 緩沖液B = O 100%勻速變化至緩沖液A 緩沖液B = 100% 0，其中緩沖液A為pH7. 5 8. 5的磷酸緩沖液，緩沖液B為包含500mM/L氯化鈉的pH 7. 5 8. 0的磷酸緩沖液，洗脫速度為200 600厘米/小時；(3)收集NaCl濃度為70 250mM之間的洗脫液。在上述純化方法中，優(yōu)選地，滅活的乙型腦炎病毒濃縮液的濃度為5 30mg/ml。 優(yōu)選地，分子篩柱層析之前以2倍柱體積的洗脫溶劑平衡層析柱。優(yōu)選地，分子篩柱層析的柱高為20 60厘米。優(yōu)選地，分子篩柱層析的上樣體積為柱體積的8 12%。優(yōu)選地，分子篩柱層析的洗脫溶劑的流速為20 50厘米/小時。在上述純化方法中，優(yōu)選地，離子交換層析膜層析之前以10倍柱體積的緩沖液A 平衡層析膜。優(yōu)選地，離子交換層析膜層析的上樣量為0.2 lml/cm2。優(yōu)選地，離子交換層析膜層析的孔徑為3 10 μ m。將滅活的病毒濃縮液經(jīng)過兩步層析，即分子篩層析后再經(jīng)離子交換層析可有效去除病毒培養(yǎng)液中的雜質(zhì)，特別是DNA、小牛血清及殘留的宿主蛋白等物質(zhì)。由于加入離子交換層析提純這一步驟，可大大減輕分子篩層析的壓力，有效保障了抗原的免疫原性，只需要很低含量的抗原即可達到足夠的效力，大大降低了接種的副反應(yīng)。更重要的是，本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)與離子交換柱層析相比，離子交換層析膜為微孔膜結(jié)構(gòu)，其孔徑(>3μπι)遠遠大于傳統(tǒng)層析膠骨架結(jié)構(gòu)，在進行大分子分離時能充分利用孔內(nèi)的功能基團。由于在大分子物質(zhì)上動態(tài)載量上的巨大區(qū)別，為了完成相同量的樣品的純化，柱層析需要的柱床體積是膜層析的多倍。在層析流速方面，傳統(tǒng)顆粒膠只能耐受較低的流速，而層析膜為大孔膜結(jié)構(gòu)， 可實現(xiàn)極高的流速。更大的柱床體積與較小的流速使得在工業(yè)生產(chǎn)中柱層析所需的硬件投資、耗材投資、人力成本及時間成本都大大超過了膜層析。為此，本發(fā)明經(jīng)過大量地實驗篩選，確定了用于上述分子篩層析和離子交換層析膜層析的操作條件，從而保障實現(xiàn)上述分子篩層析和離子交換層析膜層析相結(jié)合所產(chǎn)生的技術(shù)效果。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。實施例11、VERO種子細胞的復蘇1. 1VER0細胞株的來源VERO細胞的原始來源為ATCC (編號為F-12313)，經(jīng)傳代擴增建立了主細胞庫和工作細胞庫，并保存于液氮中。主細胞為1 代，工作細胞為133代，凍存密度為4X106/ml。1. 2VERO種子細胞的復蘇取液氮罐內(nèi)保存工作庫細胞一支，39°C溫水迅速融化后，將細胞懸液按約IXlO5/ cm2接種密度轉(zhuǎn)入175cm2方瓶中，逐步滴加培養(yǎng)基(含10% (體積/體積)胎牛血清的M199 培養(yǎng)基(M199干粉培養(yǎng)基組成成分見GIBCO培養(yǎng)基手冊)至60mL，37°C和5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。2、在175cm2方瓶中培養(yǎng)一級種子細胞復蘇的細胞培養(yǎng)3 4天后生長至致密單層，使用0.25% (g/ml)胰酶消化液消化分散，再以1 4(體積/體積)的接種比例將細胞懸液分到新培養(yǎng)基中，加入適當量的培養(yǎng)液(601111)，371、5(%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 4天后以1 4(體積/體積)比例再放大培
養(yǎng)一次。3、在2L轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)二級種子細胞3. 1培養(yǎng)基M199 培養(yǎng)基 9. 55g/L,NaHCO3 1. 8g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (體積/體積)胎牛血清。3. 2轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)選擇2L轉(zhuǎn)瓶和四層轉(zhuǎn)瓶機，保持接種密度為1.0 2.0X105/cm2，加入500 600ml的培養(yǎng)基，設(shè)置溫度為37°C，轉(zhuǎn)速為1/8轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)3 4天。4、在14L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)三級種子細胞4. 1培養(yǎng)液M199 培養(yǎng)基 9. 55g/L,NaHCO3 2. 2g/L，葡萄糖 1. 5g/L，谷氨酰胺 0. 2g/L，10% (體積/體積)胎牛血清。4. 2反應(yīng)器選擇選擇NBS或Sartorius哺乳動物細胞培養(yǎng)罐，罐體積為14L，工作體積為10L。4. 3微載體選擇Cytodex 1 微載體(GE 公司)，用量為 5. Og/L。4. 4上罐接種將轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)3 4天的VERO細胞經(jīng)消化后，轉(zhuǎn)移至藍蓋瓶中，吹打分散均勻，一并接入14L生物反應(yīng)器，添加培養(yǎng)基至10L。4. 5參數(shù)控制
攪拌轉(zhuǎn)速35-40RPM ；pH :7. 2 7. 4 ；溶解氧量(DO) :40-50 %飽和度；溫度 36. 5 37. 5°C。4. 6灌流控制接種12小時后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5 6天。5、在75L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)四級種子細胞5. 1 培養(yǎng)基同 4. 1.5. 2反應(yīng)器選擇選擇NBS或Sartorius哺乳動物細胞培養(yǎng)罐，罐體積為75L，工作體積為50L。5. 3微載體的使用方法及用量同4. 35. 4轉(zhuǎn)罐接種將14L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)5-6天的細胞用0. 25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，攪拌振蕩分散均勻，用胰酶抑制劑(Gibco)終止反應(yīng)后，通過管道將細胞連同微載體一并轉(zhuǎn)入75L生物反應(yīng)器，定容至50L。5. 5參數(shù)控制攪拌轉(zhuǎn)速35 40RPM ；pH :7. 2-7. 4 ；溶解氧量(DO) :40 50%飽和度；溫度 36. 5-37. 5 °C,5. 6灌流控制接種12小時后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5-6天。6、在300L生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)VERO細胞和制備病毒液6. 1培養(yǎng)基和維持液配方培養(yǎng)基同4. 1.維持液:M199培養(yǎng)基 9. 55g/L，NaHC032. 2g/L，蔗糖 1. Og/L，人血白蛋白 0. lg/L。6. 2反應(yīng)器選擇選擇比歐或Sartorius哺乳動物細胞培養(yǎng)罐，罐體積為300L，工作體積為210L。6. 3微載體用量同4. 36. 4 轉(zhuǎn)罐將75L生物反應(yīng)器中培養(yǎng)5 6天的細胞用0.25% (g/ml)胰酶消化液(含0. 01% (g/ml)的EDTA)罐外消化，攪拌振蕩分散均勻，用胰酶抑制劑(Gibco)終止反應(yīng)后，通過管道將細胞連同微載體一并轉(zhuǎn)入300L生物反應(yīng)器，定容至210L。6. 5培養(yǎng)參數(shù)同4. 5。6. 6灌流控制接種M小時后開啟灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，培養(yǎng)5 6天。7、接種乙腦P3株病毒培養(yǎng)7.1接毒方法暫?？刂茀?shù)，沉降微載體和細胞，抽掉上清培養(yǎng)液，更換為維持液，待參數(shù)穩(wěn)定后按照MOI為0.01接種病毒。7. 2參數(shù)控制攪拌轉(zhuǎn)速35 40RPM ；pH :7. 5 7. 6 ；溶解氧量(DO) :40 50%飽和度；溫度 33. 5 34. 5 0C
7. 3以連續(xù)灌流方式收獲病毒培養(yǎng)液接毒12小時后開始灌流，灌流量為每天1. 5工作體積，從接毒48小時起開始收獲病毒液，連續(xù)收獲8天。8、病毒收獲液的澄清過濾和超濾濃縮8. 1澄清過濾選擇膜面積為1平方米(20英寸)的Iym和0.5μπι的聚醚砜濾芯串聯(lián)，先經(jīng)Ιμπι 的濾膜再經(jīng)0. 45 μ m的濾膜過濾。8. 2超濾濃縮8. 2.1緩沖液選擇選擇pH7. 2-8. 0無菌磷酸緩沖液沖洗平衡好超濾系統(tǒng)。8. 2. 2設(shè)備選擇使用Millipore公司的0. 5平方米PELLIC0N 2超濾系統(tǒng)，安裝2塊PELLIC0N 2 超濾膜包，截留分子量為300KD濾膜。8. 2. 3操作參數(shù)設(shè)定進液口壓力為10 20psi，回流口壓力為5 10psi，2 4小時內(nèi)完成80 120L病毒液的收獲；樣品濃縮20 40倍，得到2 6L濃縮液。9、病毒滅活9. 1滅活試劑的準備先將β -丙內(nèi)酯用注射用水稀釋成40倍的母液，再經(jīng)0. 22 μ m膜過濾除菌。9. 2滅活操作將預稀釋的β-丙內(nèi)酯母液加入濃縮液中至終濃度為1/4000，2 8°C下放置滅活，24小時后在37°C下水解2小時。10、分子篩層析10. 1緩沖液選擇pH 7. 5 8. 5磷酸緩沖液。10. 2填料選擇GE公司的S^hacryl S-300層析填料，裝柱高度為20 60cm。10. 3層析操作首先使用2倍柱體積的緩沖液平衡層析柱，流速為20 50cm/小時，上樣樣品體積為8% -12%柱體積，收獲第一峰(波長280nm，紫外檢測器)。11、離子交換膜層析11. 1緩沖液的選擇緩沖液A:pH 7. 5 8. 5磷酸緩沖液，緩沖液B :pH 7. 5 8. 0磷酸緩沖液加 500mMol/L 氯化鈉。11. 2離子交換膜的選擇Sartorius公司的Sartobind Q離子交換層析膜11. 3層析操作先用10倍體積緩沖液A平衡層析膜，上樣經(jīng)分子篩層析純化后的抗原樣品，用緩沖液A (體積比為100% 0% )和緩沖液B (體積比為0% 100% )形成線性梯度洗脫，收集NaCl濃度為70mM至250mM之間的洗脫液為純化后原液；12、鋁佐劑原位吸附抗原方法12. 1試劑準備lmol/L 的 NaOH 溶液，lmol/L ρΗ8· 5 的磷酸鹽緩沖溶液，0. 2mol/L 的 AlCl3 溶液， lmol/L的NaCl溶液，過濾除菌。12. 2吸附方法將純化后的抗原過濾除菌后，加入lmol/L pH8. 5磷酸鹽緩沖溶液使其磷酸鹽濃度為0. 05mol/L,然后攪拌加入lmol/L的NaOH溶液和0. 2mol/L的AlCl3溶液，反應(yīng)過程中保持體系PH為7. 0左右，反應(yīng)體系中的Al (OH)3量為2. 0 2. 5mg/ml時止。12. 3 稀釋用lmol/L的NaCl溶液和注射用水稀釋至補結(jié)抗原量為1 2 1 4，Al (OH)3 含量為 0. 5 0. 75mg/ml, NaCl 濃度為 0. 154mol/L。12. 4加入添加劑1% (g/ml)甘氨酸和5% (g/ml)蔗糖。12. 5半成品檢測無菌試驗。實施例2膜層析與柱層析的純化效果比較處理1000ml的分子篩層析純化后的抗原樣品，比較各批次的純化效果。根據(jù)以下結(jié)果可知，膜層析只需要70ml的柱床體積及30分鐘的層析時間，而柱層析需要560毫升的柱床體積及2個小時的層析時間。除了柱床體積和層析時間等的差別外，產(chǎn)品的純度也有很大區(qū)別，膜層析提純得到的抗原所含蛋白均不高于5yg每劑，DNA不高于10pg/ml，而柱層析提純得到的抗原所含蛋白在15 μ g每劑左右，DNA含量也只能達到< 100pg/ml的水平 (參見表9)。表9膜層析和柱層析的純化效果比較
權(quán)利要求
1.一種乙型腦炎疫苗的純化方法，該純化方法包括以下步驟(1)將滅活的乙型腦炎病毒濃縮液經(jīng)聚丙烯葡聚糖分子篩柱層析，洗脫溶劑為PH為 7. 5 8. 5的磷酸緩沖液，以紫外檢測器^Onm處檢測；(2)收集第一洗脫峰，以帶有季銨陽離子的醋酸纖維素膜進行離子交換層析膜層析， 采用線性洗脫且洗脫溶劑由體積比為緩沖液A 緩沖液B = 0 100%勻速變化至緩沖液 A 緩沖液B= 100% 0，其中緩沖液A為pH7. 5 8. 5的磷酸緩沖液，緩沖液B為包含 500mM/L氯化鈉的pH 7. 5 8. 0的磷酸緩沖液，洗脫速度為200 600厘米/小時；(3)收集NaCl濃度為70 250mM之間的洗脫液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，所述滅活的乙型腦炎病毒濃縮液的濃度為5 30mg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述分子篩柱層析之前以2倍柱體積的洗脫溶劑平衡層析柱。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述分子篩柱層析的柱高為 20 60厘米。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述分子篩柱層析的上樣體積為柱體積的8 12%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述分子篩柱層析的洗脫溶劑的流速為20 50厘米/小時。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述離子交換層析膜層析之前以10倍柱體積的緩沖液A平衡層析膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述離子交換層析膜層析的上樣量為0. 2 lml/cm2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項所述的方法，其特征在于，所述離子交換層析膜層析的孔徑為3 10 μ m。
全文摘要
本發(fā)明提供一種乙型腦炎疫苗的純化方法，該純化方法包括以下步驟將滅活的乙型腦炎病毒濃縮液經(jīng)聚丙烯葡聚糖分子篩柱層析，洗脫溶劑為pH為7.5～8.5的磷酸緩沖液，紫外檢測器波長280nm處檢測；收集第一洗脫峰，以帶有季胺陽離子的醋酸纖維素膜進行離子交換層析膜層析，采用線性洗脫且洗脫溶劑由體積比為緩沖液A∶緩沖液B＝0～100％勻速變化至緩沖液A∶緩沖液B＝100％～0，其中緩沖液A為pH為7.5～8.5的磷酸緩沖液，緩沖液B為包含500mM/L氯化鈉的pH 7.5～8.0的磷酸緩沖液，洗脫速度為200～600厘米/小時；收集NaCl濃度為70～250mM之間的洗脫液。該純化方法能夠在保護疫苗的免疫原性基礎(chǔ)上有效地去除雜質(zhì)，尤其是對產(chǎn)品安全性有重要影響的DNA，同時縮短了乙型腦炎疫苗的純化時間，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號A61P31/14GK102327608SQ20101026421
公開日2012年1月25日 申請日期2010年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者劉鈿蓮, 沈名鋒, 艾文 申請人:麗珠集團疫苗工程股份有限公司